狂犬病病毒實驗室檢測方法研究進展

楊妍梅，馮若飛，馬忠仁

（1.西北民族大學生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅蘭州730030；2.甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅蘭州730030；3.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030）

狂犬病（Rabies）俗稱瘋狗病，又稱恐水癥，是由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的一種人畜共患的急性接觸性傳染病，發(fā)病后病死率幾乎為100%。我國是狂犬病的高發(fā)地區(qū)，感染狂犬病死亡人數(shù)居世界第二，僅次于印度。當今世界，狂犬病仍然是一種高發(fā)的人畜共患病，無論在發(fā)達國家［1］，還是發(fā)展中國家［2］，都是重點防控的傳染病?？袢≡谖覈欢鹊玫接行Э刂?，值得關注的是我國城鄉(xiāng)養(yǎng)犬、貓等寵物的家庭迅速增加，野犬、貓的數(shù)量均呈現(xiàn)增多趨勢［3］，使該病的發(fā)病率近年有上升趨勢。

狂犬病病毒是彈狀病科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒屬的成員，為不分節(jié)段的單股負鏈RNA病毒，基因組長度為11 928nt～11 932nt，編碼5種結(jié)構蛋白，順次為核蛋白（N）、磷酸蛋白（M1）、基質(zhì)蛋白（M2）、糖蛋白（G）和 RNA聚合酶（L），分別由對應的5種結(jié)構基因編碼，其中N基因具有毒株間相對保守和高拷貝復制的特點，成為病毒分型、系統(tǒng)發(fā)生分析和分子診斷的目標序列［4］?？袢嶒炇以\斷方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、熒光抗體技術（fluorescence antibody，F(xiàn)A）方法、快速熒光抑制灶技術（RFFIT）、反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）、熒光定量RT－PCR，環(huán)介導等溫擴增技術（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）和基因芯片（Genechip）等方法［5］。本文就這些方法在狂犬病病毒檢測上的應用進行歸納和總結(jié)。

1 狂犬病病毒的分離

自從1881年巴斯德把人的狂犬病病毒經(jīng)家兔傳代而分離到固定毒以來，現(xiàn)世界各地都已分離到了狂犬病病毒?？袢〔《镜姆蛛x方法可分為兩種，一種是實驗動物分離，先將含有狂犬病病毒的腦組織懸液在易感動物體內(nèi)接種，再進行狂犬病病毒的分離，并對易感動物的腦組織采用免疫熒光技術檢測［6］。另一種是易感細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)24h～48h后，用免疫熒光檢測狂犬病病毒包涵體，即Negri小體［7］。由于細胞培養(yǎng)有許多優(yōu)點，可提高疫苗的質(zhì)量及病毒的含量；可以結(jié)合免疫學技術和病毒學技術發(fā)展成各種快速、簡便的測定狂犬病病毒的方法，這就使在實驗室對狂犬病病毒的研究變得容易進行，所以它是病毒學上最常用的分離病毒的方法。

2 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測在一般實驗室即可進行，既可測抗原又可測抗體，快速簡便，單流程數(shù)小時即可完成，適合做批量樣品檢測，價格低廉，是最適合大范圍狂犬病病毒篩查的一種方法，但是該方法存在操作過程繁瑣，與實驗人員的熟練程度呈正相關的缺點。已有報道的ELISA檢測法主要有競爭法、雙抗夾心法、間接法等，成功的ELISA法檢測的靈敏度和特異性都應在85%以上［8－9］。

Feyssaguet M 等［8］報 道 的 PLATELIATM RABIESⅡELISA試劑盒采用狂犬病病毒糖蛋白包被檢測板，與RFFIT檢測比較靈敏度為98.6%，特異度為99.4%，基本上可以替代RFFIT進行狂犬病病毒中和抗體檢測。羅金燕等［10］將狂犬病病毒糖蛋白（G蛋白）中和抗原表位串聯(lián)表達的重組蛋白作為抗原，建立了檢測RABV中和抗體的間接ELISA技術。該方法與快速熒光灶抑制試驗（RFFIT）的陽性符合率為88%，陰性符合率為96%，具有良好的特異性和重復性。宮苗苗等［11］以原核表達的狂犬病病毒M蛋白為檢測抗原，建立了間接ELISA抗體檢測方法，并利用該方法與商品化試劑盒同時檢93份臨床血清樣品，結(jié)果二者的符合率為89.2%，由此可見，該方法比較靈敏。Kazuak等將常規(guī)的酶聯(lián)免疫技術和微量技術相結(jié)合檢測中和抗體，結(jié)果是快速熒光抑制灶技術（RFFIT）一致，并且比RFFIT快速易行。

3 熒光抗體技術

熒光抗體技術是以熒光物標記抗體進行抗原定位的技術，熒光抗體技術包括熒光抗體染色技術（FAT）和快速熒光抑制灶技術（RFFIT）。該技術在檢測動物和人狂犬病病毒時快速且敏感，是狂犬病診斷的金標準。

3.1 熒光抗體方法

熒光抗體方法有直接和間接兩種，它可檢測病毒抗原，對病毒在細胞中進行定位。該方法既靈敏、特異性又高，應用價值非常高。該法可直接涂片檢測，也能用于檢測細胞培養(yǎng)或被接種小鼠的腦組織中狂犬病病毒抗原是否存在［12］。對于新鮮病料，F(xiàn)A法可以快速得出結(jié)果，準確率可達95%～99%。FA法與其他任何檢測方法相同，其可靠性主要影響因素有狂犬病病毒、樣品性質(zhì)和實驗人員的熟練程度［13］。其特異性和靈敏度，一定程度上依賴于親和力、梯度及特異性結(jié)合狂犬病病毒核蛋白的最佳熒光抗體。Sylvia Z［14］檢測了800多份來自14種不同動物的懷疑有狂犬病病毒的腦組織，用新鮮病料同時用福爾馬林固定，熒光抗體方法檢測兩種病料的陽性結(jié)果符合率達99.8%，未出現(xiàn)假陽性，對兩種病料的特異性均達100%。因此得出結(jié)論，用FA方法檢測狂犬病病毒抗原，用新鮮病料或用經(jīng)福爾馬林固定后的病料，效果是等同的。

3.2 中和抗體效價快速熒光灶抑制試驗

中和抗體效價快速熒光灶抑制技術（RFFIT）是世 界 衛(wèi) 生 組 織 （（World Health Organization，WHO）推薦的檢測狂犬病病毒中和抗體的標準試驗方法［15］，主要應用于狂犬病疫苗的免疫學效果評估［16－17］和狂犬病病毒中和抗體替代檢測試劑和方法的評估［18－19］，是狂犬病疫苗及中和抗體診斷試劑評價的關鍵技術。

1979年，Englene等把RFFIT和微量技術結(jié)合起來測定中和抗體，與MNT比較，結(jié)果一致，并推薦為測定中和抗體的標準方法。對RFFIT的改進的研究一直在進行，法國Pharpr D等［20］在RFFIT結(jié)果的自動化判讀方面獲得成功，日本Khawplod P等［21］應用表達綠色熒光蛋白的rHEP－GFP重組狂犬病病毒作為攻擊病毒進行RFFIT，可以直接觀察結(jié)果。呂新軍等［22］研究表明，RFFIT檢測體系穩(wěn)定性良好，可用于其他樣品檢測。完善了體系靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、重復性等主要指標的評價，同時說明他們采用與熒光顯微鏡配套的電腦成像系統(tǒng)進行結(jié)果觀察，為RFFIT結(jié)果的觀察提供方便。吳小紅等［23］采用RFFIT和小鼠中和試驗檢測我國抗狂犬病免疫球蛋白國家標準品的GMT，結(jié)果兩種方法的檢測結(jié)果之間呈正相關。

常用的血清學技術除中和試驗外，還有補體結(jié)合試驗、間接熒光抗體試驗、交叉保護試驗、血凝抑制試驗以及間接免疫酶試驗等等。近年來單克隆抗體技術也可用于狂犬病的診斷。

4 反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應

反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR）是熒光抗體方法的補充，檢測結(jié)果較直觀，易于判定，獲得的序列能夠直接用毒株的系統(tǒng)發(fā)生分析，但是，RT－PCR檢測狂犬病病毒缺乏規(guī)范性程序，許多實驗室出現(xiàn)污染或假陰性問題［24］。但由于RT－PCR能夠?qū)Ω咄繕悠返膶崿F(xiàn)快速檢測，因此該方法還是得到了廣泛的運用。江禹等［25］建立了能夠有效擴增7種基因型RV基因組片段的套式RT－PCR（nested RTPCR）方法。該方法能夠檢測到4.6個TCID50的SRV9固定毒。對街毒腦組織樣品檢測的靈敏度較乳鼠腦內(nèi)接種試驗（MIT）高出100倍，對3種鼠腦固定毒、12種犬腦街毒樣品的檢測結(jié)果與FAT檢測結(jié)果一致。Aravindh Babu R P等［26］利用3種不同引物組合評價RT－PCR快速檢測狂犬病不同動物腦組織的的敏感性和特異性，其檢測結(jié)果與FAT檢測結(jié)果100%相符。Wacharapluesadee S等［27］利用RT－PCR方法從保存達16年的狂犬病人腦樣品中檢測出狂犬病病毒N基因的150bp目的條帶，但用免疫組化反應中陽性率較低。Whitby J E等［28］將RT－PCR和PCR－ELISA相結(jié)合，可區(qū)分經(jīng)典的狂犬病病毒和歐洲蝙蝠狂犬病病毒，結(jié)果顯示，該法比Southern blot敏感100倍，具有快速、敏感和簡便等優(yōu)點。

5 熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR檢測方法是一種敏感、快速、重復性好的高通量檢測手段。國內(nèi)外應用這一技術已經(jīng)建立了多種檢測RABV的熒光定量PCR方法。該技術自1991年首次用于RABV的實驗室診斷以來，已成為 WHO和世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）推薦的標準方法［29］，但是該方法易出現(xiàn)假陽性，這有待深入研究。

針對我國狂犬病的流行特點，許運斌等［30］針對RABV N基因保守序列設計并合成了一套簡并引物和TaqMan探針，在優(yōu)化反應條件的基礎上，建立了檢測RABV核酸的一步法熒光定量RT－PCR（qRT－PCR）檢測方法，他們建立的qRT－PCR與套式RT－PCR的符合率為100%。檢測29份新鮮和5份腐敗的臨床犬腦組織樣品，qRT－PCR與套式RTPCR均檢測出12份陽性的新鮮樣品和5份陽性的腐敗樣品。高志強等［29］建立了古典狂犬病病毒熒光RT－PCR檢測技術，并應用該技術對寵物醫(yī)院提供的犬唾液樣品進行了檢測，結(jié)果顯示熒光RTPCR試驗結(jié)果同病毒分離檢測結(jié)果均為陰性，沒有發(fā)現(xiàn)陽性樣本，但從采集的流浪犬唾液樣品中檢出了陽性樣本。Crepin P等研究表明，采用常規(guī)的RT－PCR方法可從唾液樣品或CSF樣品中檢出狂犬病病毒核酸，而且有時與死后確診結(jié)果符合率達100%［31－32］。Wakeley P R 等［33］建立了 TaqMan實時熒光RT－PCR用于檢測狂犬病病毒，結(jié)果其靈敏度高于常規(guī)的RT－PCR方法，與套式RT－PCR靈敏度相同［29］。結(jié)合TaqMan基因型特異探針的RTPCR的方法能快速有效鑒別病毒。實時熒光定量RT－PCR檢測唾液樣品比傳統(tǒng)RT－PER的靈敏度高。Hughes J G等［34］設計一個檢測組織樣品狂犬病病毒RNA的TaqMan PCR方法，并證明該方法敏感性、特異性均較高。Supaporn W 等［35］利用TaqMan實時定量RT－PCR對非神經(jīng)樣本進行狂犬病病毒RNA檢測的特異性為100%。

6 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）是2000年由Notomi T等［36］首先報道的一種新穎的核酸擴增技術，即核酸環(huán)介導等溫擴增技術。LAMP技術采用能特異識別靶序列上6個位點的4條引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件（60℃～65℃）下，1h內(nèi)其擴增效率可達到109～1010個數(shù)量級，具有特異性強、等溫靈敏、操作簡單、結(jié)果易判定等優(yōu)點，但是其有易污染的致命的缺點。

許丹等［37］檢測17份臨床樣本的結(jié)果顯示，LAMP法和傳統(tǒng)PCR法的敏感性一致，陽性檢出率均為23.5%。該法操作簡單，整個試驗過程比普通PCR法節(jié)省時間1.5h。黃元等［38］針對狂犬病病毒的核衣殼蛋白基因（N基因）和大轉(zhuǎn)錄酶蛋白基因（L基因）中的高度保守區(qū)段分別設計了一套引物，建立了檢測狂犬病病毒的快速一步式反轉(zhuǎn)錄－環(huán)介導恒溫擴增（RT－LAMP）方法。RT－LAMP具有良好的特異性，靈敏度比RT－套式PCR高10倍以上。該方法靈敏、快速 、簡便，在基層比較適用。已有報道Saitou Y 等［39］和 Hayman D T 等［40］通過使用 RTLAMP法來檢測狂犬病病毒。

7 基因芯片技術

基因芯片（又稱DNA芯片、生物芯片）是在20世紀80年代中期提出的?；蛐酒臏y序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針?；蛐酒哂行滦突?、高通量、高度平行性和高速性的特點，已經(jīng)廣泛應用于發(fā)現(xiàn)與疾病相關的新基因、基因表達譜分析、藥物的研究與開發(fā)等諸多方面［41－42］。張偉等［43］在探針反相雜交技術的基礎上，融合基因芯片的基本原理、核酸分子堿基互補配對的原則和酶聯(lián)顯色技術的基本原理建立了RABV低密度基因芯片。檢測160份可疑犬的血的結(jié)果表明該方法比ELISA和 RT－PCR靈敏度高、特異性強［44］。王振全等［45］在靶基因的上游引物5′端標記了生物素Biotin，提高了雜交特異性和靈敏度。診斷基因芯片由于在每份檢測樣品中都設置陽性和陰性參照，并通過分子雜交進行確認，有效地克服了PCR易被污染的缺點。利用計算機分析軟件進行分析、確診，大大降低了在結(jié)果判斷過程中的主觀因素，使各個實驗室得到的結(jié)果具有可比性，而且診斷基因芯片檢測樣本量越大，成本越低；不僅快速、準確、敏感，而且可以同時進行多種病毒的檢測，有利于大規(guī)模推廣應用。

8 總結(jié)

狂犬病是危害人類生命的重大疫病之一，急需一種快速、準確的診斷方法，同時，國際上也亟待一套規(guī)范化的診斷程序。血清學方法是狂犬病病毒實驗室診斷的主要方法，快速、簡便、低成本并以重組蛋白作為診斷抗原的血清學方法是現(xiàn)階段的發(fā)展趨勢。ELISA方法較為常用，適用于醫(yī)院內(nèi)大批量血液的篩查，也可用于確診。PCR方法作為血清學方法的有效補充，但引物的特異性和靈敏度仍待提高。RFFIT技術快速、精確和重復性好。LAMP檢測方法的優(yōu)點和血清學方法的優(yōu)點相似，但是其易污染。熒光定量PCR檢測是一種快速、靈敏、高特異性、污染率低以及可廣泛應用于我國狂犬病病毒檢測的方法?；蛐酒夹g有效地克服了PCR易被污染的缺點，具有高的靈敏度、特異性和可靠性。未來的發(fā)展趨勢是在這些診斷方法中篩選出簡單、快速、準確并且成本低、易推廣的診斷技術。

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