一種新型含硒席夫堿與人血清白蛋白相互作用的研究

劉 潔，劉文舉，吳鳴虎

（湖北科技學院核技術與化學生物學院，湖北 咸寧437100）

硒是人體必需的微量元素之一，在防癌、抑癌方面發(fā)揮著重要作用［1］，其中有機含硒化合物因其對機體毒性較低且抑癌作用較好而得到研究者的廣泛關注。席夫堿類藥物具有抑菌、殺菌、抗癌、抗病毒活性［2］。基于此，課題組設計合成出新型含硒席夫堿2－芐基亞胺基次甲基－4－（3－芐基亞胺基次甲基－4－羥基－苯硒基）苯酚（BBHP），以期利用硒和席夫堿在生物體內的協同效應，發(fā)揮更優(yōu)良的生物活性。

人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）是人體循環(huán)系統中最主要的水溶性蛋白質，具有多種生理功能。藥物進入血漿后通過與人血清白蛋白結合參與血液循環(huán)，從而被運送到身體各部位。因此，研究藥物與人血清白蛋白的相互作用，對了解藥物在體內的分布、緩釋、代謝及排泄方式等很有幫助。目前的研究多以白蛋白為實驗模型，從不同角度研究其與藥效小分子間的相互作用，而鮮見有關含硒席夫堿與人血清白蛋白相互作用的研究報道。

作者在模擬人體生理條件下，采用紫外吸收光譜法和熒光光譜法（熒光猝滅光譜和同步熒光光譜）研究新型含硒席夫堿BBHP與HSA相互作用的光譜特征，得到關于兩者作用機理、結合常數、結合位點數、作用力類型、結合距離以及構象變化等方面的信息，以期為進一步研究含硒席夫堿類藥物的藥理作用、生物學效應提供重要參考。

1 實驗

1．1 試劑與儀器

HSA，Sigma公司分裝；2－芐基亞胺基次甲基－4－（3－芐基亞胺基次甲基－4－羥基－苯硒基）苯酚（BBHP），自行合成；Tris，生化試劑；鹽酸、氯化鈉等均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

F－4500型熒光光譜儀、UV2300型紫外可見分光光度儀，日本日立公司；PHS－3C型酸度計，上海今邁儀器儀表公司；AYU120型分析天平，日本島津；SC－15A型超級恒溫槽，蘇州宏拓電子有限公司。

1．2 方法

HSA的濃度為1×10－5mo1·L－1，用pH＝7．4的含0．20mol·L－1NaCl的 Tris－HCl緩沖溶液配制。BBHP的濃度為2×10－3mo1·L－1，用微量注射器移取適量注入HSA溶液中，混勻，保溫靜置。調節(jié)紫外可見分光光度儀狹縫1．5nm，記錄各溶液在298 K下200～350nm范圍的紫外吸收光譜。進行熒光測定時激發(fā)和發(fā)射狹縫均固定為5．0nm。掃描得HSA最大激發(fā)波長為287nm，以287nm作為激發(fā)光，測定并記錄各溶液在不同溫度（290K、298K和306K）下295～500nm的熒光光譜。調節(jié)λex＝λem，繪制各溶液在298K下250～750nm的共振光散射光譜。分別調節(jié)Δλ（即λem－λex）為15nm和60nm，測定各溶液在298K下的同步熒光光譜。

2 結果與討論

2．1 體系特征光譜

2．1．1 熒光光譜

HSA的內源熒光主要來源于其分子中含有的色氨酸和酪氨酸等芳香氨基酸殘基。受287nm的光激發(fā)，HSA在345nm附近產生很強的熒光峰，而相同條件下BBHP沒有熒光信號，說明過量的BBHP對HSA的熒光強度不發(fā)生干擾。同時HSA的熒光強度隨BBHP的加入迅速而有規(guī)律地降低，且熒光峰位有小幅移動（圖1），顯示BBHP與HSA之間可能存在相互作用。

圖1 BBHP對HSA熒光光譜的影響Fig．1 Fluorescence spectra of HSA in the presence of different concentrations of BBHP

2．1．2 紫外吸收光譜（圖2）

由圖2可知，隨著BBHP的加入，HSA在220～230nm及280nm附近的吸收增強，且吸收峰均有明顯位移，說明HSA分子中生色團所處微環(huán)境可能發(fā)生了變化［3］。此外，BBHP在287．5nm處的吸收峰非常弱（A＜0．045），因此，BBHP對 HSA的內濾效應可以忽略。

2．2 猝滅機理的判別

圖2 BBHP對HSA紫外吸收光譜的影響Fig．2 UV Absorption spectra of HSA in the presence of BBHP

熒光猝滅是指熒光物質與猝滅劑發(fā)生作用，使熒光強度降低或者消失的現象。引起熒光猝滅的原因通常為動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅以及能量轉移中的一種或幾種［4］。動態(tài)猝滅是熒光物質處于激發(fā)態(tài)的分子與猝滅劑碰撞、以非輻射形式釋放能量，其猝滅過程依賴于擴散，一般隨溫度升高猝滅得以增強；因為動態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光物質激發(fā)態(tài)分子的作用，并不改變其基態(tài)物質濃度，所以加入猝滅劑前后體系的紫外吸收基本不發(fā)生變化。靜態(tài)猝滅是熒光物質處于基態(tài)的分子與猝滅劑生成不發(fā)熒光的復合物，從而導致熒光物質熒光強度降低的過程；因為基態(tài)物質濃度發(fā)生變化，通常會導致紫外吸收光譜的改變，因此，可以通過比較加入猝滅劑前后體系的紫外吸收光譜是否發(fā)生改變來判斷是否存在靜態(tài)猝滅。

由圖2可知，加入藥物小分子BBHP后，HSA的紫外吸收光譜發(fā)生了改變，吸收峰藍移（從278．5nm移至276．0nm）；且體系的吸收光譜并不是兩者的簡單疊加，說明BBHP與HSA結合形成了新的化合物［5］。因此，形成復合物的靜態(tài)猝滅是引起體系熒光強度降低的一個重要方面。

在熒光猝滅過程中，猝滅劑（BBHP）和熒光物質（HSA）之間的相互作用遵循Stern－Volmer方程：

式中：F0、F分別為不加BBHP、加BBHP時HSA的熒光強度；［Q］為 BBHP的濃度；KSV為 Stern－Volmer猝滅常數，L·mol－1；τ0為 HSA單獨存在時自身的熒光壽命，約為10－8s；K為BBHP對 HSA 的q表觀猝滅速率常數，L·mol－1·s－1。

已知水溶液中猝滅劑對蛋白質的最大受擴散控制的表觀猝滅速率常數 Kq為2．0×1010L·mol－1·s－1［6］，若猝滅劑與蛋白質的熒光猝滅過程為單一動態(tài)猝滅時，KSV應小于200L·mol－1。

分別繪制不同溫度（290K、298K和306K）下的BBHP－HSA體系的Stern－Volmer曲線，由斜率可得猝滅常數KSV的數值，結果見圖3。

圖3 不同溫度下的BBHP－HSA體系的Stern－Volmer曲線Fig．3 The Stern－Volmer plots of BBHP－HSA system at different temperatures

由圖3可知，3個溫度下KSV均遠大于200L·mol－1，進一步表明動態(tài)猝滅不是HSA發(fā)生熒光猝滅的主要原因。同時，溫度升高時KSV增大，這一現象可以解釋為靜態(tài)猝滅形成的復合物的穩(wěn)定性可能隨溫度升高而增強，或者在BBHP對HSA的熒光猝滅過程中動態(tài)猝滅的影響并不能完全忽略［7］。

2．3 表觀結合常數及結合位點數

如上所述，BBHP對HSA的熒光猝滅主要是形成復合物的靜態(tài)猝滅，若BBHP與HSA作用時有n個相同且獨立的結合位點，其結合常數Kb與結合位點數n可由式（2）求出：

繪制不同溫度下的lg［（F0／F）－1］～lg［Q］雙對數曲線，由斜率和截距可得Kb和n的數值，結果列于表1。

表1 不同溫度下的結合常數Kb、結合位點數n及熱力學參數Tab．1 Binding constant Kb，binding sites nand thermodynamic parameters at different temperatures

由表1可知，290K、298K、306K時的結合常數Kb分別為1．881×106L·mol－1、1．392×106L·mol－1和5．688×105L·mol－1，說明BBHP與 HSA之間有較強的結合作用，可以被HSA所儲存和運輸。當溫度升高時，Kb值降低，說明形成的化合物不穩(wěn)定，在溫度升高時可能部分分解，因此經HSA攜帶的藥物BBHP可以釋放出來，從而實現治療的效果。此外不同溫度下的結合位點數均稍大于1，說明含硒席夫堿BBHP除了與HSA的特征結合部位形成1個結合位點外，還與其表面的其它官能團發(fā)生了相互作用。

2．4 作用力類型

由于實驗過程中溫度變化范圍不大，因此可假設焓變?yōu)槎ㄖ担瑒tΔH 和熵變ΔS可由式（3）求得：

式（3）中的K相當于對應溫度下的結合常數Kb。吉布斯自由能變ΔG可由式（4）求得：

繪制lnK～1／T曲線，結合式（4）計算熱力學常數，結果列于表1。

藥物小分子與蛋白質大分子間的作用力通常包括靜電引力、疏水作用力、氫鍵以及范德華力，均屬于分子間的弱相互作用力［8］。主要作用力類型之間的規(guī)律：ΔH＞0、ΔS＞0，為疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＜0，為氫鍵和范德華力；ΔH≈0、ΔS＞0，為靜電引力［9］。由表1可知，BBHP與HSA之間的結合反應是自發(fā)的（ΔG＜0），作用力主要為氫鍵和范德華力（ΔH＜0、ΔS＜0）。

2．5 結合距離

如果猝滅劑小分子的吸收光譜與熒光分子的發(fā)射光譜之間有較大程度重疊，說明兩者之間存在能量轉移，包括輻射能量轉移（即內濾效應）和依賴于分子間距的非輻射能量轉移。根據Frster的偶極－偶極非輻射能量轉移理論［10］，可以計算BBHP與HSA結合時結合位置與HSA中熒光發(fā)射基團之間的距離。

式中：E為轉移效率；F0為與BBHP作用前HSA的熒光強度；F為HSA和BBHP摩爾比為1∶1時HSA的熒光強度；r為HSA和BBHP之間的距離；R0為轉移效率為50%時的臨界距離，可由式（6）求出：

式中：K2為偶極子BBHP和HSA的空間取向因子；n為溶液介質的折射指數；Ф為HSA的熒光量子產率；J為BBHP吸收光譜與HSA熒光光譜的光譜重疊積分面積，即：

式中：F（λ）為 HSA在波長λ處的熒光強度；ε（λ）為BBHP在波長λ處的摩爾吸光系數。

BBHP的吸收光譜與HSA的熒光光譜見圖4。

圖4 BBHP的吸收光譜（a）和HSA的熒光光譜（b）重疊圖Fig．4 Spectral overlap of BBHP absorption spectrum（a）with HSA fluorescence spectrum（b）

按式（7）采用自編的計算機積分程序，求出圖4中BBHP與HSA摩爾比為1∶1時光譜重疊積分面積J為4．89×10－15cm3·L·mol－1。取 K2為2／3、n為1．336、Φ 為0．118［11］，結合J的數值一起代入式（6）求出R0＝2．21nm；根據式（5）以及熒光數據求出能量轉移效率E＝0．367；綜合R0、E 的值，再由式（5）算出HSA分子內熒光基團即氨基酸殘基與BBHP分子間的平均距離r＝2．42nm，說明BBHP與HSA之間足夠靠近（r＜7nm），存在非輻射能量轉移，從而促使HSA的熒光猝滅。r＞R0，說明對于蛋白質的熒光猝滅，非輻射能量轉移的影響比靜態(tài)猝滅小，即靜態(tài)猝滅是BBHP引起HSA熒光猝滅的主要原因［12］。此外，已有研究表明HSA疏水腔結構域Ⅲ中的脂肪酸與其214位色氨酸殘基之間的距離為2．3nm［13］，此值與BBHP和HSA之間的結合距離2．42nm非常接近，因此可認為與BBHP結合的主要是HSA分子中的色氨酸殘基。

2．6 BBHP對HSA構象的影響

研究表明采用不同波長差掃描得到的蛋白質同步熒光光譜可以反映出不同氨基酸基團的信息，如Δλ＝15nm和Δλ＝60nm時分別顯示酪氨酸和色氨酸殘基的特征光譜［14］。同時蛋白質所處微環(huán)境的極性變化會影響其分子中氨基酸殘基的最大發(fā)射波長的位置，極性增強即疏水性減弱時最大發(fā)射波長紅移；反之，極性減弱即疏水性增強時最大發(fā)射波長藍移。保持HSA濃度不變，逐步加入BBHP，分別繪制Δλ＝15 nm和Δλ＝60nm時的同步熒光光譜，如圖5所示。

圖5 BBHP－HSA體系的同步熒光光譜Fig．5 Synchronous fluorescence spectra of BBHP－HSA system

由圖5可知，實驗條件下，HSA的熒光強度主要由色氨酸殘基貢獻（約為酪氨酸強度的3．4倍）；當逐漸加入BBHP時，酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長基本不變，說明BBHP的加入未改變酪氨酸殘基的微環(huán)境；色氨酸殘基的最大發(fā)射波長紅移，說明BBHP加入后主要改變色氨酸殘基所處微環(huán)境，使其疏水性降低，也即作用位點距離色氨酸更近（與結合距離求算的結果一致）。

3 結論

應用紫外吸收光譜和熒光光譜研究了新型含硒席夫堿2－芐基亞胺基次甲基－4－（3－芐基亞胺基次甲基－4－羥基－苯硒基）苯酚（BBHP）與人血清白蛋白（HSA）之間的相互作用。結果表明，在生理pH值條件下BBHP主要通過形成復合物的靜態(tài)猝滅方式使HSA的內源熒光得以強烈猝滅；BBHP與HSA主要有1個結合位點數，298K時的結合常數為1．392×106L·mol－1；該結合反應為自發(fā)的放熱過程，相互作用力主要為氫鍵和范德華力。根據Frster無輻射能量轉移理論計算了兩者之間的結合距離r＝2．42nm，同時考察了BBHP對HSA構象的影響。

［1］Rayman M P．Selenium in cancer prevention：A review of the evidence and mechanism of action［J］．The Proceedings of the Nutrition Society，2005，64（4）：527－542．

［2］Xiang Y L，Wu F Y．Study of the interaction between a new Schiff－base complex and bovine serum albumin by fluorescence spectroscopy［J］．Spectrochimi Acta Part A：Mol Biomol Spectrosc，2010，77（2）：430－436．

［3］Lin H，Lan J F，Guan M，et al．Spectroscopic investigation of interaction between mangiferin and bovine serum albumin［J］．Spectrochimi Acta Part A：Mol Biomol Spectrosc，2009，73（5）：936－941．

［4］Yu X Y，Yang Y，Lu S Y，et al．The fluorescence spectroscopic study on the interaction between imidazo［2，1－b］thiazole analogues and bovine serum albumin［J］．Spectrochimi Acta Part A：Mol Biomol Spectrosc，2011，83（1）：322－328．

［5］Naik P N，Chimatadar S A，Nandibewoor S T．Interaction between apotent corticosteroid drug－dexamethasone with bovine serum albumin and human serum albumin：A fluorescence quenching and Fourier transformation infrared spectroscopy study［J］．Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology，2010，100（3）：147－159．

［6］Cui F L，Qin L X，Zhang G S，et al．A concise approach to 1，11－didechloro－6－methyl－4′－O－demethyl rebeccamycin and its binding to human serum albumin：Fluorescence spectroscopy and molecular method［J］．Bioorganic and Medicinal Chemistry，2008，16（16）：7615－7621．

［7］Xu H，Liu Q W，Wen Y Q．Spectroscopic studies on the interaction between nicotinamide and bovine serum albumin［J］．Spectrochimi Acta Part A：Mol Biomol Spectrosc，2008，71（3）：984－988．

［8］謝郢，李永成，楊立云，等．替加氟與牛血清白蛋白相互作用的研究［J］．化學與生物工程，2010，27（9）：48－52．

［9］Rohman M H，Maruyama T，Okada T，et al．Study of interaction of carprofen and its enantiomers with human serum albumin－Ⅰ．Mechanism of binding studied by dialysis and spectroscopic methods［J］．Biochemical Pharmacology，1993，46（10）：1721－1731．

［10］Valeur B．Molecular Fluorescence：Principles and Applications［M］．Weinheim：Wiley－VCH，2001：119－123．

［11］Cui F L，Fan J，Li W，et al．Fluorescence spectroscopy studies on 5－aminosalicylic acid and zinc 5－aminosalylicylate interaction with human serum albumin［J］．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2004，34（1）：189－197．

［12］謝孟峽，徐曉云，王英典，等．4′，5，7－三羥基二氫黃酮與人血清白蛋白相互作用的光譜學研究［J］．化學學報，2005，63（22）：2055－2062．

［13］陳澤忠，馮鋒，楊文娟，等．左氧氟沙星與牛血清白蛋白相互作用的液滴熒光法研究［J］．光譜學與光譜分析，2008，28（7）：1612－1616．

［14］欒強，朱蓓薇，徐同寬．熒光光譜法研究左西孟旦與牛血清白蛋白的結合反應［J］．分析試驗室，2008，27（6）：57－60．