P57Kip2、CDK5在維甲酸致神經(jīng)管發(fā)育缺陷模型中基因表達(dá)差異＊

李新軍，韓楊云，徐 宏△，楊 忠，曾 義，孫中書，李紅麗，龍曉東，游 潮

（1.四川省德陽市人民醫(yī)院神經(jīng)外科 618000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物教研室，重慶 400038；3.四川省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，成都 610041；4.四川大學(xué)華西醫(yī)院神經(jīng)外科，成都 610041）

神經(jīng)管缺陷（neural tube defects，NTD），在所有的新生兒缺陷中發(fā)病率居第一位，是在胚胎發(fā)育過程中由于神經(jīng)管閉合不全引起的一種缺陷［1］?；蛐酒笇⒃S多特定的寡核苷酸或基因片段作為探針有規(guī)律地排列固定于支持物上，樣品RNA經(jīng)同位素或熒光標(biāo)志后進(jìn)行雜交，應(yīng)用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對雜交信號檢測分析，從而得出相應(yīng)的生物信息?；蛐酒夹g(shù)的應(yīng)用為在分子水平研究復(fù)雜的生理病理過程或信號通路提供了迄今最有力的工具。由于NTD基因表達(dá)及調(diào)控過程復(fù)雜多變，國內(nèi)外研究較少。P57kip2、蛋白激酶5（CDK5）作為重要的細(xì)胞周期相關(guān)因子在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用機(jī)制尚不十分清楚。本課題組通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和基因芯片分析，比較了胚胎9.5、10.5d正常與同期NTD小鼠神經(jīng)管組織的P57kip2、CDK5的基因表達(dá)差異，并對其進(jìn)行雜交驗(yàn)證。以求發(fā)現(xiàn)二者與NTD發(fā)生和神經(jīng)胚的密切聯(lián)系，并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 120只成年昆明種小鼠，鼠齡55～65d，體質(zhì)量22～28g，無特異病原體，雌雄各半，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物質(zhì)量合格證號：SCXK（渝）2007003）。實(shí)驗(yàn)中對動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 TRIZOL試劑、SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶、OligodT12－18隨機(jī)引物、Rnase抑制劑購自 Gibco－BRL公司；維甲酸（RA）購自美國Sigma公司；5×緩沖液，dATP、DCTP、dGTP、dTTP，0.1MDTT，Poly dA，Yeast tRNA，CoT－1DNA 購自美國 Life technology公司；Cy5－dUTP、Cy3－dUTP購自香港 Amersham pharmacia公司；32P－dCTP購自美國Beckman公司；QIAquick質(zhì)粒純化試劑盒，QIAquick探針純化試劑盒購自美國Gene公司；基因微點(diǎn)陣購自香港Amersham Pharmacia公司；1%瓊脂糖甲醛變性凝膠、MOPS緩沖液、10×MOPS緩沖液、10%SDS緩沖液等溶液按《分子克隆》方法配制，藥品試劑為國產(chǎn)分析純級。基因序列購自美國Incyte公司小鼠基因文庫。ScanArray4000芯片掃描儀購自美國General Scanning公司；ScanAlyze2.51軟件購自美國斯坦福大學(xué)；Microcon YM－30為Millipore產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 神經(jīng)管發(fā)育缺陷模型建立及分組 120只成年昆明種小鼠，于下午6：00按雌雄各半比例合籠，次日清晨8：00取出，檢查雌鼠陰道口有無陰栓，共獲得60只孕鼠。將有陰栓者當(dāng)日早晨8：00定為孕期第0天（embryonic，E0d），下午4：00定為E0.5d。按Klootwijk等［2］的方法制備NTD模型。RA處理致NTD小鼠RA溶于玉米油內(nèi)，按50mg／kg于孕期E7.0d～7.25d時(shí)一次性喂服孕鼠，造成NTD模型（RA誘導(dǎo)組，n＝30）。同時(shí)正常對照組（n＝30）喂服等量玉米油。

1.3.2 標(biāo)本采集 兩組小鼠在孕期為E9.5d（n＝16）、E 10.5d（n＝12）時(shí)，頸椎脫臼法處死，取出孕鼠子宮并分離胎盤、胎膜組織，在解剖顯微鏡下確定RA組已造成NTD發(fā)生。挑選典型的異常神經(jīng)管組織來進(jìn)行總RNA的分離和提取。

1.3.3 總RNA的提取與檢測 按Gibco－BRL公司TRIZOL試劑所提供的方法進(jìn)行，分光光度儀檢測RNA標(biāo)本濃度，最后按約3.3μg／μL的濃度進(jìn)行稀釋分裝，每管15μL（50μg），－80℃保存。

1.3.4 基因芯片雜交與掃描分析 （1）逆轉(zhuǎn)錄（RT）標(biāo)記反應(yīng)：Mix＃1（×2，兩組RNA標(biāo)本），總RNA（50μg）15μL，OligodT12－18primer（0.5mg／mL）4μL，Rnase inhibitor 1μL，共20μL，混合后70℃孵育10min，置冰上10min。Mix＃2：5×緩沖液16μL，10 ×low T dNTPs 8μL，0.1mmol／L DTT 8μL，SuperScriptⅡ4μL，共36mL DNA合成：分別加18μL RT反應(yīng)體系（Mix＃2）到兩組Mix＃1，再分別在兩組標(biāo)本加2μL Cy3－dUTP（正常對照組）或 Cy5－dUTP（RA 誘導(dǎo)組），42℃孵 育，2h。10 × low T dNTPs：100mmol／L dATP、dCTP、dGTP各30μL，100mmol／L dTTP 6μL，加 DEPC水504μL，混勻。（2）水解、洗滌純化：加10μL 0.5mol／L NaOH（含100mmol／L EDTA），混勻后，65℃孵育，10min，終止反應(yīng)；加10μL 0.5mol／L HCl（1mol／L Tris，pH 7.4），混勻。將cy3和cy5標(biāo)記標(biāo)本混合于 Microcon YM－30管中，12000r／min離心約5min，再加500mL TE緩沖液（pH 8.0），離心洗滌2次。棄洗滌液（含未反應(yīng)完物質(zhì)及小分子片段等）。將YM－30管倒置于一新的EPENDOFF管，低速離心收集含cy3、cy5標(biāo)記的cDNA片段，最后液體量約20μL。（3）芯片雜交每個(gè)雜交體系加：Poly dA（8mg／mL），Yeast tRNA（4mg／mL），CoT－1DNA（10mg／mL）的等份混合物 3μL。20×SSC 3μL，10%SDS 0.4μL?？傠s交液體積約20～30μL（1cm×2cm芯片面積），100℃變性后，混勻，小心滴在基因芯片上，加蓋片，在濕盒中65℃孵育，16～24h。將玻片浸于2×SSC，0.1%SDS緩沖液中，37℃10min，振蕩使蓋片滑落，重復(fù)洗滌1次，15min。甩掉液體，1×SSC洗滌，37℃15min。再用0.2×SSC洗15min，室溫。離心甩干玻片液體，掃描記錄。用含有1100余個(gè)已知基因的中密度芯片，對每組標(biāo)記的cDNA雜交。雜交后芯片用ScanArray 4000掃描儀掃描獲取微陣列圖像，掃描圖像經(jīng)ScanAlyze2.51軟件分析。反復(fù)試驗(yàn)3次。

1.3.5 基因表達(dá)差異的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 在應(yīng)用ScanAlyze軟件進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)分析處理中，基因表達(dá)改變的臨界點(diǎn)設(shè)定為0.5與2.0，當(dāng)兩組組織中基因表達(dá)的強(qiáng)度比值（cy5／cy3）大于2.0或小于0.5時(shí)，即認(rèn)為它們存在差異表達(dá)。圖像中芯片雜交的熒光信號cy3顯示為綠色，cy5為紅色，如果某一點(diǎn)cy5信號強(qiáng)于cy3，則兩種熒光信號疊加后呈紅色（表達(dá)上調(diào)），反之呈綠色（表達(dá)下降）；表達(dá)無明顯差異則呈現(xiàn)黃色。本實(shí)驗(yàn)中每一對組織的基因差異表達(dá)比較共進(jìn)行3次，只有當(dāng)一個(gè)基因在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中均出現(xiàn)相同趨勢變化（大于2.0或小于0.5），或3次實(shí)驗(yàn)中有2次出現(xiàn)相同趨勢改變且第3次結(jié)果不矛盾時(shí)，方判定為差異表達(dá)基因。

1.3.6 Northern雜交 為了對兩組芯片雜交的可靠性進(jìn)行證實(shí)，隨機(jī)選取DNA芯片中表達(dá)上調(diào)、下調(diào)或表達(dá)變化無顯著差異的基因，進(jìn)行Northern雜交。Trizol溶液提取的組織總RNA各約20μg，經(jīng)甲醛變性凝膠電泳后，毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移至尼龍膜，80℃烘烤固定2h。將質(zhì)粒擴(kuò)增所得DNA探針用32P－dCTP進(jìn)行隨機(jī)引物標(biāo)記，按QIAquick探針純化試劑盒方法進(jìn)行純化，充分洗膜后，用感光膠片進(jìn)行自顯影，檢測mRNA的相對含量。所有樣膜用Actin cDNA探針再雜交，用作內(nèi)參照。最后進(jìn)行吸光度掃描，分析雜交信號。

2 結(jié) 果

2.1 P57kip2基因在不同組間的差異 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示正常對照組中P57kip2在神經(jīng)管形成前后表達(dá)顯著上調(diào)（cy5／cy3＞2.0），而在RA誘導(dǎo)組中，P57kip2基因在E9.5d，E10.5d兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)呈現(xiàn)一致變化，P57kip2在RA作用后呈現(xiàn)下調(diào)趨勢（RA誘導(dǎo)組 E9.5dcy5／cy3＜0.5；RA誘導(dǎo)組E10.5dcy5／cy3＜0.5），見表1。

表1 P57kip2基因在不同組間的表達(dá)（n＝30）

2.2 CDK5基因在不同組間的差異 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示正常對照組中CDK5在神經(jīng)管形成前后表達(dá)顯著上調(diào)（cy5／cy3＞2.0），而在RA誘導(dǎo)組，CDK5基因在E9.5d，E10.5d兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)呈現(xiàn)一致變化，CDK5在RA作用后呈現(xiàn)下調(diào)趨勢（RA誘導(dǎo)組E9.5dcy5／cy3＜0.5；RA誘導(dǎo)組E10.5dcy5／cy3＜0.5），見表2。

表2 CDK5基因在不同組間的表達(dá)（n＝30）

2.3 Northern雜交驗(yàn)證結(jié)果 為了證實(shí)芯片雜交結(jié)果的可靠性，分別對P57kip2、CDK5基因進(jìn)行Northern雜交驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果提示與芯片雜交結(jié)果相同。

3 討 論

神經(jīng)胚形成是中樞神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育中最主要的形態(tài)學(xué)事件。神經(jīng)板準(zhǔn)確、及時(shí)的閉合形成神經(jīng)管是其正常發(fā)生的關(guān)鍵。否則會(huì)導(dǎo)致畸形的產(chǎn)生，如NTD、脊柱裂、無腦畸形等。神經(jīng)管的形成是該過程結(jié)束的標(biāo)志。體內(nèi)外任何異常因素的作用均可導(dǎo)致神經(jīng)管缺陷的發(fā)生。眾所周知，細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡準(zhǔn)確、有序的進(jìn)行是保證神經(jīng)管正常發(fā)生的關(guān)鍵因素。正常神經(jīng)管關(guān)閉期間，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKIs）作為重要的細(xì)胞周期抑制因子，通過抑制細(xì)胞從G1期到S期的轉(zhuǎn)化進(jìn)入DNA合成，從而確保蛋白質(zhì)復(fù)合物的準(zhǔn)確組裝，從而調(diào)節(jié)正常有序的細(xì)胞分化［2－3］。

本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常神經(jīng)管形成前后及RA誘導(dǎo)產(chǎn)生NTD后P57kip2基因表達(dá)有明顯差異，P57kip2在神經(jīng)管形成前后表達(dá)顯著上調(diào)，而在RA誘導(dǎo)致NTD中，P57kip2表達(dá)在E9.5d、E10.5d兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)呈現(xiàn)一致變化，呈現(xiàn)下調(diào)趨勢［4］。表明在神經(jīng)管關(guān)閉期間，RA作用后，P57kip2的表達(dá)水平降低，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期到S期的轉(zhuǎn)化，干擾了神經(jīng)祖細(xì)胞的定向分化，致使細(xì)胞周期相關(guān)因子的監(jiān)管功能失控，導(dǎo)致正常細(xì)胞不能有序分化，形成發(fā)育缺陷的神經(jīng)管。提示P57kip2是一種重要的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子，參與了細(xì)胞周期調(diào)控、促進(jìn)凋亡、誘導(dǎo)分化［5］。可能通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，控制細(xì)胞基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)［6］。但在神經(jīng)胚形成時(shí)期，在RA的干擾下P57kip2的作用途徑是否發(fā)生了改變，尚需進(jìn)一步探討。

通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)課題組發(fā)現(xiàn)正常神經(jīng)管形成前后及RA誘導(dǎo)產(chǎn)生NTD后CDK5基因表達(dá)差異明顯，CDK5在神經(jīng)管形成前后表達(dá)顯著上調(diào)，而在RA誘導(dǎo)致NTD中，CDK5表達(dá)在E9.5d、E10.5d兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)呈現(xiàn)一致變化，呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。CDK5在細(xì)胞分裂中的作用尚不明確。CDK5是CDK的家庭成員，是一種多功能蛋白質(zhì)，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和分化過程中發(fā)揮獨(dú)特的作用。研究表明，CDK5／P35能調(diào)節(jié)磷酸化的微管相關(guān)蛋白，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的遷移、軸突生長與導(dǎo)向，并在神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育過程中起支持細(xì)胞骨架動(dòng)力的作用［7］，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟過程中扮演了重要角色，其表達(dá)隨著細(xì)胞逃逸出細(xì)胞周期而逐漸升高［8－9］。Trunova等［10］通過敲除小鼠的 CDK5基因獲得NTD模型，甚至出現(xiàn)胚胎期致使的嚴(yán)重缺陷，提示CDK5是CNS發(fā)育必要的關(guān)鍵基因之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示RA作用后CDK5表達(dá)下調(diào)，推測可能通過減少CDK5數(shù)量，降低CKIs抑制因子與CDK5的結(jié)合力，導(dǎo)致細(xì)胞從G1期到S期的轉(zhuǎn)化過程抑制減弱，使DNA蛋白的正確組裝受到干擾，從而干擾細(xì)胞的正常有序的分化，促進(jìn)了神經(jīng)管的發(fā)育缺陷。目前RA和CDK5之間具體作用機(jī)制的細(xì)節(jié)尚不明確，須進(jìn)一步探索研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P57kip2、CDK5基因參與了NTD的發(fā)生過程，但對其具體作用機(jī)制尚不明確，雖然國內(nèi)部分學(xué)者對其進(jìn)行了較深入的研究［11－12］，但其作用機(jī)制的細(xì)節(jié)問題還不清楚，需進(jìn)一步研究。

［1］肖坤則，張芝燕，高健，等.中國神經(jīng)管缺陷的流行病學(xué)［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，1989，69（4）：189.

［2］Klootwijk R，Schijvenaars MM，Mariman EC，et al.Further characterization of the genetic defect of the Bent tail mouse，a mouse model for human neural tube defects［J］.Birth Defects Res A Clin Mol Teratol，2004，70（11）：880－884.

［3］Joseph B，Hermanson O.Molecular control of brain size：regulators of neural stem cell Life，death and beyond［J］.Exp Cell Res，2010，316（8）：1415－1421.

［4］李新軍，韓楊云，徐宏，等.p57kip2在神經(jīng)管發(fā)育過程中的表達(dá)差異［J］.中國臨床神經(jīng)外科雜志，2012，17（8）：479－481.

［5］Tury A，Mairet－Coello G，Dicicco－Bloom E.The cyclin－dependent kinase inhibitor p57Kip2regulates cell cycle exit，differentiation，and migration of embryonic cerebral cortical precursors［J］.Cereb Cortex，2011，21（8）：1840－1856.

［6］Pateras IS，Apostolopoulou K，Niforou K，et al.p57KIP2："Kip"ing the cell under control［J］.Mol Cancer Res，2009，7（12）：1902－1919.

［7］Saito T，Onuki R，F(xiàn)ujita Y，et al.Developmental regulation of the proteolysis of the p35cyclin－dependent kinase 5activator by phosphorylation.J Neurosci.2003，23（4）：1189－1197.

［8］Blondel M，Meijer L.Editorial：role of cyclin－dependent kinase－5（Cdk5）in the central nervous system.Biotechnol J.2007，2（8）：914－915.

［9］Cheung ZH，Ip NY.Cdk5：a multifaceted kinase in neurodegenerative diseases［J］.Trends Cell Biol，2012，22（3）：169－175.

［10］Trunova S，Giniger E.Absence of the Cdk5activator p35 causes adult－onset neurodegeneration in the central brain of Drosophila［J］.Dis Model Mech，2012，5（2）：210－219.

［11］馬向東，吳小明，馬興，等.胚胎先天性神經(jīng)管缺陷的表達(dá)差異基因及信號傳導(dǎo)［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（19）：1737－1740.

［12］李新軍，楊忠，曾義，等.維甲酸誘導(dǎo)神經(jīng)管發(fā)育缺陷相關(guān)基因表達(dá)驗(yàn)證［J］.中華神經(jīng)外科雜志，2012，28（12）：1279－1283.