共染MIP－1α與B7－1誘導(dǎo)乳腺癌大鼠免疫應(yīng)答能力的研究

梁莉萍，賈存東

（新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院：1.病理科；2.腫瘤內(nèi)科，烏魯木齊 830011）

乳腺癌是女性中常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率隨著社會(huì)的發(fā)展而趨向增長［1－2］。對于乳腺癌的治療手段多樣，大大提高了患者的生存率，但其病死率仍較高，尤其是對于乳腺癌晚期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，普通的治療手段往往效果難以令人滿意［3－4］。隨著醫(yī)療相關(guān)學(xué)科及技術(shù)的發(fā)展，基因治療引起了各學(xué)者的重視［5］。目前，關(guān)于乳腺癌基因治療的研究仍較少，因此，筆者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討共轉(zhuǎn)染 MIP－1α與B7－1基因?qū)θ橄侔┐笫竺庖咝?yīng)應(yīng)答的影響，為臨床對乳腺癌患者實(shí)施基因治療提供一個(gè)初步的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)的SD雌性大鼠40只，體質(zhì)量25～30g，7～10d；源性乳腺癌細(xì)胞株SHZ－88及經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄或（和）培育的SHZ－88親代細(xì)胞、SHZ－88／MIP－1α細(xì)胞、SHZ－88／B7－1細(xì)胞及SHZ－88／MIP－1α＋B7－1細(xì)胞。

1.2 研究方法

1.2.1 乳腺癌大鼠造模及成瘤實(shí)驗(yàn) 采用SHZ－88乳腺癌細(xì)胞建立乳腺癌大鼠模型40只，觀察模型的穩(wěn)定性；將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照接種細(xì)胞的不同分成對照組（接種SHZ－88親代細(xì)胞）、MIP－1α組（接種 SHZ－88／MIP－1α細(xì)胞）、B7－1組（接種 SHZ－88／B7－1細(xì)胞）及聯(lián)合組（接種SHZ－88／MIP－1α＋B7－1細(xì)胞），每組10只，觀察接種后有無腫瘤生長。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對乳腺癌大鼠的治療方法 各細(xì)胞均經(jīng)絲裂霉素C滅活，濃度為2.5×107／mL，1周注射1次，每次0.2 mL，共治療2次。治療完成2周后取一半大鼠的外周血檢測CD4＋、CD8＋百分比和CD4＋／CD8＋比值以及白細(xì)胞介素2（IL－2）、人γ干擾素（IFN－γ）水平，另一半大鼠用于觀察腫瘤體積變化以及生存時(shí)間。

1.2.3 觀察指標(biāo) 計(jì)算注射轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞后乳腺癌大鼠腫瘤體積分別在第1周、第2周、第3周及第4周的大?。挥涗泴?shí)驗(yàn)大鼠的生存時(shí)間，計(jì)算每組的平均值；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠外周血CD4＋、CD8＋百分比和CD4＋／CD8＋比值；使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測大鼠外周血的IL－2、IFN－γ水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0建立數(shù)據(jù)庫并對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)數(shù)資料采用的形式表示，組間差異采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SD大鼠造模及成瘤結(jié)果 采用SHZ－88細(xì)胞建立的乳腺癌大鼠模型均成功且穩(wěn)定，致瘤率達(dá)到100%，且腫瘤體積隨著時(shí)間的延長不斷增大。在腫瘤細(xì)胞接種10d后，采用SHZ－88親代細(xì)胞接種，成瘤性達(dá)到100%；采用SHZ－88／MIP－1α接種，成瘤性降低到20%；采用SHZ－88／B7－1接種，成瘤性降低到30%；而采用SHZ－88／MIP－1α＋ B7－1接種則成瘤性消失且保持無瘤狀100d以上。

2.2 乳腺癌大鼠腫瘤體積的變化 注射轉(zhuǎn)基因腫瘤細(xì)胞的荷瘤大鼠的腫瘤體積在1～4周均較對照組小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而在第2周、第3周及第4周，聯(lián)合組荷瘤大鼠的腫瘤體積均明顯小于MIP－1α組及B7－1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 乳腺癌大鼠腫瘤體積的變化（cm3，，n＝10）

表1 乳腺癌大鼠腫瘤體積的變化（cm3，，n＝10）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與聯(lián)合組比較。

組別 1周 2周 3周 4周0.89±0.113.26±0.198.05±0.5453.38±2.49 MIP－1α組 0.85±0.08a1.30±0.11ab 3.53±0.33ab 8.22±0.52ab B7－1組 0.86±0.12a1.39±0.13ab 3.84±0.38ab 9.31±0.44ab聯(lián)合組 0.82±0.14a1.03±0.10a1.64±0.29a5.48±0.47對照組a

2.3 荷瘤大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞型百分比比較 MIP－1α組、B7－1組及聯(lián)合組外周血T淋巴細(xì)胞亞型CD4＋、CD8＋的百分比與CD4＋／CD8＋均較對照組高（P＜0.05）；且聯(lián)合組明顯高于 MIP－1α組及B7－1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 荷瘤大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞型百分比的比較（，n＝10）

表2 荷瘤大鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞型百分比的比較（，n＝10）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與聯(lián)合組比較。

組別 CD4＋（%） CD8＋（%） CD4＋／36.29±1.03 13.19±0.89 2.19±0.20 MIP－1α組 40.80±1.71ab 15.81±1.29ab 2.79±0.09ab B7－1組 40.79±1.28ab 16.41±1.04ab 2.71±0.14ab聯(lián)合組 44.28±4.10a 19.81±1.91a 3.08±0.23 CD8＋對照組a

表3 荷瘤大鼠生存天數(shù)、外周血IL－2及IFN－γ水平的比較（，n＝10）

表3 荷瘤大鼠生存天數(shù)、外周血IL－2及IFN－γ水平的比較（，n＝10）

a：P＜0.05，與對照組比較；b：P＜0.05，與聯(lián)合組比較。

組別 生存天數(shù)（d） IL－2（pg／mL） IFN－γ（pg／mL）53.39±1.15 9.17±1.02 24.27±2.23 MIP－1α組 63.79±1.62ab 11.40±1.20ab 33.09±2.29ab B7－1組 64.19±1.91ab 11.47±1.24ab 33.20±2.22ab聯(lián)合組 89.01±2.54a16.77±1.33a 58.06±3.35對照組a

2.4 荷瘤大鼠的生存天數(shù)、外周血IL－2及IFN－γ水平比較MIP－1α組、B7－1組及聯(lián)合組荷瘤大鼠的生存天數(shù)均明顯多于對照組（P＜0.05）；且聯(lián)合組較 MIP－1α組及B7－1組明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MIP－1α組、B7－1組及聯(lián)合組大鼠外周血的IL－2及IFN－γ水平均明顯高于對照組（P＜0.05）；且聯(lián)合組的水平明顯高于 MIP－1α組及B7－1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

腫瘤患者存在不同程度的免疫抑制［6－7］，且隨腫瘤負(fù)荷的增大而越趨明顯，導(dǎo)致腫瘤局部未能顯現(xiàn)出有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答［8］。因此，嘗試提高免疫效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量及質(zhì)量，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答，增強(qiáng)腫瘤局部免疫原性，逆轉(zhuǎn)免疫抑制狀態(tài)，可達(dá)到治療腫瘤的效果。

MIP－1α主要生物功能有［9－10］：管理炎性反應(yīng)；參與 T 淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)；增強(qiáng)單核、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性；誘導(dǎo)各種炎性介質(zhì)的產(chǎn)生等。腫瘤細(xì)胞往往缺乏B7分子的共刺激作用，未能有效激活T細(xì)胞，使得腫瘤細(xì)胞未能被機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊［11］。轉(zhuǎn)染B7－1分子，促進(jìn)第二信號系統(tǒng)作用，激活T細(xì)胞效應(yīng)，可產(chǎn)生抗腫瘤作用［11－12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在乳腺癌大鼠模型內(nèi)接種轉(zhuǎn)染MIP－1α與B7－1細(xì)胞后，成瘤性消失且保持無瘤狀態(tài)超過100d，荷瘤大鼠生存時(shí)間明顯長于轉(zhuǎn)染單基因及親代腫瘤細(xì)胞大鼠。可見轉(zhuǎn)染 MIP－1α與B7－1能夠提高腫瘤局部有效的免疫效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量及質(zhì)量，提高腫瘤的免疫原性，激發(fā)強(qiáng)烈的抗腫瘤作用。

T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是抗腫瘤免疫效應(yīng)機(jī)制的最主要部分，其主要元素是激活狀態(tài)下的T細(xì)胞CD4＋及CD8＋2個(gè)亞型，加以CD4＋／CD8＋可作為反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)的指標(biāo)［13］。CD4＋細(xì)胞參與巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等的激活，還可分泌各種細(xì)胞因子，從而起到抗腫瘤的作用［14］。CD8＋細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞具有一定的殺傷作用且不傷害正常細(xì)胞［15］。細(xì)胞因子中以IL－2及IFN－γ在抗腫瘤效應(yīng)中起主要作用［16－17］。因此，本研究通過測定CD4＋、CD8＋、CD4＋／CD8＋及IL－2、IFN－γ水平來評價(jià)荷瘤大鼠接種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞后的抗腫瘤免疫效應(yīng)。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染MIP－1α與B7－1細(xì)胞的荷瘤大鼠外周血CD4＋、CD8＋百分比和CD4＋／CD8＋比值以及IL－2、IFN－γ水平均明顯高于對照組及轉(zhuǎn)染單基因的大鼠，可見共轉(zhuǎn)染 MIP－1α與B7－1后，能明顯提高機(jī)體的免疫效應(yīng)，大大提高抗腫瘤作用。

本實(shí)驗(yàn)表明，協(xié)同 MIP－1α與B7－1的不同作用原理及機(jī)制，能增強(qiáng)對乳腺癌大鼠的抗腫瘤作用，療效明顯優(yōu)于單基因治療，可為日后進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供初步的參考。

［1］吳愛國.乳腺癌基因治療研究現(xiàn)狀［J］.中華乳腺病雜志：電子版，2008，2（5）：561－570.

［2］荀艷莉.關(guān)于國內(nèi)乳腺癌治療的進(jìn)展研究［J］.科技資訊，2012（8）：242.

［3］唐金海，徐曉明.乳腺癌規(guī)范化和個(gè)體化治療進(jìn)展［J］.腫瘤學(xué)雜志，2011，17（5）：325－330.

［4］冉健，孫萬邦.乳腺癌免疫生物治療研究進(jìn)展［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，33（2）：197－199.

［5］杜力成，王棟，劉奇，等.乳腺癌基因治療的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（20）：3400－3403.

［6］Boniface JD，Poschke I，Mao Y，et al.Tumor－dependent down－regulation of theζ－chain in T－cells is detectable in early breast Cancer and correlates with immune cell function［J］.Int J Cancer，2012，131（1）：129－139.

［7］萬華，鄒強(qiáng)，董佳容，等.乳腺癌患者免疫指標(biāo)檢測及其臨床意義［J］.腫瘤，2006，26（3）：279－281.

［8］劉季芳，祁巖超.腫瘤免疫編輯研究進(jìn)展［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2009，30（10）：1579－1581.

［9］劉志忠，陳燕，葉虹等.星形細(xì)胞瘤和髓母細(xì)胞瘤患兒血清IL－6、IL－8和 MIP－1α水平變化［J］.標(biāo)記免疫分析與臨床，2012，19（5）：278－281.

［10］張佩蓮.趨化因子 MCP－1、MIP－lα、RANTES與自身免疫性疾?。跩］.皮膚病與性病，2012，34（4）：204－207.

［11］Ilias Basha H，Tiriveedhi V，F(xiàn)leming TP，et al.Identification of immunodominant HLA－B7－restricted CD8＋ cytotoxic T cell epitopes derived from mammaglobin－A expressed on human breast cancers［J］.Breast Cancer Res Treat，2011，127（1）：81－89.

［12］孫宏治，宮建，王巍，等.協(xié)同刺激分子CD28、B7－1在乳腺癌患者外周血的表達(dá)及意義［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（41）：57－58.

［13］顧敏，范原銘，王強(qiáng)等.乳腺癌患者外周血CD4＋、CD8＋以及CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞變化及其意義［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2009，38（7）：869－871.

［14］Khan MM，Chatterjee S，Dwivedi VP，et al.CD4＋ T cellderived novel peptide Thp5induces interleukin－4production in CD4＋ T cells to direct T helper 2cell differentiation［J］.J Biol Chem，2012，287（4）：2830－2835.

［15］于益芝，曹雪濤.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腫瘤免疫和腫瘤免疫治療中的作用［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2010，17（1）：1－6.

［16］Tomala J，Chmelova H，Mrkvan T，et al.In vivo expansion of activated naive CD8＋T cells and NK cells driven by complexes of IL－2and anti－IL－2monoclonal antibody as novel approach of Cancer immunotherapy［J］.J Immunol，2009，183（8）：4904－4912.

［17］黃文煉，徐曼，王婷婷等.乳腺癌B7－H4異常表達(dá)及與腫瘤內(nèi)CD8＋T細(xì)胞浸潤IFN－γ分泌的相關(guān)性研究［J］.中國腫瘤臨床，2012，39（15）：1096－1099，1103.