葉綠素熒光動力學在植物抗逆性研究中的應用

魯 松

(四川省自然資源科學研究院，四川 成都 610015)

葉綠素熒光動力學技術(shù)在測定葉片光合作用過程中光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、耗散、分配等方面具有獨特的作用。與“表觀性”的氣體交換指標相比，葉綠素熒光參數(shù)更具有反映“內(nèi)在性”特點。因此，葉綠素熒光動力學技術(shù)被稱為測定葉片光合功能快速、無損傷的探針。本文簡要概述了葉綠素熒光動力學的基本原理及其在植物抗逆性實驗中的應用。

1 葉綠素熒光動力學的基本原理

將綠色植物含葉綠素的部分組織，如葉片、芽、嫩枝條、莖或單細胞藻類懸液放在暗處適應片刻，或用近紅外光預照射，然后在可見光下激發(fā)，并用熒光計檢測，結(jié)果就會發(fā)現(xiàn)植物綠色組織會發(fā)出一種微弱的暗紅色強度隨時間不斷變化的熒光信號，這種熒光信號絕大部分是來自葉綠體光系統(tǒng)II(PSII)的天線色素蛋白復合體中的葉綠素a 分子，這過程即為葉綠素熒光動力學。由于這個現(xiàn)象最早是由Kautsky 發(fā)現(xiàn)的［1］，因此，它有時也被稱為Kautsky效應。

經(jīng)暗適應的綠色植物樣品突然受到可見光照射時，其體內(nèi)葉綠素分子可在納秒(ns)級時間內(nèi)發(fā)出一定強度的熒光，此時的熒光稱為固定熒光(Fo)，然后熒光強度增加的速度減慢，因而在Fo 處形成拐點，接著以毫秒級速度形成一個緩臺階，數(shù)秒后熒光強度可達最高點，稱為“P”峰。若所用激發(fā)光強度達到或超過被測樣品光反應的光飽和點時，P 峰即趨于或等于最大熒光產(chǎn)量(Fm)，F(xiàn)m可反映通過PSII 的電子傳遞情況。熒光強度超過Fo 那一部分的熒光稱為可變熒光(Fv)。在P 峰之后，植物熒光通常經(jīng)1次～2次阻尼振蕩(稱較大蜂“M1”和“M2”)，才降到接近Fo 的穩(wěn)定的水平。熒光強度下降的過程現(xiàn)稱為熒光淬滅。體內(nèi)葉綠素熒光動力學有兩個顯著的特點:一是它可將植物發(fā)出的熒光區(qū)分為性質(zhì)上完全不同的兩個部分——固定熒光(Fo)部分和可變熒光(Fv)部分。固定熒光(Fo)代表不參與PSII 光化學反應的光能輻射部分，也稱初始熒光或基礎(chǔ)熒光，是光系統(tǒng)II (PSII)反應中心處于完全開放時的熒光產(chǎn)量，它與葉片葉綠素濃度有關(guān);可變熒光(Fv)代表可參與PSII 光化學反應的光能輻射部分。根據(jù)可變熒光(Fv)在總的最大熒光(Fm=Fv+Fo)中所占的比例(Fv/Fm)，即可簡便地得出植物PSII 原初光能轉(zhuǎn)換效率。Fv/Fm是PSII最大光化學量子產(chǎn)量，反映PSII 反應中心內(nèi)光能轉(zhuǎn)換效率或稱最大PSII 的光能轉(zhuǎn)換效率，在葉片暗適應20min 后測得，非脅迫條件下該參數(shù)的變化極小，不受物種和生長條件得影響，脅迫條件下該參數(shù)明顯下降。另一個特點是，熒光動力學是測定植物從暗中轉(zhuǎn)到光下，其光合作用功能從休止鈍化狀態(tài)轉(zhuǎn)為局部活化狀態(tài)，直到全部正常運轉(zhuǎn)狀態(tài)過程中的熒光動態(tài)變化，而它包含著十分豐富的光合信息，這遠不是一般靜態(tài)熒光測量所能比擬的。另外，如果葉片不經(jīng)過暗適應可在光下直接測定實際熒光產(chǎn)量，常用Fv ˊ/Fm ˊ表示PSII 有效光化學量子產(chǎn)量，它反映開放的PSII 反應中心原初光能捕獲效率;而(Fm ˊ-F)/Fm ˊ即PSII 實際光化學量子產(chǎn)量則反映PSII 反應中心在有部分關(guān)閉情況下的實際原初光能捕獲效率［2］。

在體內(nèi)葉綠素熒光動力學測定中，當樣品的葉綠素濃度和熒光計的激發(fā)光強恒定時，PSII 原初電子受體QA的氧還狀態(tài)是決定體內(nèi)葉綠素熒光強弱的主要因素。當植物經(jīng)一段時間暗適應，或用優(yōu)先為光系統(tǒng)I (PSI)所利用的長波光照射后，其體內(nèi)PSII 的QA和隨后的電子受體QB和PQ 庫等均完全失去電子而被氧化，這時PSII 反應中心可接受光電子，即處于“開放”狀態(tài)，這時熒光強度最弱，即為Fo，當植物被飽和光激發(fā)，使PSII 電子受體QA、QB和PQ 庫等完全被還原時，PSII 反應中心不再接受光電子，即處于“關(guān)閉”狀態(tài)，這時熒光強度最強，即為Fm。植物經(jīng)短暫照光達到“P”峰后，由于一些光合酶系逐漸被活化，使PSI 開始運轉(zhuǎn)，而將PSII 還原側(cè)的還原態(tài)的電子受體和PQH2等再氧化，從而引起熒光強度的淬滅，這稱為光化學淬滅(qP)。植物在光的持續(xù)照射下，緊接著光化學淬滅的增加，在光合膜的兩側(cè)逐漸建立起質(zhì)子梯度和形成膜高能態(tài)，它們也可造成熒光淬滅，這種淬滅稱為能量淬滅，或qE 淬滅［2］，另外，當激發(fā)能在PSI 和PSII 之間分配變化時，分配給光系統(tǒng)II 的激發(fā)能的量降低，這引起的淬滅稱為qT，與光合作用的光抑制(photoinhmition)有關(guān)的淬滅為qI，這三者造成的淬滅合稱非光化學淬滅(qN)。qP 淬滅因為是由等再氧化所造成，因而它與光合電子傳遞、光合放氧等過程直接相關(guān)，反映的PSII 天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞的份額，要保持較高的光化學淬滅就是要使PSII 反應中心處于“開放”狀態(tài)，所以光化學淬滅又在一定程度上反映了PSII 反應中心的開放程度，以光化學系數(shù)qP=(Fm' -Fs)/(Fm' -F0)表示，qP 愈大，QA—重新氧化形成QA的量愈大，即PSII 的電子傳遞活性越大。而qN 淬滅因為是由質(zhì)子梯度和膜高能態(tài)等所引起，因而它與ATP 的形成、積累以及與光合膜的狀態(tài)有關(guān)，它反映的是PSII 天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的光能部分。非光化學淬滅的計算有兩種表示方法［3］，NPQ=Fm/Fm' -1 或qN=1 -(Fm' -Fs)/(Fm -F0)=1 -Fv'/Fv。在植物受到環(huán)境脅迫時，PSII 天線色素吸收的過量光能如果不能及時耗散，將對光合結(jié)構(gòu)造成失活或破壞，所以非光合化學淬滅是一種自我保護機制［4］。

2 葉綠素熒光動力學在植物抗逆性研究中的應用

葉綠素a 熒光與光合作用各種反應緊密相關(guān)，任何逆境對光合作用某過程的影響都可通過葉綠素熒光誘導動力學反映出來。因此，葉綠素熒光誘導動力學對于研究逆境脅迫對植物的影響具有十分重要的意義。逆境脅迫對植物光合作用的影響是多方面的，不僅直接引發(fā)光合機構(gòu)的損傷，同時也影響光合電子傳遞及與暗反應有關(guān)的酶活性，利用葉綠素熒光動力學方法可以快速、靈敏、無損傷探測逆境對植物光合作用的影響。許多研究表明，逆境脅迫的輕重與Fm/Fo、Fv/Fm、qP、qN 的參數(shù)值被抑制的程度之間存在著正相關(guān)，F(xiàn)v/Fo、Fv/Fm 分別代表PSII的潛在活性和PSII 原初光能轉(zhuǎn)化效率，非光化學能量耗散易造成Fo 的降低，而光合機構(gòu)被破壞又使其升高，所以這些參數(shù)的變化趨勢可作為植物抗逆的指標。

2.1 光抑制

光抑制是指植物的光合機構(gòu)所接受的光能超過光合作用所能利用的能量時而引起的光合功能降低。目前，人們對光抑制的機理有兩種認識:其一，通過增強非輻射能量耗散來消耗過剩的光能，使光合機構(gòu)免受破壞(伴隨Fo 降低);其二，光合機構(gòu)的PSII 反應中心受到強光破壞(伴隨Fo 上升)。以前認為光抑制是PSII 傷害的同義詞，然而現(xiàn)在已證明光抑制也是一種光保護過程［5］，經(jīng)常用Fv/Fm 來檢測光抑制。當植物受到光抑制時，常伴隨Fv/Fm 的降低和非輻射能量耗散(熱耗散，qN)的增加。熱耗散在防御光破壞過程中起重要作用，與熱耗散密切相關(guān)的調(diào)節(jié)機制是植物體內(nèi)葉黃素循環(huán)。葉黃素循環(huán)存在于所有高等植物、蕨類、苔蘚和一些藻類的類囊體膜上。其過程是在抗壞血酸和NADPH2的參與下，紫黃質(zhì)(V)在幾分鐘內(nèi)通過環(huán)氧玉米黃質(zhì)(A)轉(zhuǎn)化為玉米黃質(zhì)(Z)，提高了玉米黃質(zhì)水平。而玉米黃質(zhì)的含量與熱耗散有密切的關(guān)系。自然條件下，隨著光強的增加，玉米黃質(zhì)的含量提高;當光強下降時，玉米黃質(zhì)向紫黃質(zhì)轉(zhuǎn)變。如果通過葉黃素循環(huán)的非輻射能量耗散仍不能完全消耗過量的過剩的光能時，剩余的這部分能量有可能形成單線態(tài)氧，從而對光合機構(gòu)造成危害。目前，對抑制異議較大是，光抑制是否伴隨著D1 蛋白的凈降解。一種觀點認為光抑制的原初位置是光系統(tǒng)Ⅱ的反應中心，此處D1 蛋白迅速被損傷發(fā)生降解;另一種觀點認為光抑制是PSII 本身而不是D1 蛋白［6］。

2.2 低、高溫脅迫

溫度是決定各種植物在地球上不同地區(qū)分布的一個重要因子，高、低溫脅迫是經(jīng)常造成作物減產(chǎn)和限制作物產(chǎn)量提高的一個主要因素。因此，在作物育種中選擇具有較強的抗寒或抗高溫的親本，并選育出具有較強的相應抗逆性的新品種，一直是人們追求的目標。

低溫脅迫對植物光合作用的影響是多方面的，不僅直接引發(fā)光合機構(gòu)的損傷，同時也影響光合電子傳遞和光合磷酸化以及暗反應的有關(guān)酶系。在低溫脅迫下，即使中低光強也會使植物發(fā)生光抑制，因此，低溫脅迫下qN 降低并且過剩光能主要依賴于葉黃素循環(huán)進行調(diào)節(jié)［5］，同時，在低溫脅迫下，葉綠素的光還原活性降低，固定熒光Fo 上升，F(xiàn)v/Fo 和Fv/Fm 的比值明顯降低。Fo 上升，表明PSII 反應中心失活，結(jié)合Fv/Fo 和Fv/Fm 降低，則反映出PSII的潛在活性和原初光能轉(zhuǎn)換效率的減弱。

高溫脅迫常引起PSII 反應中心的失活和捕光葉綠素a/b 蛋白復合物的降解，其原因是由于PSII捕光葉綠素a/b 蛋白復合物磷酸化所調(diào)節(jié)的狀態(tài)1至狀態(tài)2 轉(zhuǎn)化，這被認為是防御PSII 過量激發(fā)或結(jié)構(gòu)損傷的機制。狀態(tài)1 向狀態(tài)2 的轉(zhuǎn)化會使PSII獲得激發(fā)能減少引起熒光淬滅。

2.3 水分脅迫

水分是植物生長發(fā)育的必要條件之一，由于干旱脅迫引起的林木、農(nóng)作物減產(chǎn)的量相當于其他因素引起減產(chǎn)總量的一半［7］。干旱脅迫可導致植物葉片中葉綠素含量的降低，葉片失水影響葉綠素的生物合成，且促進已形成的葉綠素加速分解，造成葉片變黃。而在一定范圍內(nèi)葉綠素含量的高低則直接影響葉片的光合能力，較合理的葉綠素a/b 值可防止葉內(nèi)光能過剩誘導的自由基產(chǎn)生和色素分子的光氧化。植物受中度以上干旱脅迫后，光合作用受到明顯抑制，此時氣孔限制不是光合作用降低的主要原因，光合作用的下降主要與葉綠體的功能障礙有關(guān)，干旱阻斷了放氧復合物到光系統(tǒng)II(PSII)的第二個電子供體(即質(zhì)子醌和P700)之間的電子傳遞，從而導致整個電子傳遞活性降低。PSII 的破壞常伴隨Mn2+的喪失，脂肪酸的增加及ATP 和蛋白質(zhì)的降解［8］。在水脅迫期間如維持正常光照會提高玉米黃質(zhì)的保護作用，即提高天線葉綠體中熱耗散的速率，從而降低PSII 光化學效率(Fv/Fm)。水分脅迫能引起Fo 上升和Fv 下降，他們的變化程度可以用來鑒別植物的不同抵抗或忍耐干旱能力［9］。

2.4 鹽脅迫

鹽堿脅迫對植物產(chǎn)生的脅迫作用與干旱脅迫有相似的生理效果如:引起植物失水和體內(nèi)滲透壓的增加，除此之外，鹽離子代謝失調(diào)也會影響光合作用的正常進行。受到鹽脅迫的植物，都會有Fv/Fo、Fv/Fm、qP 的下降和qN 的上升，而且非光化學淬滅系數(shù)比光化學淬滅系數(shù)對NaCl 反應較敏感，這主要是與NaCl 脅迫使葉片中的離子平衡及細胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，毒性物質(zhì)產(chǎn)生，葉綠素活性和光合酶活性下降有關(guān)。另外，有報道指出，在葉中同時積累鈉和氯會加速熒光的淬滅，若僅積累氯排出鈉則不會加速這種淬滅，加速熒光淬滅可能是由于加速Q(mào)A再氧化的結(jié)果［10］。

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