雞抗病毒免疫相關(guān)的TLR 信號(hào)途徑研究進(jìn)展

李海超，韓凌霞

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，黑龍江哈爾濱150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

宿主的先天免疫系統(tǒng)能通過模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRR）有效識(shí)別病原微生物和寄生蟲，其中研究較深入的是保守的跨膜蛋白Toll樣受體（Toll－like receptor，TLR）家族，能識(shí)別固有保守的分子序列——病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMP），而PAMP是廣泛存在于細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌的重要組成成分。此外，TLR能識(shí)別在感染過程中釋放出來的一些配體，例如熱休克蛋白。

迄今為止，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了13種TLR，其中11種在人類中表達(dá)。在雞已經(jīng)獲得的TLR，一些與人的TLR同源；一些與人的TLR缺乏同源性；甚至有些似乎是雞所特有的。然而，雞能對(duì)哺乳動(dòng)物TLR激活劑的類似物產(chǎn)生應(yīng)答。根據(jù)表達(dá)的位置，TLR可以分為兩大類，即細(xì)胞膜上的TLR和分布于內(nèi)體膜上的胞內(nèi)TLR。

哺乳動(dòng)物的TLR3、7、8和9能識(shí)別微生物的核酸并與抗病毒免疫有關(guān)，然而在雞上能識(shí)別核酸配體的是TLR3、7和21。本文主要介紹在抗病毒免疫中雞TLR的作用及其信號(hào)途徑。

1 Toll樣受體的信號(hào)途徑

TLR是由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域（Toll－白介素1受體同源結(jié)構(gòu)域 Toll／IL－1 receptor，TIR）組成［1］，通過 TIR結(jié)構(gòu)域與接頭分子的同源區(qū)相互作用傳遞信號(hào)。除了TLR3外，所有已知的TLR都能利用已廣為熟知的信號(hào)接頭分子髓細(xì)胞樣分化標(biāo)志物88（myeloid differentiation marker88，MyD88）。MyD88包含死亡結(jié)構(gòu)域，在MyD88與TLR的TIR相互作用后，MyD88的死亡結(jié)構(gòu)域能募集IL－1R 相關(guān)因子（IL－1receptor－associated kinase，IRAK）家族的成員。然后IRAK蛋白從MyD88／TLR復(fù)合體中分離出來，再與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor related factors，TRAF6）結(jié)合，調(diào)節(jié)下游信號(hào)途徑。TLR3和TLR4又能募集第2個(gè)接頭分子TRIF（TIR－domain－containing adaptor protein inducing interferon－β，TRIF）。TRIF活化啟動(dòng) TRAF3依賴的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致TRAF家族成員相關(guān)NF－kB激活劑連接激酶1的活化和二聚化作用，并抑制NF－kB激酶復(fù)合體，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子IRF3的去磷酸化，使IRF3轉(zhuǎn)移到核內(nèi)［2］。

2 細(xì)胞膜上的Toll樣受體

在位于細(xì)胞膜表面的TLR中，雞的TLR4和5與人 TLR 有同源物［3－4］。人 TLR1、6和10基因位于同一條染色體上。TLR1和TLR6編碼的蛋白能與TLR2編碼的蛋白分別形成異源二聚體，增加識(shí)別PAMP的范圍。在雞的基因組上與人TLR1、6、10同源的位置上僅僅包含2個(gè)基因，稱為TLR1LA和TLR1LB［5］，意味著雞TLR可能識(shí)別較小范圍的PAMP。雞有兩個(gè)TLR2基因，被稱為TLR2I型和II型或TLR2A和TLR2B［3］，它們編碼的蛋白能分別與2個(gè)TLR1蛋白形成異源二聚體［6］，提示雞可能采用不同的TLR識(shí)別與哺乳動(dòng)物相似的細(xì)胞表面識(shí)別PAMP。

TLR能參與多種病原體的識(shí)別。TLR2和TLR4是細(xì)胞膜上2個(gè)重要的TLR，主要識(shí)別胞外病原體。例如，TLR2能識(shí)別細(xì)菌的脂多糖和多種真菌的PAMP［7］，而TLR4識(shí)別革蘭陰性菌的肽聚糖。然而，近幾年研究證明TLR2和TLR4在抗病毒應(yīng)答中也起重要的作用。Barbalat R等［8］證明TLR2在脾臟和骨髓細(xì)胞中識(shí)別病毒，并通過未知的病毒配體活化TLR2，導(dǎo)致I型干擾素的產(chǎn)生，屬于典型的抗病毒應(yīng)答。TLR4在牛痘病毒免疫中的新作用已經(jīng)被揭示。病毒感染TLR4功能缺失的小鼠，與野生型小鼠相比，其病毒復(fù)制、體溫和死亡率均高于野生型小鼠［9］。對(duì)于TRL4來說牛痘病毒是一種新配體，而不是內(nèi)源配體。

3 細(xì)胞內(nèi)體上的Toll樣受體

哺乳動(dòng)物的TLR3、7、8和9位于細(xì)胞內(nèi)體上，能識(shí)別核酸。TLR3識(shí)別雙鏈RNA（dsRNA）和人工合成的激活劑poly（I∶C）；TLR7識(shí)別單鏈RNA（ssRNA）和合成的抗病毒咪唑莫特、Gardiquimod和R－848；TLR8與TLR7高度同源并能識(shí)別相似的合成抗病毒藥物；TLR9識(shí)別DNA，特別是富含非甲基化的CpG序列的DNA。TLR9也能識(shí)別入侵細(xì)胞的病毒，這類TLR在抗病毒感染中特別重要。

雞TLR3和TLR7與人TLR同源，能識(shí)別病原性核酸。雞TLR8的基因是假基因，在進(jìn)化史中的某個(gè)階段已經(jīng)丟失，并插入了大量的CR1重復(fù)序列。TLR9在雞的基因組中是缺失的，但是雞細(xì)胞還能對(duì)CpG序列產(chǎn)生快速應(yīng)答［10］，而CpG序列是人TLR9的激活劑。雞有兩個(gè)特有的TLR：TLR15和TLR21［11］。已經(jīng)證明雞TLR21能識(shí)別CpG序列［12］。雖然能從TLR15胞外區(qū)的LRR預(yù)測(cè)所識(shí)別的病原體表面的PAMP，但TLR15的配體尚不清楚。

3.1 Toll樣受體3

TLR3能識(shí)別dsRNA和合成的多聚類似物［13］，因而能通過識(shí)別被ssRNA病毒感染的吞噬或凋亡細(xì)胞中的dsRNA中間物起作用［14］。TLR3基因缺失小鼠對(duì)DNA病毒鼠巨細(xì)胞病毒（MCMV）易感［15］，提示通過來自DNA病毒基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能產(chǎn)生dsRNA，在西尼羅病毒［16］和A型流感病毒［17］模型中能依賴TLR3方式產(chǎn)生前細(xì)胞因子，說明體內(nèi)能產(chǎn)生dsRNA中間產(chǎn)物并被識(shí)別。盡管TLR3能對(duì)dsRNA產(chǎn)生應(yīng)答并有效誘導(dǎo)IFN，但TLR3缺失導(dǎo)致病毒感染引起嚴(yán)重疾病，仍缺乏體內(nèi)試驗(yàn)證據(jù)支持，因而有觀點(diǎn)認(rèn)為TLR3可能不是病毒的直接受體［18］。

但感染H5N1亞型禽流感病毒的雞脾臟、肺臟和腦組織中 TLR3和INF－β、用poly（I∶C）體外刺激的雞白細(xì)胞中TLR3和Ⅰ型干擾素、用poly（I∶C）體外刺激的雞胚成纖維細(xì)胞系中，TLR3和1型干擾素都表現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。利用siRNA沉默chTLR3后再用poly（I∶C）誘導(dǎo)，chTLR3和IFN－β的表達(dá)顯著減少。上述研究提示雞TLR3可能通過調(diào)節(jié)IFN－β的產(chǎn)生在抗病毒感染中起重要作用。

3.2 Toll樣受體7

哺乳動(dòng)物中，首個(gè)鑒定出能刺激TLR7和8的配體是咪唑莫特家族的成員，其結(jié)構(gòu)與核糖核酸類似，因此咪唑莫特能有效刺激抗病毒反應(yīng)，而富含G－U乃至Poly U的 RNA都有能力刺激TLR7［19］、但能有效刺激TLR7的精確結(jié)構(gòu)序列或ssRNA序列還不確定。而宿主衍生的RNA很少能進(jìn)入細(xì)胞并與胞內(nèi)TLR接觸，而且單鏈RNA極其不穩(wěn)定，因?yàn)樗鼈兒芸炀捅话獾腞NA酶降解。相反，病毒顆粒外殼能保護(hù)病毒RNA不被降解。吞噬小體內(nèi)的病毒殼蛋白被降解后，釋放出RNA，并被TLR7／8識(shí)別。

雞TLR7有不同的mRNA剪接形式，它與鼠和人的TLR7相似，可能存在3種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中兩種是蛋白質(zhì)亞基，其中一種的N端序列比另一種少4個(gè)氨基酸。雞TLR7與人TLR7有63%的同源性。與其他TLR相似，雞TLR7表達(dá)于多種組織。用RNA激活劑刺激雞巨噬細(xì)胞HD－11細(xì)胞系和脾細(xì)胞，導(dǎo)致IL－1β、IL－6和IL－8表達(dá)上調(diào)，而IFN－ɑ或β不上調(diào)；誘導(dǎo)的細(xì)胞因子對(duì)氯喹敏感，暗示內(nèi)體的酸化很重要。TLR7的激活劑洛索立賓在異嗜性白細(xì)胞中能下調(diào)此類相同的前炎癥細(xì)胞因子，這與人的中性粒細(xì)胞相反。在HEK－293細(xì)胞系中用TLR7的激活劑咪唑莫特或Gardiquimod刺激，導(dǎo)致N F－κB活化。用H9N2亞型禽流感病毒感染雞巨噬細(xì)胞，在感染初期雞TLR7顯著上調(diào)，而感染后期下降，這與前炎癥細(xì)胞因子的上調(diào)或下調(diào)相一致［20］。

TLR7能通過信號(hào)接頭分子MyD88在漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞上誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素。人免疫缺陷病毒、流感病毒和水皰性口炎病毒能刺激TLR7。流感病毒基因組能在小鼠樹突狀細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生TLR7依賴的IFN－ɑ。

3.3 Toll樣受體21／Toll樣受體9

細(xì)菌染色體中未甲基化的CpG序列是首個(gè)被鑒定出能活化TLR9的配體［21］，此后很多DNA病毒也被證明能活化TLR9，包括皰疹病毒［22］、腺病毒［23］和輸血傳播病毒家族［24］。甲型皰疹病毒和乙型皰疹病毒基因組都富含CpG序列。脾臟和骨髓中的單純皰疹病毒1型和2型，能活化TLR9以產(chǎn)生前炎癥因子和I型干擾素，在小鼠巨細(xì)胞病毒中也有相似的結(jié)果［25］。

通過人工設(shè)計(jì)合成含有CpG序列的寡脫氧核苷酸（CpG sequences of DNA nucleotides，OND）可以模擬未甲基化的CpG序列，作為TLR9／TLR21的配體。這些OND的免疫學(xué)效應(yīng)已經(jīng)在小鼠、人和其他哺乳動(dòng)物中研究很多，表明這些效應(yīng)是由TLR9介導(dǎo)的OND序列依賴性的。雖然TLR9在禽類的基因組上缺失，已經(jīng)證明OND對(duì)雞預(yù)防細(xì)菌感染有特殊的效果。用OND刺激體外分離的雞外周血淋巴細(xì)胞、異嗜性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞HD－11細(xì)胞系都出現(xiàn)了免疫學(xué)反應(yīng) 。

用外源性O(shè)ND刺激表達(dá)雞TLR21的哺乳動(dòng)物HEK－293細(xì)胞系，能提高NF－KB的活化，但表達(dá)的雞TLR7和15的則不能［26］；當(dāng)TLR21RNA被部分沉默后，IL－1β、IL－6和iNOS的表達(dá)上調(diào)被顯著抑制，而沉默TLR15沒有此作用。雞TLR21的活化依賴于特異性O(shè)DN序列，并需要CpG基序。TLR9活化的動(dòng)力學(xué)反映現(xiàn)出正向協(xié)作關(guān)系，并且符合哺乳動(dòng)物的變構(gòu)活化模型。刺激雞細(xì)胞、活化雞TLR21的最佳OND序列，同樣也是哺乳動(dòng)物TLR9而不是鼠TLR9的激活劑 。

雞TLR21位于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，并且能被巴弗洛霉素A阻斷，表明內(nèi)體的酸化非常重要。因此，禽TLR21與哺乳動(dòng)物的TLR9在功能上具有同源性，可能已經(jīng)各自進(jìn)化形成識(shí)別微生物DNA為危險(xiǎn)信號(hào)，并立即引起先天免疫應(yīng)答，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫的機(jī)制。雞TLR21是否與魚類或兩棲類的TLR21同源需要進(jìn)一步驗(yàn)證。TLR9可能也存在其他的脊椎動(dòng)物中。已經(jīng)證實(shí)了雞TLR21能被五株彎曲桿菌染色體DNA激活，而不能激活人類TLR9［27］；人TLR9能被含高GC的細(xì)菌DNA高效激活例如分支細(xì)菌，它可能被低含量GC DNA低效的激活，例如彎曲桿菌。因此，禽TLR21識(shí)別的特異性范圍可能比人TLR9更廣泛。

雞TLR21在新生雞、老齡雞和雞胚中都有表達(dá)。與之符合的是新生雛雞能對(duì)ODN產(chǎn)生應(yīng)答，并且雞胚或雛雞接種過ODN［28］后都能抵抗沙門菌感染。Gp46（Hsp90β）對(duì)于胞內(nèi)和胞外的TLR都是重要的蛋白。Bhat A等使用特異性抑制劑格爾德霉素證明在 HD－11細(xì)胞系中ODN的活化需要Hsp90，Western blot和質(zhì)譜分析法顯示Hsp90α與ODN相連接，而不是Hsp90β，這與哺乳動(dòng)物不同，暗示Hsp90α在禽類中對(duì)于OND的活化可能更加重要。TLR時(shí)常相互協(xié)作，可能是由于利用了不同的信號(hào)途徑。在雞巨噬細(xì)胞中ODN被證明能與poly（I∶C）相互協(xié)作誘導(dǎo)一氧化氮，可以用雞TLR21和TLR3通過不同的信號(hào)途徑解釋這一現(xiàn)象。

總之，哺乳動(dòng)物的TLR7和TLR9在漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞（pDC）上高表達(dá)而在普通樹突狀細(xì)胞（cDC）上低表達(dá)，而pDC被認(rèn)為在抗病毒中起主要的作用并且在刺激后能高水平產(chǎn)生Ⅰ型干擾素。近幾年來已經(jīng)能用分子標(biāo)記技術(shù)從雞中分離出DC，并且這些細(xì)胞在免疫中起作用，闡述禽類DC細(xì)胞亞類和他們所表達(dá)的TLR的特點(diǎn)，對(duì)更好地理解禽類免疫非常重要。

4 展望

病毒性疾病每年都能造成養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。TLR是被廣泛研究的先天性受體，在先天性和適應(yīng)性免疫中的作用已被充分證實(shí)。然而，還存在更多的未知需要解答，如禽類免疫系統(tǒng)是如何通過已知和未知先天免疫受體對(duì)各種不同微生物（細(xì)菌、病毒、真菌）和寄生蟲感染產(chǎn)生應(yīng)答的。此外，其他動(dòng)物，如鴨體內(nèi)的RIG－I以及部分NLR家族的成員，在抗病毒感染中起很重要的作用，而雞卻缺失，表明TLR3、7和21在抗病毒免疫中可能起著比其他動(dòng)物的同源物更重要的作用，這也為抗病毒疫苗佐劑研究提供了新的思路。

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