乙型腦炎核酸疫苗的研究進(jìn)展

王 鳳，湯德元*，曾智勇，馬 萍，李春燕，劉 霞，徐 健

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025，2、貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550008）

乙型腦炎(Japanese encephalitis virus，JEV)，是由乙型腦炎病毒引起的傳染性疾病。該病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害，尤其是近年來集約化養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家損失最為嚴(yán)重。雖然獸醫(yī)科研人員和養(yǎng)豬業(yè)者進(jìn)行多方面的努力，采取了包括種源控制、疫病凈化、消毒隔離和早期斷奶等防治措施，但仍不能禁絕該病的發(fā)生和蔓延。目前預(yù)防乙型腦炎病毒感染的疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗，但由于滅活疫苗存在注射劑量大，需多次注射，效果不穩(wěn)定、免疫力不持久及副作用大等不足之處；我國(guó)研制的SA14-14-2株減毒活疫苗雖然保護(hù)性好，可以很好地刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，但活疫苗畢竟是一種活的微生物，有可能出現(xiàn)毒力反強(qiáng)、帶毒、排毒、垂直傳播、核酸重組等現(xiàn)象，而且通過常規(guī)的血清學(xué)方法一般與自然感染無法區(qū)分。因此，人們?cè)谠O(shè)法利用生物技術(shù)開發(fā)新型基因工程疫苗即核酸疫苗以克服現(xiàn)有疫苗的缺點(diǎn)，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，現(xiàn)將其進(jìn)行如下綜述。

1 乙型腦炎病毒的基因結(jié)構(gòu)及其核酸疫苗候選基因的選擇

1.1 乙型腦炎病毒的基因結(jié)構(gòu)

JEV為單股正鏈RNA病毒，全長(zhǎng)約11kb，整個(gè)基因組由5′端非編碼區(qū)(5′-NCR)和1個(gè)幾乎跨越整個(gè)基因組的單一開放閱讀框(ORF)和3′端非編碼區(qū)( 3′-NCR)構(gòu)成。編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：C蛋白(衣殼蛋白)、PrM/M(膜前體蛋白/膜蛋白)和E蛋白(囊膜糖蛋白)以及7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)，各基因在基因組上的排列順序?yàn)椋?′ -C-PrM/M-E-NSl-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′。

1.2 乙型腦炎病毒核酸疫苗候選基因的選擇

PrM蛋白是未成熟病毒體的一部分，在病毒感染后期，它在被水解為M蛋白后而發(fā)育為成熟的病毒體。PrM蛋白存在感染細(xì)胞內(nèi)未成熟的病毒粒子中，在JEV感染的最后階段，水解成M蛋白。然而，在有些情況下，PrM的剪切可能不完全，結(jié)果使PrM蛋白成為毒粒上能產(chǎn)生中和抗體的附加靶位，免疫含PrM/E的胞外顆?？僧a(chǎn)生中和抗體和保護(hù)性免疫；表達(dá)PrM蛋白或E蛋白的重組痘苗病毒免疫小鼠和豬，可有效保護(hù)JEV的攻擊[1]。而且，JEV糖蛋白容易分泌和表達(dá)在細(xì)胞表面，這些是其作為有效免疫原的重要決定因素。M蛋白是完全疏水的，參與病毒囊膜的構(gòu)成，是病毒囊膜主要結(jié)構(gòu)成分之一，被包埋在囊膜的脂質(zhì)雙層中，它可能與插入脂雙層的E蛋白完全疏水性C端相互作用，對(duì)維持E蛋白空間結(jié)構(gòu)是必需的。Takegami等(1982)對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了研究，認(rèn)為M蛋白參與病毒的感染過程，PrM蛋白是病毒誘發(fā)保護(hù)性免疫的重要協(xié)同成分，M蛋白能誘生具有輕度中和作用的抗體。

E蛋白全長(zhǎng)由500個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量約為53 kD，富含Gly和Ala，Pro含量低，是疏水性的，僅有一的糖基化位點(diǎn)在多數(shù)黃病毒中具有保守性。E蛋白含有病毒血凝素和中和抗原決定簇，為黃病毒屬中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是主要抗原成分，在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的中和抗體及保護(hù)性免疫中起重要作用[2]。此外，E蛋白還與細(xì)胞膜受體相結(jié)合并與細(xì)胞膜融合而使病毒進(jìn)入細(xì)胞，與病毒的吸附、穿入、致病性、組織嗜性、血凝反應(yīng)、血清特異性和誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答等作用緊密相關(guān)。E蛋白上相關(guān)位點(diǎn)的氨基酸變異，對(duì)JEV神經(jīng)毒力及神經(jīng)侵襲力有著重要的影響。另外，JEVE蛋白還是引起宿主機(jī)體免疫及產(chǎn)生中和抗體的主要抗原蛋白，由它形成表面抗原決定簇，具有血凝活性和中和活性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)機(jī)體免受病毒攻擊。

NS1蛋白是一種分泌型糖蛋自，其分子質(zhì)量為40kD，但由于在130位和207位存在N-連接糖鏈，在感染細(xì)胞內(nèi)其實(shí)際分子質(zhì)量為46 kD左右。Mason等(1989)用E.coli來表達(dá)JEV抗原，證實(shí)在JEV感染的細(xì)胞中NS1蛋白以NS1和NS1′2種形式存在，NS1和NS1′在N末端具有相同的序列，NS1′在C末端還存在一段高度疏水的氨基酸序列，該段序列由基因組的NS2a基因編碼。NS1分子質(zhì)量約40kD，NS1′為58 kD。由于NS1和NS1′存在相同的N末端，故有相同的抗原性和生化特性，NS1′是主要的病毒產(chǎn)物，而不是在NS1產(chǎn)生過程中短暫存在的。在細(xì)胞培養(yǎng)液中NS1的量大，可能是因?yàn)镹S1比NS1′更有效地分泌到細(xì)胞外或NS1′在釋放過程中被降解為NS1。NS1蛋白特異性免疫探針與JEV感染細(xì)胞結(jié)合的結(jié)果說明，其分泌于感染細(xì)胞表面。另外，感染細(xì)胞還分泌可溶性的NS1。在NS1′C末端存在一段高度疏水的氨基酸序列，使NS1蛋白存在于細(xì)胞表面成為可能。Mason等在TritionX-100存在的情況下通過超速離心發(fā)現(xiàn)，NS1蛋白的沉降特征發(fā)生了改變，說明NSl蛋白與膜相互作用結(jié)合在一起。NS1在感染細(xì)胞的表面表達(dá)，細(xì)胞外分泌，不但在黃病毒的感染過程中可引起免疫性反應(yīng)，而且這種抗體在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)可起保護(hù)作用，這個(gè)保護(hù)作用依賴抗體的Fc部分，因?yàn)镹S1專一性抗體通過補(bǔ)體依賴途徑殺傷感染的靶細(xì)胞[3]。NS1蛋白不組成毒粒，沒有中和活性和血凝抑制活性，但它具有可溶性補(bǔ)體結(jié)合活性，它可在不出現(xiàn)中和抗體的情況下誘生保護(hù)力，且不產(chǎn)生抗體依賴性增強(qiáng)，加之NS1的基因和表型具有高度同源性。有學(xué)者認(rèn)為黃病毒NS1作為亞單位疫苗比滅活疫苗有優(yōu)勢(shì)[4]。

2 乙型腦炎病毒核酸疫苗研究進(jìn)展

2.1 有關(guān)PrM、E基因核酸疫苗的研究

Ashok MS等[5]構(gòu)建了編碼JEVE蛋白的DNA質(zhì)粒PCMXENV，經(jīng)鼻腔和肌肉途徑接種瑞士小鼠后，進(jìn)行JEV腦內(nèi)接種攻擊試驗(yàn)，結(jié)果顯示：該重組質(zhì)粒對(duì)攻擊感染有一定的保護(hù)作用，免疫鼠血清中未能檢出抗JEV抗體，但產(chǎn)生了低水平的JEV特異性T細(xì)胞增殖。后來其又將E蛋白的全長(zhǎng)基因序列和氨基端398個(gè)氨基酸的基因序列分別克隆到表達(dá)載體發(fā)現(xiàn)：只有后者能產(chǎn)生分泌性表達(dá)；而且與其他DNA疫苗比較，后者可誘導(dǎo)Th1和Th2的增殖反應(yīng)，在小鼠能產(chǎn)生最高水平(71%)的抗攻擊保護(hù)。E基因全長(zhǎng)DNA疫苗在小鼠體內(nèi)只能誘導(dǎo)低水平的中和抗體，認(rèn)為保護(hù)作用可能主要與細(xì)胞免疫有關(guān)[6]。

Konishi等 (1998)以 pcDNA3.1為載體構(gòu)建了含JEV中山株前膜信號(hào)肽(S)、PrM、E基因cDNA的重組質(zhì)粒pcDNA3.1JEME，將此質(zhì)粒100μg肌注小鼠，間隔2周再注100μg，2～3周之后采血測(cè)定中和抗體，滴度為1∶640，用P3株l04ID50腹腔攻擊，100%(5/5)存活，若用10pg質(zhì)粒，中和抗體為1∶320，存活率100%，免疫持久性至少為6個(gè)月。

Chang等[7]構(gòu)件了表達(dá)PrM和E蛋白的質(zhì)粒DNA，由巨細(xì)胞病毒立即早期基因啟動(dòng)子控制，將該質(zhì)粒導(dǎo)入COS-1細(xì)胞，COS-1細(xì)胞向培養(yǎng)液中分泌細(xì)胞外病毒樣顆粒，用這種DNA疫苗免疫雌性小鼠，產(chǎn)生中和抗體滴度在1∶20到1∶160之間，用5 000 PFU強(qiáng)毒株SA14腹腔注射攻毒，對(duì)其子代的保護(hù)率在40%到100%之間。免疫7周齡的成年小鼠，3 d后用5 000 PUF強(qiáng)毒株SA14攻毒，小鼠得到完全保護(hù)。Chang等的研究表明，所有接種1次JEV DNA疫苗的小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生JEV特異性的抗體，且至少維持18個(gè)月。3周齡小鼠免疫后100%血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，中和抗體效價(jià)達(dá)1∶20～1∶160。獲得100%的動(dòng)物保護(hù)。

Chen(1999)等利用真核表達(dá)載體分別重組構(gòu)建了JEVE蛋白以及其他蛋白基因片段，通過比較上述重組質(zhì)粒在分別免疫動(dòng)物后所產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)與保護(hù)性免疫效果，發(fā)現(xiàn)含JEV E蛋白編碼基因的質(zhì)粒DNA所致的中和抗體效價(jià)以及保護(hù)性免疫結(jié)果明顯優(yōu)于其他蛋白基因片段，用編碼JEV E蛋白的質(zhì)粒免疫小鼠，與滅活疫苗比較，結(jié)果產(chǎn)生了更持久和更強(qiáng)的JEVE蛋白特異性抗體，且對(duì)JEV的致死攻擊具有高度保護(hù)作用。

Konishi等[8]構(gòu)建了2株基于PrM和E基因的DNA疫苗，并進(jìn)行了免疫試驗(yàn)。結(jié)果表明以100～450 μg劑量間隔3周對(duì)豬進(jìn)行二次免疫，免疫后第1周即產(chǎn)生HI抗體和中和抗體，并可維持245 d的高滴度HI抗體水平。試驗(yàn)還證明當(dāng)以PrM/E質(zhì)粒DNA疫苗免疫小鼠后，取其脾細(xì)胞在體外刺激后可檢測(cè)出CTL活性，而血清中未能檢測(cè)出中和抗體。但當(dāng)小鼠接受JEV攻擊后，由于DNA免疫小鼠存在記憶性B細(xì)胞和T輔助細(xì)胞，中和抗體的滴度迅速上升，并足以保護(hù)小鼠抵抗JEV的攻擊。他們認(rèn)為這也許是免疫動(dòng)物獲得保護(hù)的機(jī)制。Konishi等還發(fā)現(xiàn)含病毒PrM與E蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒DNA在免疫動(dòng)物后不僅誘導(dǎo)出特異性的CTL細(xì)胞參與細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且可產(chǎn)生特異性B細(xì)胞參與體液免疫反應(yīng)，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)在免疫動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體的效價(jià)與所維持時(shí)間都明顯高于普通滅活疫苗的免疫結(jié)果，說明了DNA疫苗在預(yù)防JEV感染方面的試驗(yàn)研究的可行性。

據(jù)報(bào)道，基因槍免疫所需的DNA量?jī)H為肌注免疫所需量的1/100～1/200，就可獲得相近的抗體反應(yīng)。Chen等的研究結(jié)果不但證實(shí)這一結(jié)論，而且認(rèn)為不同的DNA免疫途徑產(chǎn)生的抗體亞型和親和力也不同。

Kaur R等[9]用合成分泌型或膜錨定型JEV的PrM和E蛋白的質(zhì)粒經(jīng)肌注或基因槍接種小鼠發(fā)現(xiàn)：E蛋白的2種表達(dá)類型均能誘導(dǎo)較高的中和抗體滴度，而肌注較基因槍方法能誘導(dǎo)更高水平的抗E抗體反應(yīng)；認(rèn)為肌注可能誘導(dǎo)以Th1為主的免疫反應(yīng)，而基因槍接種誘導(dǎo)Th2為主的免疫反應(yīng)；在小鼠對(duì)JEV腦內(nèi)接種的攻擊感染可提供60%的保護(hù)。

Mohammad[10]等以小鼠作為模型，用抗原提呈細(xì)胞和巨細(xì)胞病毒對(duì)JEVE蛋白的表達(dá)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，并采用免疫熒光法和Western印跡檢測(cè)，結(jié)果抗原提呈細(xì)胞和巨細(xì)胞病毒都能刺激小鼠產(chǎn)生的抗體滴度增加，但是巨細(xì)胞病毒刺激小鼠產(chǎn)生的抗體滴度更高。更重要的是，由原提呈細(xì)胞啟動(dòng)執(zhí)導(dǎo)的免疫反應(yīng)偏向Th1型。

prM基因和E基因，分別在N-15和N-154的位置有一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，Yu Zhang等分別在prM基因和E基因的N-連接糖基化位點(diǎn)進(jìn)行突變處理來構(gòu)建DNA疫苗，該DNA疫苗免疫小鼠的結(jié)果表明，E基因N-154糖基化位點(diǎn)突變的DNA疫苗能使小鼠分泌IL-4的水平升高和產(chǎn)生更大滴度IgG，獲得完全保護(hù)。因此，E蛋白N-154糖基化位點(diǎn)突變能增強(qiáng)誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，表明這種突變可作為針對(duì)乙腦潛在的DNA疫苗。

2.2 有關(guān)NS1基因核酸疫苗的研究

Lin等用編碼JEV PrM/E、NS1基因的質(zhì)粒DNA皮下接種小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，編碼PrM/E蛋白的質(zhì)粒DNA免疫小鼠攻擊強(qiáng)毒后有70%的小鼠受保護(hù)，而用編碼NS1的質(zhì)粒免疫小鼠，強(qiáng)毒攻擊后可獲得90%的保護(hù)。NS1質(zhì)粒免疫的小鼠雖未檢測(cè)到中和抗體，但對(duì)乙腦病毒感染的細(xì)胞在補(bǔ)體參與條件下有很強(qiáng)的溶解細(xì)胞作用。用C末端多出60個(gè)氨基酸的NS1核苷酸序列(NS1′)的質(zhì)粒免疫小鼠卻經(jīng)不住強(qiáng)毒的攻擊。生化分析表明，NS1很容易分泌大量的同型二聚體并表達(dá)于細(xì)胞表面，NS1′卻不能，且NS2a會(huì)下調(diào)NS1基因疫苗的效果。不管是用抗NS1單抗被動(dòng)免疫，或者是用NS1蛋白主動(dòng)免疫，均證明黃病毒NS1具有激發(fā)保護(hù)性免疫的表位，證實(shí)NS1足夠引發(fā)保護(hù)性免疫。然而，早期許多學(xué)者以痘苗病毒、Sindbis病毒和桿狀病毒等重組病毒為載體的研究表明，JEV的NS1只能對(duì)宿主產(chǎn)生低水平的保護(hù)作用。這種差異可能由于使用不同的表達(dá)系統(tǒng)和不同的NS1序列。也有可能是在病毒載體的存在下，NS1只能作為很弱的免疫原或多余的NS2A的一些序列可能是導(dǎo)致NS1不能產(chǎn)生有效免疫保護(hù)的原因，這些結(jié)果與以往對(duì)登革熱的研究結(jié)果相符，重組痘苗病毒含登革熱NS1可完全保護(hù)登革熱病毒的攻擊，但在NS1加上15%的NS2a序列后，就不能獲得相似結(jié)果。

使用核酸疫苗進(jìn)行免疫既能消除在活疫苗制備中存在的不必要抗原所致的免疫應(yīng)答，又不必顧慮感染因子所帶來的諸多問題，而且能夠誘導(dǎo)廣泛的體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答，有助于產(chǎn)生高水平保護(hù)性免疫[11]。但核酸疫苗效力的好壞也取決于許多因素，如抗原自身的特性、免疫途徑、是否使用佐劑或使用佐劑的類型等，所以現(xiàn)在人們對(duì)影響核酸疫苗效力的各種因素展開了研究[12]。如果核酸疫苗潛在的安全性和接種方法能夠得到解決和改進(jìn)，將具有很大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

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