脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的快速分離純化及其抗體制備

洪淑娟，傅堅英，曹 娟，喻子牛，張吉斌（華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北 武漢430070）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），又稱嘔吐毒素［1］，為雪腐鐮刀菌烯醇（Nivalenol，NIV）的4－脫氧衍生物，屬于單端孢霉烯族化合物?，F(xiàn)已證實，禾谷鐮刀菌、擬枝鐮刀菌、梨孢鐮刀菌等多種鐮刀菌株以及頭孢菌屬、漆班菌屬、木霉屬等真菌都可產(chǎn)生DON［2］。

DON是一種霉菌毒素（Mycotoxin），對糧食、飼料和食品的污染非常普遍，對該毒素進(jìn)行分離檢測十分重要。由于目前市場上DON供應(yīng)少，購買困難且價格昂貴，因此，有必要建立有效的DON分離純化方法，為相關(guān)研究提供材料。真菌代謝毒素物質(zhì)的分離純化方法主要采用凝膠色譜法、硅膠層析法、離子交換法等，一般存在耗時長、回收率不高或一次處理樣品量少等缺點。高速逆流色譜法（High－speed counter－current chromatography，HSCCC）［3－5］不使用固相載體作固定相，不僅費用低，避免了固相載體帶來的樣品預(yù)處理要求高、因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活變性等問題［6，7］，而且回收率高、分離量大。

免疫原的分子量一般在40 000以上。小分子物質(zhì)的抗體制備相對于完全抗原來說較難。分子量小于5000的物質(zhì)（半抗原）不足以達(dá)到刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)抗體的要求，需要與載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性［8］。目前，對于分子中含有－COOH或可羧化的－OH的半抗原的偶聯(lián)方法通常是：加入琥珀酸酐使－OH乙?；珊恤然陌肟乖僭谔蓟啺罚―CC）催化下，與載體蛋白的氨基反應(yīng)，制備完全抗原。

作者將高速逆流色譜法與高效液相色譜法相結(jié)合，快速從禾谷鐮刀菌固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化DON，并將得到的高純度DON用于其抗體制備。

1 實驗

1．1 動物、試劑與儀器

雌性Balb／C小鼠，編號1＃～3＃。

乙酸乙酯（分析純），甲醇（色譜純），蒸餾水，4－二甲氨基吡啶（DMAP），琥珀酸酐（HS），牛血清白蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA），福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑，DON標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma－Aldrich公司），四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物A液和B液。

TBE－300A型高速逆流色譜儀，上海同田生化技術(shù)有限公司；ATKA Prime泵系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)及組分收集系統(tǒng)；溫控恒溫水浴鍋，北京博康醫(yī)療器械有限公司；LC－2010型高效液相色譜儀，日本島津；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生；冷凍干燥機、超凈工作臺，上海博訊；ZDX－35BI型蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；生化恒溫培養(yǎng)箱，黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司；離子阱－飛行時間液質(zhì)聯(lián)用儀（LC／MS IT－TOF）；基質(zhì)輔助激光解吸附電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI－TOFMS）。

1．2 菌株與培養(yǎng)基

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）R6576，由西北農(nóng)林科技大學(xué)真菌研究所提供。

PDA固體培養(yǎng)基：蔗糖2g，馬鈴薯20g，瓊脂粉1．5g，蒸餾水100mL。

CMC液體培養(yǎng)基：纖維素1．5g，硝酸銨0．02g，酵母抽提物0．1g，蒸餾水100mL。

大米培養(yǎng)基：大米100g，蒸餾水50mL。

1．3 DON粗提物的制備

（1）菌株培養(yǎng)：挑取少量禾谷鐮刀菌菌塊于PDA固體培養(yǎng)基中央，在28℃、相對濕度75%條件下培養(yǎng)3～5d，菌絲呈白色，中央菌塊呈玫瑰色。

（2）孢子液的制備：挑取上述菌絲接種于100mL CMC液體培養(yǎng)基，置于28℃、200r·min－1的搖床培養(yǎng)，期間顯微鏡觀察，直至孢子部分或完全釋放后，即制得孢子液。

（3）固體發(fā)酵：接種1%（質(zhì)量體積比）的上述孢子液于已滅菌的3瓶大米培養(yǎng)基內(nèi)，攪拌均勻后，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使大米最大程度地被真毒侵染，并不定期攪拌，使菌體均衡生長。

（4）DON粗提物的制備：向發(fā)酵的大米培養(yǎng)基內(nèi)加入600mL甲醇，室溫下?lián)u床振蕩過夜后，收集濾液，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮以除去甲醇和大部分水，濃縮液再進(jìn)行真空冷凍干燥后，作為高速逆流色譜的樣品，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 高速逆流色譜法分離

分別將500mL乙酸乙酯、500mL水加入到分液漏斗中，搖勻后靜置分層，上相作為固定相、下相作為流動相。將固定相以30mL·min－1的流速泵入高效逆流色譜儀主機的螺旋柱中，直至固定相流出達(dá)到平衡后，以正轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速890r·min－1［9］、流速1mL·min－1泵入樣品。將DON粗提物溶于20mL流動相中，注入樣品環(huán)，采用紫外檢測器（檢測波長為254nm）監(jiān)測，根據(jù)色譜圖收集各餾分。

1．5 高效液相色譜法分離和分析

采用高效液相色譜儀對經(jīng)高速逆流色譜分離后各餾分進(jìn)行純化；通過比較待鑒定化合物與DON標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時間進(jìn)行定性。

色譜條件：Waters Symmetry C18色譜柱（5μm，4．6mm×250mm），流動相為甲醇－水（2∶8，體積比），檢 測 波 長2 1 8nm，流 速1mL·min－1，柱 溫25．0℃。

1．6 DON人工抗原合成

（1）半抗原DON－HS的合成

稱取7mg DON、85mg HS、2mg DMAP于1．5 mL 離心管內(nèi)［10，11］，加入1．2mL 脫水丙酮，并充分振蕩使其完全溶解，置于80℃水浴鍋反應(yīng)4h（期間間歇補加脫水丙酮），反應(yīng)結(jié)束后氮氣吹干剩余丙酮；加入400μL蒸餾水，超聲溶解管內(nèi)物質(zhì)，再加入800μL乙酸乙酯，充分混合后，超聲溶解15min，保留含DONHS的乙酸乙酯層［12］。

（2）人工抗原 DON－BSA的合成

稱取10mg BSA溶于2．5mL 0．13mol·L－1的NaHCO3溶液中，置于磁力攪拌器上，攪拌下加入DON－HS，于4℃ 反應(yīng)20h，將反應(yīng)液置于0．01mol·L－1PBS（pH 值7．4）中透析3d，期間每隔24h換液1次，透析后的物質(zhì)即為免疫原DON－BSA，真空冷凍干燥，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

包被原DON－OVA的合成方法同免疫原。

1．7 MALDI－TOF－MS質(zhì)譜鑒定DON人工抗原

將DON－BSA偶聯(lián)物用超純水溶解成濃度為1mg·mL－1的樣品，進(jìn)行 MALDI－TOF－MS質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜條件：采樣方法為線性高分子量陽離子模式，處理方法為線性高分子量內(nèi)標(biāo)法，激光強度為4500，分子量范圍為20 000～100 000Da，采樣次數(shù)為800次，上樣量為0．3μL，MALDI基質(zhì)為alpha－Cyano－4－h(huán)ydroxy－cinnamic。

1．8 多克隆抗體制備、效價測定

取6～8周齡、體重20g左右的雌性Balb／C小鼠3只，將免疫原DON－BSA稀釋至1mg·mL－1，與福氏完全佐劑以1∶1的比例乳化，經(jīng)腹腔和皮下多點注射。初次免疫劑量為每只250μg。以后每隔14d免疫1次，免疫方法同初次免疫，但所用免疫原采用福氏不完全佐劑乳化。采用眼眶靜脈叢采血，采第3次免疫血清，4℃過夜后，離心，收集上清，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用間接酶聯(lián)免疫分析法（C－ELISA）測定多克隆抗體的效價，具體步驟如下：（1）用pH值9．6的0．05 mol·L－1碳酸鹽緩沖溶液稀釋DON－OVA至終濃度為20μg·mL－1，包被酶標(biāo)板，每孔100μL，4℃過夜；（2）PBST洗滌3次，用0．5%的卵清蛋白溶液封阻，每孔200μL，37℃孵育1h，PBST洗滌4次，拍干；（3）將小鼠多克隆抗體及陰性血清稀釋成以下濃度：1∶4000、1∶10 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000，每孔100μL橫向加入孔內(nèi)，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，拍干；（4）加入 HRP－標(biāo)記羊抗鼠二抗IgG（1∶3000稀釋度），每孔100μL，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，每次3min，拍干；（5）等體積混合TMB底物A液和B液，盡快加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100μL，37℃顯色5min，加2mol·L－1H2SO4溶液終止，每孔50 μL，設(shè)置酶標(biāo)儀波長450nm，讀數(shù)；（6）結(jié)果判定：P／N≥2．0，判為陽性（P、N分別為實驗組小鼠和陰性小鼠血清的OD450值）。呈陽性時，血清的最大稀釋倍數(shù)即為該血清的效價。

2 結(jié)果與討論

2．1 高速逆流色譜分離結(jié)果（圖1）

圖1 DON粗提物的高速逆流色譜Fig．1 The high－speed counter－current chromatogram of crude extract of DON obtained

由圖1可知，DON粗提物經(jīng)高速逆流色譜分離后，有兩個主要的色譜峰（A和B），將A、B所分布時間段的餾分合并，分別命名為餾分A、餾分B。色譜峰A峰形不規(guī)則，說明其應(yīng)該由多種化合物產(chǎn)生，而色譜峰B規(guī)則、對稱，說明其有可能由單一的化合物產(chǎn)生。根據(jù)高速逆流色譜在正轉(zhuǎn)工作模式下，極性較大的化合物先出峰的原理，初步判定DON有可能存在于餾分B中。

2．2 高效液相色譜分離和分析結(jié)果

將高速逆流色譜分離收集得到的各餾分再分別經(jīng)高效液相色譜分離。結(jié)果只有餾分B的高效液相色譜（圖2）中具有與DON標(biāo)準(zhǔn)品相同保留時間的色譜峰，據(jù)此，可以初步判斷餾分B中含有DON。收集含有DON色譜峰的餾分，真空冷凍干燥后，得到DON純化樣品。該純化樣品中含有的化合物主要為DON（圖2）。

通過外標(biāo)法定量分析，從300g大米發(fā)酵培養(yǎng)物中共得到8mg DON純化樣品，純度為97．7%。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品、純化樣品和餾分B的高效液相色譜Fig．2 The HPLC spectra of standard，purified sample and distillation cut B

2．3 LC／MS IT－TOF質(zhì)譜鑒定半抗原合成

DON分子量為296．1，羥基進(jìn)行隨機乙酰化后進(jìn)行LC／MS IT－TOF檢測，結(jié)果見圖3。

圖3 DON－HS的LC／MS IT－TOF質(zhì)譜圖Fig．3 The LC／MS IT－TOF pattern of DON－HS

由圖3可知，質(zhì)荷比［M－H］＋＝495．1440，表明DON分子連有2個琥珀酸酐分子，質(zhì)荷比［M－H］＋＝395．1274，表明DON分子連有1個琥珀酸酐分子，證明成功合成了半抗原DON－HS。

2．4 MALDI－TOF－MS質(zhì)譜鑒定DON－BSA（圖4）

由圖4可知，DON－BSA人工抗原的分子量約71304．42Da，相對于蛋白BSA的分子量（66442．9375 Da）有很大的增加，表明有大量的DON分子被偶聯(lián)在BSA上了，這就大大提高了實驗動物產(chǎn)生針對DON的抗體的成功率。

2．5 多克隆抗體效價（表1）

由表1可知，間接酶聯(lián)免疫分析法測定小鼠多克隆抗體效價，1＃和3＃小鼠的效價均為1∶32 000，2＃小鼠的效價為1∶8000。

2．6 討論

為了從禾谷鐮刀菌的固體發(fā)酵產(chǎn)物中得到純化的DON，應(yīng)用高速逆流色譜儀對粗提物中的DON進(jìn)行分離，通過預(yù)實驗，嘗試了多種流動相及固定相組合，比較兩相的分離常數(shù)，最終確定高速逆流色譜采用乙酸乙酯－水系統(tǒng)。

圖4 BSA（a）和DON－BSA（b）的 MALDI－TOF－MS圖譜Fig．4 The MALDI－TOF－MS patterns of BSA（a）and DON－BSA（b）

表1 抗DON多克隆抗體的效價Tab．1 The titer of DON polyclonal antibody

相對于Witt等［13］采用的硅膠色譜及薄層層析方法分離DON的研究結(jié)果，本研究具有明顯的優(yōu)勢。首先，高速逆流色譜法操作較簡單、快速、節(jié)省溶劑，且可以大量制備，成本低；其次，高效液相色譜法的靈敏度和效率方面明顯好于薄層層析法，樣品回收率也高，損耗??；通過高速逆流色譜進(jìn)行分離后，可以得到濃縮的含有目標(biāo)化合物的餾分，同時減少了樣品量，有助于提高后續(xù)高效液相色譜純化的效率和效果。將兩種色譜法相結(jié)合可以快速分離獲得高純度DON。為此類毒素的相關(guān)研究提供了參考，具有較好的實際應(yīng)用價值。

對于含不同基團(tuán)的小分子，研究者所采用的人工抗原合成方法各有不同。本研究引入DMAP催化法對DON的羥基進(jìn)行隨機乙?；?，合成含羧基較多的半抗原，再與BSA和OVA進(jìn)行偶聯(lián)，基質(zhì)輔助激光解吸附電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜鑒定表明人工抗原制備成功，并通過免疫動物后，獲得了較高效價的抗體。其中一只小鼠的多克隆抗體效價達(dá)到1∶32 000，高于以往報道的DON多克隆抗體的效價。

3 結(jié)論

利用高速逆流色譜法結(jié)合高效液相色譜法從禾谷鐮刀菌固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化DON，首先以高速逆流色譜在乙酸乙酯－水（1∶1，體積比）為兩相溶劑系統(tǒng)、溫度為25℃、主機轉(zhuǎn)速為890r·min－1、流速為1．0mL·min－1、檢測波長為254nm的條件下進(jìn)行分離，再采用高效液相色譜進(jìn)一步分離純化，從300g大米發(fā)酵培養(yǎng)物中得到了8mg DON，純度為97．7%；將純化的DON用于DON人工抗原制備，基質(zhì)輔助激光解吸附電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜分析表明，人工抗原制備成功；免疫動物后，研制出了高效價的多克隆抗體。本研究建立的色譜方法操作簡單、分離效果較好，純化的DON可以用于抗體的制備。

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