鴨坦布蘇病毒病診斷方法概述

陳桂英

（青海湟中縣總寨鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，青海湟中811602）

自2010年春季開始，我國福建、浙江、上海、山東等主要鴨養(yǎng)殖密集區(qū)由南到北暴發(fā)了一種以種鴨、蛋鴨產(chǎn)蛋急劇下降為主要臨床特點，以出血性卵巢炎為主要病變特點的新發(fā)、急性、烈性傳染病，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失［1－3］。該病同時具有發(fā)病急、傳播速度快、發(fā)病率高等主要流行特點，病鴨主要表現(xiàn)為高熱，食欲下降甚至廢絕，產(chǎn)蛋數(shù)量迅速下降直至停產(chǎn)，發(fā)病率幾乎為100%，病死率約為5%～15%［4－6］。為有效預(yù)防和控制該新發(fā)傳染病，國內(nèi)外學(xué)者迅速開展針對該病的病原學(xué)、診斷技術(shù)、疫苗等方面的相關(guān)研究工作，相繼提出鴨出血性卵巢炎、鴨產(chǎn)蛋下降綜合征、鴨傳染性產(chǎn)蛋減少癥、鴨病毒性腦炎等名稱［7－10］。隨著對該病病原學(xué)研究的不斷深入，該病被統(tǒng)一確診為由一種新型的黃病毒——鴨坦布蘇病毒 （Duck tembusu virus，DTMUV）引起，故將該病統(tǒng)一命名為鴨坦布蘇病毒病（Duck Tembusu virus disease，DTMUVD）［11－14］。對于DTMUVD的診斷，根據(jù)臨床癥狀、病理變化和流行病學(xué)即可做出初步診斷，但要確診該病毒需進行病毒分離與鑒定及分子生物學(xué)檢測等實驗室診斷。本文綜述了DTMUVD診斷方法的最新研究進展，以期為臨床DTMUV感染進行早期快速、準(zhǔn)確的診斷提供參考，為制定該病的合理綜合防控策略提供依據(jù)。

1 臨床診斷

1.1 臨床癥狀

感染鴨主要表現(xiàn)為采食量突然迅速下降，隨之產(chǎn)蛋率大幅度下降，由高峰期的90%降至10%左右，群內(nèi)發(fā)病率達100%，病死率為5%～15%。鴨發(fā)病后體溫升高，排綠色稀糞，在感染的后期，出現(xiàn)腿癱、行走不穩(wěn)、轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀。該病病程約為1個多月，發(fā)病后15d～20d采食量開始逐漸恢復(fù)，綠色糞便逐漸減少，體溫開始降低，產(chǎn)蛋率逐漸回升，有的可恢復(fù)到發(fā)病前的水平［1－3，5，14］。

1.2 病理變化

病理剖檢發(fā)現(xiàn)該病的主要病變部位在卵巢，表現(xiàn)為卵巢岀血、變性、萎縮和破裂；卵泡膜充血和出血；卵泡嚴(yán)重出血、萎縮和壞死。多數(shù)病鴨肝臟淤血、腫大、壞死；脾臟腫大、呈大理石樣，有的因極度腫大而破 裂；心 臟 的 心 肌 外 壁、內(nèi) 膜 岀 血［1－3，5，10，14］。具有神經(jīng)癥狀的發(fā)病鴨可見腦膜岀血，腦組織水腫［15］。

1.3 流行病學(xué)

鴨坦布蘇病毒病發(fā)病突然，傳播快速，可感染除番鴨外的所用品種產(chǎn)蛋鴨，以及產(chǎn)蛋雞和產(chǎn)蛋鵝［16－18］。將DTMUV 分離株注 射給蛋鴨、雛鴨、雛雞、雛鵝能復(fù)制出DTMUVD的典型臨床癥狀和病理變化，并可回收到DTMUV。DTMUV本質(zhì)屬蚊蟲傳媒病毒，提示該病毒可能會經(jīng)蚊子等傳播。從發(fā)病鴨場內(nèi)死亡的麻雀體內(nèi)可檢出本病毒，提示該病毒可經(jīng)鳥類傳播［14］。病鴨的卵泡膜中DTMUV檢出率最高，提示該病毒可垂直傳播。趙冬敏等［19］證實該病毒可以通過鵝胚傳到下一代，即該病毒在種鵝中存在垂直傳播。從泄殖腔拭子可分離到病毒，表明該病毒可經(jīng)糞便排毒，提示經(jīng)污染的環(huán)境、飼料、飲水、器具、運輸工具等均可傳播病毒［14］。

2 病毒的分離與鑒定

病毒分離鑒定是DTMUV經(jīng)典、準(zhǔn)確、可靠的診斷方法，發(fā)病鴨的卵泡膜、肝臟、脾臟等病變組織均可分離到病毒。萬春和等［20］從產(chǎn)蛋驟降的病死種鴨中無菌采集卵巢經(jīng)尿囊腔途徑接種10日齡健康番鴨胚，成功分離到一株DTMUV。李玉峰等［10］采集產(chǎn)蛋下降的櫻桃谷種鴨的脾臟、卵泡膜等組織病料，以及出現(xiàn)神經(jīng)癥狀雛鴨的腦膜、腦組織等組織病料分別作為接種樣品，成功分離到了2株DTMUV，分別命名為BZ株和LC株。黃欣梅等［18］采集發(fā)病鵝的肝臟、脾臟等病變組織，經(jīng)尿囊腔途徑接種12日齡鴨胚，成功分離1株DTMUV。陳仕龍等［17］從臨床表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降、卵泡萎縮、卵泡膜出血的發(fā)病蛋雞的卵巢、輸卵管、肝、脾等組織中分離到3株DTMUV。

3 RT－PCR方法

RT－PCR技術(shù)具有快速、特異、簡便等優(yōu)點，是實驗室常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，為MDTUVD剛剛暴發(fā)時的確診做出了較大的貢獻，也是目前MDTUV準(zhǔn)確、簡單、快速診斷的主要方法。李玉峰等［10］對分離的病毒用新城疫病毒、流感病毒等不同禽病的特異性引物分別進行PCR或RT－PCR檢測，均未擴增出特異條帶，但用隨機引物進行RT－PCR擴增出基因片段，將其利用GenBank進行Blast同源性比較，確定分離病毒為 MDTUV。曹貞貞等［3］分離的病毒經(jīng)鴨瘟病毒、水禽細小病毒、鴨呼腸病毒、鴨甲型肝炎病毒、鴨星狀病毒、鴨圓環(huán)病毒、鴨冠狀病毒、雞傳染性支氣管炎病毒PCR檢測均為陰性，基于黃病毒NS1序列合成特異性引物檢測15株病毒分離物和19份臨床樣品，結(jié)果顯示，15個病毒分離物中12個為陽性，19份臨床樣品中16份為陽性，總陽性率為82.4%。張帥等［21］在對DTMUV序列比對分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計了一對特異性引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立了檢測DTMUV的一步法RT－PCR方法。該方法具有特異、快速、敏感、準(zhǔn)確等特點，可以檢出1.82個TCID50的病毒核酸；應(yīng)用該方法對2010年－2011年收集的106份產(chǎn)蛋下降鴨群臨床病料進行了檢測，陽性率為46.2%，表明DTMUV在我國產(chǎn)蛋鴨群中具有較高的感染率。王劭等［22］建立了檢測禽黃病毒的RT－PCR檢測方法，該方法能從雞黃病毒、鴨黃病毒中擴增出一條約708bp的特異性片段，而不能從雞傳染性支氣管炎病毒、番鴨呼腸病毒、禽呼腸病毒、番鴨細小病毒、鵝細小病毒、新城疫病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、H9亞型禽流感病毒、雞減蛋綜合征病毒擴增出目的片段，該方法最低可檢出10－3TCID50／0.1mL的病毒核酸，顯示出了良好的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性，可以作為禽黃病毒的臨床快速診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查，為研究和控制DTMU在我國的流行具有重要意義。

4 套式RT－PCR方法

唐熠等［23］根據(jù)GenBank中Bagaza株DTMUV的NS3基因保守序列設(shè)計了3條引物，建立了一種適用于DTMUV快速檢測的半套式RT－PCR方法。該方法對2個分離株DTMUV均能擴增出277bp的特異性條帶，而對鴨瘟病毒、禽流感病毒（H9亞型）、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、減蛋綜合征病毒的擴增結(jié)果均為陰性；該方法第1次擴增的敏感性為1×105拷貝／μL，第2次擴增的敏感性為1×102拷貝／μL，第2次擴增的敏感性比第1次高103倍；該方法對山東省各地采集的24份疑似病料可檢出22份陽性。該半套式RT－PCR檢測方法具有操作簡單、快速、特異性好、敏感性高的優(yōu)點，可從病料組織和鴨胚尿囊液中檢測到MDTUV，可用于DTMUV感染的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查，且樣品長期凍存后不影響檢測結(jié)果，將有廣闊的應(yīng)用前景。黃欣梅等［24］根據(jù)GenBank發(fā)表的鵝黃病毒JS804株全基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計了2對特異性引物，建立了禽黃病毒套式RT－PCR檢測方法。該套式RT－PCR方法具有特異性強、敏感性高的特點，最低病毒檢測量為101.89TCID50／0.1mL，比普通 RT－PCR方法敏感性高1 000倍；應(yīng)用該方法對江蘇地區(qū)疑似禽黃病毒病的70份鵝病料、4份鴨病料、12份雞病料進行檢測，總陽性率為58.14%，而用普通RT－PCR方法檢測的陽性率僅為17.44%。該套式RT－PCR檢測方法具有快速、特異、敏感的特點，可用于禽黃病毒感染的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查，將為該病的防控發(fā)揮重要作用。

5 熒光定量RT－PCR方法

實時熒光定量PCR技術(shù)融合了常規(guī)PCR技術(shù)的高靈敏性和光譜技術(shù)的高精確定量的特點，具有定量準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強、速度快、自動化等優(yōu)點，是當(dāng)前動物疫病檢測技術(shù)中簡單、快速、敏感、特異的定量檢測技術(shù)。Yun T等［25］在DTMUV高度保守的3′端非編碼區(qū)設(shè)計一對特異性引物，建立定量檢測DTMUV的實時熒光定量RT－PCR方法，該方法檢測的靈敏度可達10拷貝／μL；該方法檢測常見禽病毒均為陰性；對標(biāo)準(zhǔn)品RNA檢測的線性范圍為2.0×101～2.0×108拷貝／μL；包括核酸的提取過程在內(nèi)，2h內(nèi)即可完成檢測。該方法具有很高的特異性、敏感性和重復(fù)性，能在較廣的范圍內(nèi)準(zhǔn)確定量，實現(xiàn)了DTMUV的快速、靈敏、特異、定量檢測，為DTMUV感染的臨床診斷提供了一個良好的常規(guī)診斷方法。Yan L等［26］根據(jù)GenBank中登錄的DTMUV基因組序列，在E基因序列區(qū)內(nèi)設(shè)計了用于TaqMan熒光定量RT－PCR的一對特異性引物及TaqMan探針，以分離株DTMUV為模板，在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上優(yōu)化了TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)條件，建立了檢測DTMUV的熒光定量RTPCR方法。該方法的靈敏度比常規(guī)RT－PCR方法高100倍，檢測常見禽病病毒均為陰性，具有操作簡單、快速、敏感性高、特異性強、重復(fù)性好、準(zhǔn)確、耗時短的特點，為DTMUV的快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查與監(jiān)測提供了有效的技術(shù)手段。李慶陽等［27］根據(jù)鴨坦布蘇病毒（DTMUV）BYD－1株基因序列設(shè)計特異性引物和TaqMan探針，建立了快速檢測DTMUV的實時熒光定量RT－PCR方法。該方法檢測DTMUV呈陽性，而檢測3株非鴨坦布蘇病毒均為陰性，最低檢測限為1.0×101拷貝／μL，利用該方法分別對攻毒感染具有典型鴨新型黃病毒病臨床癥狀和病理變化的脾臟和肝臟組織進行檢測，陽性率均為100%，而用普通RT－PCR方法檢測的陽性檢測率為85%（17／20）和75%（15／20）。該方法具有敏感性高、特異性好、穩(wěn)定性強的特點，可用于DTMUV早期感染的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

6 RT－LAMP方法

環(huán) 介 導(dǎo) 等 溫 擴 增 （loop－mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)一種新型恒溫核酸擴增技術(shù)，因其具有無需PCR儀等特殊儀器設(shè)備、操作簡便、反應(yīng)迅速、肉眼判讀、成本低廉、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。Wang Y等［28］參照GenBank中最新的 MDTUV及其他黃病毒基因組序列設(shè)計針對MDTUV E基因保守區(qū)的6對引物，建立了可視化檢測MDTUV的RT－LAMP方法。該方法在63℃水浴的條件下，50 min即可完成擴增；檢測MDTUV分離毒株的敏感性達2拷貝／μL，而常規(guī)RT－PCR方法僅為190拷貝／μL；檢測常見禽病毒均為陰性；檢測快速、靈敏、特異、無需特殊的儀器，為基層實驗室MDTUV的檢測提供了簡單、快速的診斷方法。Tang Y等［29］建立的MDTUV的RT－LAMP檢測方法的檢測靈敏度達45拷貝／μL；檢測常見10種禽病毒均為陰性；在對樣品的檢測中與常規(guī)RT－PCR方法檢測結(jié)果一致。Yan L等［30］對檢測 DTMUV RT－LAMP和RT－PCR方法進行了比較分析，得出2種檢測方法檢測的敏感性均為0.01ELD50；檢測常見鴨病毒均為陰性；RT－PCR方法的重復(fù)性好于RT－LAMP方法；2種方法在同時對96份臨產(chǎn)樣品的檢測中，只有3份檢測結(jié)果不同，符合率達96.9%（93／96）。RT－LAMP方法敏感、特異、操作簡單、經(jīng)濟適用，可用于DTMUV的快速診斷，可為基層實驗室或養(yǎng)殖場開展DTMUV的診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供一種簡單、快速、準(zhǔn)確的分子生物學(xué)診斷方法。李兆龍等［31］根據(jù)禽新型黃病毒E蛋白基因序列，在保守區(qū)設(shè)計了一套針對禽新型黃病毒基因8個區(qū)域的6條特異性引物，并對反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立了適合基層應(yīng)用的DTMUV RT－LAMP快速檢測方法。該RT－LAMP方法整個擴增反應(yīng)只需在常規(guī)水浴鍋中45min內(nèi)即可完成；對新型鴨呼腸病毒、鵝細小病毒、番鴨呼腸病毒、新城疫病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞痘病毒均無擴增反應(yīng)；對DTMUV RNA的最小檢測限度為1pg，靈敏度是一步法RT－PCR方法的100倍。該RT－LAMP方法簡便、快速、靈敏、特異，適合在基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場進行DTMUV的快速檢測，對指導(dǎo)當(dāng)前DTMUV的防控具有重要意義。

7 核酸探針

核酸探針技術(shù)不受抗原抗體反應(yīng)的限制，操作簡單，結(jié)果易于判定，具有準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好的優(yōu)點，也是目前常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)。高緒慧等［32］根據(jù)GenBank中Bagaza株 MDTUV基因組序列設(shè)計一對特異性引物，擴增NS3基因406bp的特異性片段，將純化的PCR產(chǎn)物用對人體無傷害的地高辛進行探針標(biāo)記，建立了地高辛標(biāo)記探針檢測MDTUV的方法。該探針僅與MDTUV的核酸發(fā)生特異性雜交，而與鴨瘟病毒、H9N2亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、減蛋綜合征病毒的核酸不發(fā)生雜交；該探針對MDTUV的RNA最低檢出限量為100μg／L；采用該方法和RT－PCR方法對20份MDTUV核酸進行檢測，2種檢測方法檢測結(jié)果一致，符合率達100%；該方法對疑似MDTUV感染鴨的肝臟、肺臟、脾臟、輸卵管、卵泡膜和泄殖腔棉拭子進行檢測，以卵泡膜的檢出率最高。該方法顯示出了較強的特異性和較高的敏感性，同時不需要特殊設(shè)備，一次可以檢測多個樣品，適合在基層推廣應(yīng)用，為MDTUV感染的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了一種可靠的方法。

8 血清學(xué)檢測方法

姬希 文 等［33］利 用 純化的 DTMUV 奉 賢 株（FX2010）免疫Balb／c小鼠，通過雜交瘤技術(shù)，篩選獲得3株能夠穩(wěn)定分泌杭DTMUV的雜交瘤細胞，間接ELISA和IFA結(jié)果顯示3株細胞獲得的單杭均可以與DTMUV發(fā)生特異性反應(yīng)，其中1株為針對DTMUV E蛋白中和表位的單杭。該3株單抗的獲得為進一步研發(fā)DTMUV血清學(xué)診斷方法奠定了堅實的基礎(chǔ)。姬希文等［34］利用純化的DTMUV奉賢株（FX2010）作為包被抗原，對檢測條件進行優(yōu)化，建立了檢測DTMUV血清抗體的間接ELISA方法。該方法對禽流感病毒、新城疫病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒、Ⅰ型鴨肝炎病毒、呼腸病毒、禽白血病病毒的陽性血清檢測均為陰性；對DTMUV陽性血清檢測的靈敏度為1∶6 400；批內(nèi)和批間重復(fù)試驗的最大變異系數(shù)分別為2.9%和3.9%；用該方法和瓊脂擴散試驗（AGP）同時對140份疑似DTMUV血清樣品進行檢測，該方法檢測出陽性108份，而AGP檢測出陽性32份，兩者的陽性符合率為100%，陰性符合率為87.5%，總符合率達到42.85%。該間接ELISA檢測方法顯示出了極高的敏感性、特異性、重復(fù)性，為DTMUV的快速診斷、抗體監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查提供一種快速、簡便的血清學(xué)診斷方法。

9 結(jié)語

DTMUVD是2010年4月份在我國首次出現(xiàn)的對水禽高度致病的新型黃病毒病，傳播迅速，尤其對鴨、鵝危害極大，建立和完善該病的診斷技術(shù)對預(yù)防和控制該病將具有十分重要的意義。僅僅2年多的時間內(nèi)，我國獸醫(yī)工作者在DTMUV的診斷領(lǐng)域就取得了重要進展，完成了病毒的分離鑒定及全基因組序列測定，建立了諸多分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測方法，為有效控制DTMUV的傳播與流行提供了技術(shù)手段。同時全基因組序列的測定為研制基因工程疫苗提供了基本的理論數(shù)據(jù)，為分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測方法的建立提供了依據(jù)，為篩選抗原性良好的滅活疫苗和弱毒活疫苗等天然疫苗株奠定了基礎(chǔ)。相信隨著研究學(xué)者對DTMUV研究的不斷深入，分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的不斷應(yīng)用，DTMUV的診斷方法必將日趨成熟和完善，從而為DTMUVD的預(yù)防和控制提供更加合理的科學(xué)依據(jù)，保障我國養(yǎng)鴨業(yè)的穩(wěn)定、持續(xù)、快速發(fā)展。

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