豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測技術研究進展

官家明，施開創(chuàng)，陳漢忠，莫勝蘭

（1.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧530005；2.廣西動物疫病預防控制中心，廣西南寧530001）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又稱“豬藍耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起豬的一種急性、高度接觸性傳染病，臨床上主要表現(xiàn)為妊娠母豬晚期流產(chǎn)，早產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎等繁殖障礙和各種年齡豬特別是仔豬的嚴重呼吸道疾病。PRRS于1987年最早發(fā)生在美國，1991年荷蘭報道了該病，此后相繼在各主要養(yǎng)豬國家發(fā)生，現(xiàn)已呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重危害。PRRSV屬于動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組約為15kb。根據(jù)病毒基因組的差異，PRRSV可分為歐洲型和美洲型毒株，兩種基因型毒株之間基因組差異很大，同源性僅為60%左右。我國于1996年首次分離到PRRSV美洲型經(jīng)典毒株，2006年分離到PRRSV美洲型高致病性變異毒株（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP－PRRSV），2010年報道了致病性PRRSV歐洲型毒株在我國豬群的存在和流行。當前，HP－PRRSV仍然是我國的流行優(yōu)勢毒株，并且病毒基因組處于持續(xù)變異之中，嚴重威脅我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。及時、準確地診斷該病，是采取有針對性的防控措施的基礎。本文就PRRSV主要檢測技術及其近年來的研究進展進行綜述。

1 病毒的分離與鑒定

病毒分離是檢測PRRSV最準確的一種方法。目前用于PRRSV增殖的細胞主要有原代豬肺泡巨噬細胞（porcine alveolar macrophage，PAM）及來源于非洲綠猴腎細胞系的 MA－104細胞、CL2621細胞、Marc－145細胞及克隆自 Marc－145細胞的更敏感的HS.2H細胞。有報道，猴源SJPL細胞系非常適合于PRRSV復制，其產(chǎn)生的病毒滴度與Marc－145細胞相當，可用于PRRSV的分離與研究［1］。通常選取肺臟、淋巴結、扁桃體、脾臟和血清等病料用于分離PRRSV。將組織勻漿上清或血清接種敏感細胞后，觀察是否出現(xiàn)特征性的細胞病變（cytopathic effect，CPE），主要表現(xiàn)細胞聚集、圓縮、固縮、脫落。研究發(fā)現(xiàn)，不同的病毒株適合生長在不同的細胞上，有的毒株僅生長在一種細胞上，有的則生長在多種細胞上，但大多數(shù)毒株特別是歐洲型毒株均適應PAM，因此在分離歐洲型毒株時應盡量采用PAM。不同分離株在敏感細胞培養(yǎng)物上增值情況不同，有些毒株在病料接種后第一代細胞培養(yǎng)即出現(xiàn)CPE，有些毒株則需在第3代才出現(xiàn)CPE，而有些毒株則不出現(xiàn)CPE，需結合其他檢測技術如間接免疫熒光抗體試驗（indirect immunofluorescent antibody test，IFA）、免疫過氧化物酶單層試驗（immunoperoxidase monolayer assay，IPMA）、反轉錄－聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT－PCR）等方法進行驗證。HP－PRRSV分離株容易在Marc－145細胞上增殖，產(chǎn)生典型 CPE［2］。

2 病毒抗原的檢測方法

2.1 病毒中和試驗

中和試驗（serum neutralization test，SN）既可用于檢測病毒抗原，也可用于檢測病毒抗體。檢測PRRSV的病毒中和試驗于1992年首次建立并用于鑒定世界上首個PRRSV美洲型分離株（ATCC VR－2332株）。目前，病毒中和試驗主要用于對PRRSV分離毒株的鑒定，更多時候則用來測定PRRSV 抗體［3］。

2.2 免疫過氧化物酶單層試驗

檢測PRRSV的免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）于1991年首次建立并用于鑒定世界上首個PRRSV歐洲型分離株（Lelystad virus，LV）。目前，IPMA是歐洲國家常用于PRRSV分離鑒定的方法。IPMA除可用于檢測病毒抗原，還可用于檢測病毒抗體［4］，是最早建立的PRRSV抗體檢測方法。

2.3 間接免疫熒光抗體試驗

Benfield D A等［5］利用針對PRRSV核衣殼蛋白的單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb）和異硫氰酸熒光素（fluorecein isothiocyante，F(xiàn)ITC），建立了檢測PRRSV的免疫熒光抗體試驗（immunofluorescent antibody test，F(xiàn)A）和 IFA，用 于PRRSV分離株的鑒定及感染組織、細胞中PRRSV抗原的檢測。該法至今仍為美國及其他國家廣泛采用。陳仕龍等［6］利用針對GP5蛋白的MAb建立了IFA，并與商品化RT－PCR鑒別試劑盒進行了比較，表明IFA與RT－PCR檢測結果的符合率為100%。袁婧等［7］以HP－PRRSV分離株接種試驗豬制備抗血清，經(jīng)硫酸銨鹽析法提取IgG后用FITC進行標記，建立了FA，用于檢測病毒感染單層細胞及動物組織切片中PRRSV抗原，與RT－PCR檢測結果的符合率達到96.3%。FA和IFA為PRRSV提供了一種快速、便捷、敏感、特異的檢測方法。

2.4 免疫組織化學技術

免疫組織化學技術（immunohistochemistry，IHC）常被用于PRRSV感染組織和細胞的病原檢測、抗原定位及甲醛固定樣本的回顧性檢測［8］。近年來，楊鴻等［9］采用免疫組織化學Envision二步法對疑似PRRS病豬肺組織的病毒抗原進行定量、半定量檢測，證實該法可原位檢測病豬肺組織PRRSV抗原的分布。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗 （enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）是目前應用最廣、發(fā)展最快的免疫檢測技術，被廣泛用于檢測PRRSV抗體，而用于檢測PRRSV抗原則鮮有報道。翁善鋼等［10］以 兔 抗PRRSV 多 抗 作 為 捕獲 抗 體、豬 抗PRRSV多抗作為檢測抗體，建立了檢測PRRSV的雙抗體夾心ELISA，應用于臨床組織病料中PRRSV 的 檢 測。梁 海 霞 等［11］針 對 HP－PRRSV Nsp2基因序列設計引物，建立了核酸序列依賴性擴增 （nucleic acid sequence based amplification，NASBA）方法，并結合微孔板中液相雜交和酶標顯色反應檢測NASBA擴增產(chǎn)物，建立了檢測 HPPRRSV的 NASBA－ELISA。該法可特異地檢測HP－PRRSV，靈敏度達到101.83TCID50／mL，而對PRRSV美洲型經(jīng)典毒株檢測結果則為陰性。

2.6 膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術（gold immunochromatography assay，GICA）是一種新型檢測技術。Zhou S H等［12］采用兩種膠體金標記的 MAb D5（抗N蛋白）和E9（抗M蛋白），在硝酸纖維素膜的檢測線和對照線上分別噴上兔抗膠體金標記MAb D5和E9、山羊抗鼠PRRS抗體，成功研制出PRRSV金免疫層析測試條，在反應中PRRSV首先結合帶有膠體金的D5和E9的混合物，然后繼續(xù)層析與兔抗D5、D9二抗結合，最終出現(xiàn)輕微的紫紅色帶，未結合的MAb將與山羊抗鼠抗體結合而在控制帶處顯色。Li X S等［13］利用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標記抗PRRSV N蛋白的MAb 2D7制備免疫檢測探針，將抗PRRSV N蛋白的MAb 1G7和山羊抗鼠IgG抗體印跡在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和質控線，組裝成膠體金免疫層析試紙條，建立了能同時檢測PRRSV美洲型經(jīng)典毒株及變異毒株的GICA。GICA使用簡便，成本低，不需特殊儀器設備，非常適合基層和現(xiàn)場使用。

3 病毒核酸的檢測方法

3.1 反轉錄－聚合酶鏈反應

1987年之后發(fā)展起來的聚合酶鏈反應技術（polymerase chain reaction，PCR）為病毒性疾病的診斷提供了一種嶄新的手段，在PRRSV核酸檢測中得到廣泛應用。2006年高致病性PRRS在我國發(fā)生和流行后，周丹等［14］針對Nsp2基因序列設計特異性引物，建立了鑒別診斷PRRSV經(jīng)典株與變異株的一步法RT－PCR檢測方法。為應對國內美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株以及歐洲型毒株同時存在的復雜狀況，施開創(chuàng)等［15］分別針對PRRSV Nsp2、ORF5、ORF7基因序列設計3對特異性引物，建立了能夠同時檢測并區(qū)分美洲型經(jīng)典毒株、變異毒株以及歐洲型毒株的多重RT－PCR檢測方法。為了區(qū)分 HP－PRRSV與基因缺失弱毒疫苗株，梅林等［16］建立了可鑒別HP－PRRSV野毒株與基因缺失弱毒TJM－F92疫苗株的一步法RT－PCR，為鑒別接種TJM－F92疫苗豬群中的PRRSV野毒感染豬與疫苗免疫豬提供了方法。

3.2 實時熒光定量反轉錄－聚合酶鏈反應

實時 熒 光 定 量 PCR／RT－PCR 技 術 （real－time fluorescent quantitative PCR／RT－PCR，F(xiàn)Q－PCR／RT－PCR）于1996年由美國ABI公司推出，是在PCR定性技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術。在檢測PRRSV核酸時常用基于SYBR GreenⅠ染料以 及 基 于 TaqMan 探 針 的 FQ－RT－PCR 方法［17－18］。在 FQ－RT－PCR 基 礎 上，Kleiboeker S B等［19］針對PRRSV ORF7基因及3＇UTR保守區(qū)域設計引物及探針，建立了檢測PRRSV歐洲型和美洲型毒株的二重TaqMan FQ－RT－PCR方法。Chen N H等［20］基于 MGB探針，建立了鑒別PRRSV美洲型經(jīng)典毒株與變異毒株的二重FQ－RT－PCR方法。最近，Wernike K等［21］利用3對引物和3條TaqMan探針首次建立了能同時檢測PRRSV美洲型經(jīng)典株、變異株及歐洲型毒株的多重TaqMan FQ－RT－PCR方法。多重 FQ－RT－PCR方法的建立和應用，為快速鑒別檢測日益復雜的PRRSV流行毒株提供了有效的技術手段。

3.3 原位雜交技術

原位雜交技術（in situ hybridization，ISH）在PRRSV檢測中也得到了應用。李雪梅等［22］根據(jù)PRRSV ORF6和ORF7保守序列設計寡核苷酸探針，應用生物素標記，建立了檢測PRRSV核酸的ISH，并應用于感染仔豬組織石蠟切片的檢測。Mostegl M M等［23］建立的ISH，利用甲醛固定、并經(jīng)蛋白酶K處理的組織切片，固定23周后仍能檢測到PRRSV核酸。

3.4 基因芯片技術

基因芯片技術（gene chip technology）是近年發(fā)展起來的一種新型實用的生物技術。郭煥成等［24］根據(jù)PRRSV美洲型經(jīng)典毒株和變異毒株設計擴增美洲型毒株保守序列和Nsp2基因缺失區(qū)域的二重PCR引物，并設計美洲型毒株通用寡核苷酸探針和非缺失株相對于變異株Nsp2基因缺失區(qū)域的探針，成功建立PRRSV經(jīng)典毒株與變異毒株的基因芯片鑒別方法。葉芬等［25］根據(jù)PRRSV、豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型的基因組序列，設計特異性引物和寡核苷酸探針，并將探針按所設計陣列固定于表面經(jīng)氨基化修飾的玻片上，制備出寡核苷酸芯片；通過引物標記及特異性驗證，建立了帶標記引物的多重PCR檢測體系，從而產(chǎn)生大量可與寡核苷酸探針特異性互補的帶標記的DNA片段；將標有熒光染料的擴增產(chǎn)物與芯片上寡核苷酸探針雜交，掃描、分析芯片上熒光信號，其檢測結果與PCR／RT－PCR的符合率高達92%。

3.5 反轉錄－環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）首次出現(xiàn)于2000年，近年開始有應用于PRRSV檢測的報道。Rovira A等［26］分別針對PRRSV美洲型和歐洲型毒株ORF7基因設計2套引物，成功建立了檢測PRRSV的二重反轉錄 LAMP（reverse transcription LAMP，RT－LAMP）。李吉達等［27］針對 PRRSV ORF7基因設計特異性引物，成功建立了能同時檢測PRRSV美洲型經(jīng)典株和變異株的RT－LAMP，其敏感性比RT－PCR高100倍，檢測結果與病毒分離的符合率為100%。而Gao M 等［28］則針對PRRSV最保守的ORF6基因設計一套引物，成功建立了能同時檢測PRRSV美洲型經(jīng)典株和變異株的RTLAMP，其敏感性比RT－PCR高100倍，與FQ－RTPCR相當。RT－LAMP操作簡單，不需復雜的儀器，非常適合基層和現(xiàn)場檢測。

4 其他檢測技術

4.1 聚合酶鏈反應與變性高效液相色譜技術

2012年，楊春華等［29］根據(jù)PRRSV ORF5基因設計特異性引物，利用RT－PCR擴增產(chǎn)物結合變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）技術分析，建立了PRRSV的PCR－DHPLC檢測技術，其靈敏度可達1.0×101拷貝／μL，對16份疑似病料的檢測結果與SYBR Green I FQ－RT－PCR 的符合率為100%。該法可用于臨床PRRSV感染的早期診斷以及分子流行病學調查。

4.2 米氏散射免疫凝集試驗

近年來，Song J Y等［30］利用米氏散射免疫凝集試驗（Mie scattering immunoagglutination assay）制備微流體免疫傳感器，用于檢測PRRSV美洲型毒株。該方法是在Y形的微通道中，抗PRRSV抗體被結合到高度羧酸化的聚苯乙烯微顆粒表面，并與稀釋的PRRSV組織樣本混合?？乖贵w結合引發(fā)微粒免疫凝集反應，這種反應通過微鉗體光纖380nm入射光束的45°角前傾光散射來檢測。該法靈敏度達到10－3TCID50／mL，高于普通 RT－PCR的10TCID50／mL 及 FQ－RT－PCR 的 1TCID50／mL，且耗時短，每個試驗不到5min。在微流體芯片上進行免疫凝集試驗有望發(fā)展成為一種實時檢測動物病原體的重要方法。

5 展望

綜上所述，PRRSV主要檢測技術的研究取得了長足進展，原有的檢測技術得到了改進和提高，同時新的檢測技術不斷涌現(xiàn)和被應用。隨著PRRSV及相關生物技術研究的不斷深入，隨著新理論新技術的不斷出現(xiàn)以及更多新儀器新設備的創(chuàng)造發(fā)明，現(xiàn)有的檢測技術將得到不斷改進，同時全新的檢測技術將會不斷涌現(xiàn)。敏感、特異、快速、簡便、高通量的檢測技術將是發(fā)展的優(yōu)先方向。

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