新疆烏魯木齊市耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性及PVL基因檢測

陳 鋒，朱震宏，劉 瀟，劉素輝，武貴臻

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原學(xué)教研室，烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，烏魯木齊830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研中心，烏魯木齊830011）

金黃色葡萄球菌是目前引起醫(yī)院感染常見的病原體，可以引起皮膚軟組織感染、敗血癥和中毒性休克綜合征等多種疾病。從上世紀(jì)九十年代末開始，隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用以及各種介入性治療方法的應(yīng)用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染越來越多，成為醫(yī)院感染中常見的重要病原菌［1－2］；近年 MRSA引起的社區(qū)感染也日見增多，引起社區(qū)感染的 MRSA（CA－MRSA）多攜帶殺白細(xì)胞素（panton－valentine leukocidin，PVL）基因，主要引起化膿性皮膚感染和壞死性肺炎。MRSA感染具有流行范圍廣、多重耐藥和臨床治療困難等特點(diǎn)，因此了解本地區(qū)MRSA的耐藥性對指導(dǎo)臨床用藥和防止其播散有重要意義。本研究的目的是調(diào)查新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院分離的MRSA耐藥性和PVL基因攜帶率，為臨床治療及控制MRSA感染提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 49株MRSA菌株為2011年3～10月從新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診和住院患者分離所獲得的臨床分離菌株；質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923，來自新疆醫(yī)科大學(xué)微生物教研室。

1.2 試劑 藥敏試驗(yàn)用培養(yǎng)基M－H瓊脂購自杭州微生物試劑廠，青霉素G、苯唑西林、紅霉素、慶大霉素、利福平、呋喃妥因、阿奇霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、克林霉素和萬古霉素等藥敏紙片均購自英國Oxoid公司，引物由上海生工合成，PCR試劑盒購自上海生工，細(xì)菌DNA提取試劑盒購自天根生物公司。

1.3 方法

1.3.1 MRSA的鑒定 將臨床標(biāo)本接種于血平板進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過革蘭染色、溶血性、血漿凝固酶試驗(yàn)和甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)行金黃色葡萄球菌的鑒定；通過表型和基因型檢測進(jìn)行MRSA鑒定。表型檢測：采用頭孢西丁紙片法，抑菌圈小于或等于21判斷為MRSA。基因型檢測：按試劑盒說明提取細(xì)菌DNA，采用PCR法檢測mecA基因。2012年臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）指出：MRSA的分子生物學(xué)檢測方法中最準(zhǔn)確的方法是檢測mecA基因或其編碼蛋白青霉素結(jié)合蛋白－α（PBP－α），即mecA基因陽性者判定為 MRSA。mecA基因上游引物序列為5′－TGG CTA TCG TGT CAC AAT CG－3′，下游引物序列為5′－CTG GAA CTT GTT GAG CAG AG－3′，擴(kuò)增片段為310bp。

1.3.2 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法測定MRSA對10種抗菌藥物的敏感性，萬古霉素用微量肉湯稀釋法，參照CLSI 2009年標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行判讀。

1.3.3 PVL基因檢測 按試劑盒說明提取細(xì)菌DNA。上游引物序列為5′－ATC ATT AGG TAA AAT GTC TGG ACA TGA TCC A－3′，下 游 引 物 序 列 為 5′－GCA TCA AGT GTA TTG GAT AGC AAA AGC－3′，擴(kuò)增片段為433bp［2］。PCR反應(yīng)體系為20μL：PCR Master 10μL，引物各1μL，模板DNA 3μL，dH2O 5μL；反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性50s，55℃復(fù)性50s，72℃延伸1min，共循環(huán)30次，最后72℃延伸5min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL進(jìn)行瓊脂糖（2%）凝膠電泳（100V，30min），于紫外燈下觀察結(jié)果并照相記錄。質(zhì)控菌株為ATCC49775。

2 結(jié) 果

2.1 MRSA的檢測 49株MRSA菌株均對頭孢西丁耐藥，均表達(dá)mecA基因，見圖1。

圖1 mecA基因PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 49株MRSA對青霉素G和苯唑西林100.0%耐藥，對利福平耐藥率高達(dá)95.9%，對阿奇霉素、紅霉素、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星和克林霉素表現(xiàn)出不同程度的耐藥，其耐藥率分別為77.8%、77.8%、88.9%、86.7%、83.67%和67.35%，對呋喃妥因耐藥性僅為2.2%，對萬古霉素全部敏感。

2.3 PVL基因檢測 49株MRSA僅31株檢出PVL基因，占63.3%，MRSA菌株P(guān)VL基因檢測結(jié)果，見圖2。

圖2 PVL基因PCR結(jié)果

3 討 論

MRSA是醫(yī)院感染的重要病原菌，對目前臨床應(yīng)用的大多數(shù)抗菌藥物有很高的耐藥率，給臨床治療帶來困難，已成為世界范圍內(nèi)耐藥監(jiān)測的重點(diǎn)。本次藥敏結(jié)果顯示，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分離的49株MRSA具有多重耐藥性，對青霉素G和苯唑西林均耐藥，對利福平、紅霉素、慶大霉素、阿奇霉素和阿米卡星均有較高的耐藥率，尚未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素耐藥的菌株。結(jié)果表明烏魯木齊地區(qū)MRSA耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重，呈多重耐藥，僅對萬古霉素敏感性較好，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致，故烏魯木齊地區(qū)應(yīng)該加強(qiáng)對MRSA耐藥性的監(jiān)測，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理使用抗菌藥物，也可以考慮聯(lián)合用藥以降低抗菌藥物的使用劑量，避免耐藥現(xiàn)象的發(fā)生。

PVL可通過改變細(xì)胞膜通透性殺傷白細(xì)胞，體外試驗(yàn)表明PVL尚可通過線粒體途徑誘導(dǎo)白細(xì)胞凋亡［3］。目前普遍認(rèn)為PVL是引起金黃色葡萄球菌皮膚軟組織感染及壞死性肺炎的重要毒力因子，產(chǎn)生PVL的金黃色葡萄球菌更容易穿過皮膚引起嚴(yán)重感染［4］，動物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)［5－6］，但也有相反的觀點(diǎn)［7］。PVL在CA－MRSA）中有較高的攜帶比例，其陽性被認(rèn)為是CA－MRSA的分子生物標(biāo)志。國外報(bào)道在CA－MRSA中PVL基因陽性率在80%以上［8］，而在醫(yī)院相關(guān)性 MRSA（HA－MRSA）中陽性率較低。國內(nèi)張楠等［9］報(bào)道寧夏地區(qū)PVL陽性率僅為9.1%，王風(fēng)玲等［10］、孫桂珍等［11］報(bào)道 MRSA的PVL陽性率分別為46.8%、40.0%，表明產(chǎn)PVL的MRSA在我國臨床已占有較高的比例，應(yīng)引起臨床高度重視。在本研究中49株P(guān)VL陽性率高達(dá)63.3%，而且這些菌株也表現(xiàn)出對紅霉素、克林霉素、慶大霉素等抗菌藥物的多重耐藥性，這與潘宏升等［12］的報(bào)道一致。而PVL基因?qū)?MRSA耐藥性是否有影響尚有待進(jìn)一步研究。

新疆是我國艾滋病的高發(fā)地區(qū)，HIV感染被認(rèn)為是MRSA定植［13］、感染［14］的危險(xiǎn)因素。因此，檢測烏魯木齊地區(qū)MRSA的耐藥性及毒素基因可為臨床正確使用抗菌藥物治療以及更好地控制MRSA感染提供科學(xué)的指導(dǎo)依據(jù)。

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