PCV-2ORF2和PRRSV GP5雙基因共表達重組腺病毒的構建及小鼠免疫試驗

林初文

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征（PRDC）是危害當前世界養(yǎng)豬業(yè)的一種重要疾?。?］，豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）和及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）被認為是PRDC的病原體［2］。

PRRSV自1987年首次發(fā)現以來，已遍及世界各個養(yǎng)豬國家，給養(yǎng)豬業(yè)造成了災難性的打擊［3-5］。PCV-2呈現全球性流行［6］，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經濟損失［7-8］。豬場經常發(fā)生PCV-2和PRRSV混合感染的現象，混合感染常常加重疫情，增加死亡率［9］。

目前，對豬圓環(huán)病毒?。≒CVD）的預防還沒有很好的疫苗，預防接種和綜合防控相結合的方法是防控豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的主要措施，弱毒苗以及滅活苗在PRRS的防控上盡管起到了一些作用，但不能杜絕PRRS的發(fā)生，因此各國都在研制PCVD和PRRS新型疫苗。PRRSV GP5基因編碼病毒的糖基化囊膜蛋白誘導機體產生特異性中和抗體，因此很多PRRS新型疫苗均以GP5為靶抗原［10-11］。PCV-2ORF2基因編碼病毒的主要結構蛋白Cap是主要的抗原蛋白［12］。以腺病毒作為表達載體，研制的新型基因工程疫苗有非常好的應用前景，腺病毒表達載體介導的基因具有病毒滴度高、感染細胞譜廣、轉移效率高、容易濃縮和貯存等很多優(yōu)點［13］。研究表明，構建的豬瘟重組腺病毒［14］和西方馬腦炎重組腺病毒［15］均具有良好的免疫效果。

本研究成功構建了表達PCV-2ORF2和PRRSV GP5基因的重組腺病毒rAd-gio，將其免疫小鼠，通過ELISA、病毒中和試驗，測定小鼠的體液免疫水平，為PCV-2和PRRSV重組腺病毒二聯基因工程苗的成功研制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

293A細胞，PK-15細胞，Marc-145細胞，DH5α感受態(tài)細胞，含AdEasy-1的BJ5183大腸埃希菌感受態(tài)細胞，野生型腺病毒，pIRESneo真核表達載體，pShuttle-CMV穿梭載體，含PRRSV GP5基因的pcDNA3.1-GP5重組質粒和pcDNA3.1-ORF2重組質粒，豬抗PRRSV和PCV-2陽性血清，均為山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究預防獸醫(yī)學與動物生物技術重點開放實驗室保存；pMD18-T Vector，寶生物工程（大連）有限公司產品；Balb／c雌性小鼠，體重為15g／只～18g／只，購自山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心；RNA提取試劑Trizol BglⅡ，AMV反轉錄酶，dNTP，RNasin，T4DNA Ligase，SalⅠ，HindⅢ，XhoⅠ，Taq DNA聚合酶，購自上海生工生物工程技術服務有限公司；質粒提取試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑，購自Invitrogen公司；HRP標記的山羊抗鼠IgG，購自武漢博士德生物工程有限公司；PacⅠ、PmeⅠ等限制性內切酶，購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 依據PCV-2ORF2、PRRSV GP5和pIRESneo載體上的IRES基因序列，使用Premier5.0軟件設計引物，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行合成。引物序列為：

GP5-f：5′-GCAGATCCCACCATGGTGGAGA AA-3′（BglⅡ）；GP5-r：5′-ATGTCGACCTAAGGACGACCCC ATTG-3′（SalⅠ）。

IRES-f：5′-GAGTCGACGTCCAACTGCAGG TCGAGCAT-3′（SalⅠ）；IRES-r：5′-ATCTCGAGTCCCCGTGGTTCG GGGGGCCTA-3′（XhoⅠ）。

ORF2-f：5′-GT CTCGAG ATGACGTGTCCAAGGAGG-3′（XhoⅠ）；ORF2-r：5′-GCAAGCTTTTAAGGGTTAAGTGGGG-3′（HindⅢ）。

1.2.2 目的基因克隆和鑒定 分別將pcDNA3.1-ORF2、pIRESneo和pcDNA3.1-GP5作為模板擴增ORF2、IRES和 GP5基因，ORF2、IRES和 GP5基因擴增時的退火溫度分別為70℃、57℃和55℃，分別將回收的PCR產物與pMD18-T載體連接，然后分別轉化感受態(tài)DH5α，挑取陽性克隆，搖菌并提取質粒，將質粒進行酶切、測序篩選出重組質粒pMD18-ORF2、pMD18-IRES和pMD18-GP5。

1.2.3 重組腺病毒穿梭載體pGIO的構建 同時用SalⅠ／BglⅡ雙酶切pMD18-GP5，回收GP5基因片段，將回收產物克隆到pShuttle-CMV穿梭載體上，通過卡那抗性篩選陽性重組質粒，將質粒酶切鑒定，成功構建pG重組穿梭質粒，將pMD18-ORF2和pMD18-IRES分別用HindⅢ／XhoⅠ和XhoⅠ／SalⅠ雙酶切，回收得到ORF2和IRES目的片段，將其克隆到pG穿梭載體上，通過卡那霉素抗性篩選陽性質粒，再次酶切鑒定，構建出含GP5-IRESORF2片段的重組穿梭質粒pGIO。

1.2.4 重組腺病毒質粒pAd-GIO的構建 重組腺病毒穿梭質粒pGIO經PmeⅠ酶切線性化后，轉化至含AdEasy-1的BJ5183大腸埃希菌感受態(tài)細胞。經卡那霉素抗性瓊脂平板上篩選后，挑取小的克隆，小量制備質粒，經PacⅠ酶切鑒定后，得到了同源重組重組腺病毒質粒pAd-GIO。

1.2.5 重組腺病毒制備和穩(wěn)定性鑒定 將重組腺病毒質粒pAd-GIO轉化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，經氨芐青霉素抗性瓊脂平板篩選后，挑取陽性克隆，大量制備質粒，將質粒用PacⅠ酶切線性化后，回收（3.5μg）；用脂質體Lipofetamine 2000包裹回收產物，轉染生長密度大約為65%的6孔細胞培養(yǎng)板上293A細胞，按照試劑盒內的說明書進行操作，同時設pAd-GIO環(huán)狀質粒及脂質體轉染作為對照。轉染11d～15d后，細胞出現病變，收集細胞培養(yǎng)物，凍融3次，離心后吸取上清液，接毒、收毒依次傳到第11代。分別提取不同代次細胞培養(yǎng)物的基因組，做PCR鑒定。

1.2.6 檢測目的蛋白表達 將制備的重組腺病毒感染293A細胞，經過24h后，移去培養(yǎng)基，使用冷的PBS漂洗1次，用細胞刮刀收取細胞。每孔細胞加入50μL細胞裂解液后在冰上放置30min，在4℃以15 000r／min離心10min。將適量細胞裂解液樣品進行SDS-PAGE和Western blot，方法參照文獻［16］。

1.2.7 測定重組腺病毒TCID50將rAd-gio用DMEM維持液依次進行10倍梯度稀釋后，分別接種長滿293A單層細胞的96孔細胞培養(yǎng)板，每個稀釋梯度重復接種8個孔，每個孔加入100μL。將加維持液的孔作為空白對照。在37℃、體積分數為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞病變情況，用Reed-Muench方法算出TCID50。

1.2.8 動物免疫試驗 將40只6周齡～周齡雌性Balb／c小鼠隨機分為2組，每組20只。第1組小鼠采用背部皮下分點注射2.3×108.0TCID50重組病毒rAd-gio，2兩周后加強免疫。第2組小鼠采用背部皮下分點注射107TCID50無外源基因的空腺病毒作陰性對照。首免2周和二免2、4、6周后，分別采集血清，用本實驗室自行優(yōu)化建立的方法檢測其中的PCV-2和PRRSV的抗體和中和抗體，操作方法參照文獻［17］。

2 結果

2.1 目的基因克隆及鑒定

擴增出的ORF2、IRES和GP5基因產物的大小分別為603、586、702bp（圖1）。pMD18-GP5經SalⅠ和BglⅡ雙酶切，得到2 700bp和603bp的兩條帶，pMD18-IRES經XhoⅠ和BglⅡ雙酶切，得到2 700bp和1 189bp的兩條帶，pMD18-ORF2經HindⅢ和BglⅡ雙酶切，得到2 700bp和1 891bp的2個條帶。

2.2 重組腺病毒穿梭質粒的構建

重組腺病毒穿梭質粒pG經SalⅠ和BglⅡ雙酶切，得到7 500bp和603bp的2個條帶，重組腺病毒穿梭質粒pGI經XhoⅠ和BglⅡ雙酶切，得到7 500bp和1 189bp的兩條帶，重組腺病毒穿梭質粒pGIO經HindⅢ和BglⅡ雙酶切，得到7 500bp和1 891bp的2個條帶（圖2）。

2.3 重組腺病毒質粒的獲得

將重組腺病毒質粒pAd-GIO使用PacⅠ酶切，能夠得到30 000bp和4 500bp的兩條帶（圖3），表明成功構建重組腺病毒質粒。

圖1 目的基因擴增結果Fig.1 The PCR results of target genes

2.4 重組腺病毒的鑒定

293A細胞轉染pAd-GIO后11d～15d發(fā)生病變。細胞變圓，核固縮，最后脫落；對照組細胞生長正常，收獲的重組腺病毒命名為rAd-gio。收毒后傳代11代，每代都做PCR鑒定，結果都能擴出目的條帶。Western blot結果表明該腺病毒能正確表達PRRSV GP5（圖4A）和PCV-2ORF2（圖4B）蛋白，將該重組腺病毒在293A細胞連續(xù)傳代到30代，pAd-GIO的滴度穩(wěn)定，平均TCID50為10-9.0／mL。

2.5 動物免疫試驗結果

間接ELISA結果表明，首免后2周即出現PRRSV特異性抗體，滴度可達1∶2 000，二免后2周達到1∶3 500，4周上升到1∶6 200，一直持續(xù)到試驗結束（圖5A），首免2周后即開始出現針對PCV-2的特異性抗體，抗體滴度為1∶350，二免2周后抗體滴度為1∶2 200，一直持續(xù)到試驗結束（圖5C）。

中和抗體結果表明，PRRSV特異性中和抗體出現較晚，首免2周后的小鼠沒能檢測到PRRSV特異性中和抗體，二免2周后，中和抗體滴度僅為1∶3，二免后4周和6周中和抗體滴度分別為1∶8和1∶11（圖5B），而對照組卻沒能檢測到PRRSV中和抗體。首免2周后所有小鼠PCV-2特異性中和抗體滴度均較低，二免2周后免疫組的中和抗體平均滴度為1∶13，4和6周時均為1∶15（圖5D），而對照組卻沒能檢測到PCV-2中和抗體。

圖2 重組穿梭質粒鑒定Fig.2 Identification of recombinant shuttle plasmids

圖3 重組腺病毒質粒鑒定Fig.3 Identification of recombinant adenoviral plasmid

3 討論

隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，臨床上出現的疾病越來越復雜，經常會出現多種疾病或病原混合感染的情況。其中以PCV-2和PRRSV混合感染的病例最多，在美國、西班牙、加拿大等國家有20%～60%的豬由于自然感染PCV-2和PRRSV從而引發(fā)疾病。最近幾年我國的很多地區(qū)陸續(xù)出現豬同時感染PCV-2和PRRSV兩種病毒的病例。雖然可以通過采用科學的飼養(yǎng)管理、改善飼養(yǎng)條件、降低飼養(yǎng)密度等方法減少其發(fā)生，但是不能有效預防此疾病。應用抗生素治療此病的效果并不明顯，豬一旦發(fā)病，很難被治愈，造成養(yǎng)豬業(yè)巨大的經濟損失。盡管國內外學者對該病進行了大量研究，目前還沒有有效的防控此病的方法，更沒有商品化的疫苗。所以，研究有效預防此病的疫苗對于我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)都有非常重要意義。

圖4 Western blot分析GP5和ORF2基因在293A細胞中的表達Fig.4 Western blot analysis of ORF2and GP5gene expression in 293Acells

圖5 免疫小鼠PRRSV、PCV-2特異性ELISA抗體和中和抗體檢測結果Fig.5 ELISA assay for PRRSV and PCV-2specific antibodies and analysis of neutralization antibodies of sera in immunized mice

試驗中采用的腺病毒載體系統(tǒng)是AdEasyTM系統(tǒng)［18］，骨架載體質粒pAdEasy-1含有除El和E3基因外的腺病毒大部分DNA和人為添加的稀有酶切位點PacⅠ，大腸埃希菌BJ5183是一種用來做重組的細菌，菌體內有重組酶，可以使經PmeⅠ線性化含有目的基因的重組穿梭質粒和pAdEasy-1質粒發(fā)生同源重組。腺病毒包裝受到很多外部因素的影響，如轉染試劑與DNA的比例、所使用DNA的質量、包裝細胞的生長狀態(tài)等［19］。此外，在轉染細胞時，最好每隔30min輕輕傾斜細胞培養(yǎng)皿，使腺病毒質粒DNA和細胞充分接觸，從而提高轉染效率。

小鼠免疫試驗結果顯示，小鼠接種重組腺病毒rAd-gio后能夠產生針對PCV-2和PRRSV的特異性ELISA抗體和中和抗體，首免2周后和二免2、4、6周后，分別采取小鼠血清檢測PCV-2與PRRSV的ELISA抗體和中和抗體，ELISA抗體檢測結果表明，首免后2周即出現PRRSV特異性抗體，PRRSV和PCV-2抗體滴度分別到1∶2 000和1∶350，二免后抗體滴度進一步升高，二免后2周PRRSV和PCV-2抗體滴度分別到1∶3 500和1∶2 200，二免后4周PRRSV和PCV-2抗體滴度分別到1∶6 200和1∶2 200，并可一直持續(xù)到試驗結束。中和抗體檢測結果表明，在首免后2周免疫組中和抗體滴度均較低，二免后中和抗體效價逐漸升高，二免后4周PRRSV和PCV-2中和抗體水平分別達到1∶13和1∶8，二免后6周PRRSV和PCV-2中和抗體水平分別達到1∶15和1∶11。對照組沒有檢測到PRRSV和PCV-2特異性抗體。

本試驗將PCV-2ORF2與PRRSV GP5基因串聯重組到腺病毒表達載體中，并在293A細胞中成功包裝成腺病毒，檢測結果表明重組腺病毒能在293A細胞內表達ORF2和GP5蛋白。試驗中選用的腺病毒表達載體已經進行了缺失E1（復制相關基因）和E3（毒性基因）基因人工改造，因此應用起來很安全。將該重組腺病毒免疫小鼠，用ELISA方法和病毒中和方法進行檢測小鼠的體液免疫情況，結果顯示重組腺病毒能誘導小鼠產生針對PCV-2和PRRSV的特異性ELISA抗體和中和抗體。將PRRSV GP5和PCV-2ORF2基因同時在同一載體中表達不僅可以一次完成免疫，避免反復免疫的麻煩，降低生產成本，減輕對動物造成的的免疫抑制，從而為預防PCV-2和PRRSV混合感染莫定了重要基礎。

［1］ 隋 慧，楊金生.豬繁殖與呼吸綜合征和豬2型圓環(huán)病毒病二聯核酸疫苗的構建及其免疫效力［J］.安徽農業(yè)科學，2009，37（11）：4991-4994.

［2］ Harms P A，Halbur P G，Sorden S D，et al.Three cases of porcine respiratory disease complex associated with porcine circovirus type 2infection［J］.J Swine Health Production，2002，10：33-38.

［3］ Lunney J K，Benfield D A，Rowland R R.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus：an update on an emerging and re-emerging viral disease of swine［J］.Virus Res，2010，154（1-2）：1-6.

［4］ Zhou L，Yang H C.Porcine reproductive and respiratory syndromein China［J］.Virus Res，2010，154（1-2）：31-37.

［5］ 沈武玲，喬自林，令世鑫，等.豬繁殖與呼吸綜合征疫苗研究現狀［J］.動物醫(yī)學進展，2012，33（1）：117-120.

［6］ 王憲文，王麗榮，姚四新，等.豬圓環(huán)病毒病的流行診斷和控制進展［J］.中國獸醫(yī)雜志，2012，48（4）：60-61.

［7］ 韓玉環(huán)，湯世坤，周雙海，等.豬圓環(huán)病毒2型實時定量PCR檢測方法的建立［J］.北京農學院學報，2010，25（3）：31-34.

［8］ 陳 濤，閆若潛，謝彩華，等.豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的表達及活性研究［J］.動物醫(yī)學進展，2009，30（2）：35-38.

［9］ 王 林，吳發(fā)興，吳美芹，等.PRRSV和PCV-2二重PCR檢測方法的建立及初步應用［J］.動物醫(yī)學進展，2010，31（6）：1-5.

［10］ 楊柳絮，侯 磊，周 宇，等.PRRSVORF5基因和CSFVE2基因重組真核表達質粒的構建及小鼠免疫試驗［J］.動物醫(yī)學進展，2009，30（6）：4-9.

［11］ 曾少靈，林慶燕，花群義，等.PRRSV云南A06株ORF5和ORF7基因的克隆與序列分析［J］.動物醫(yī)學進展，2010，31（3）：12-17.

［12］ 葉 芬，蔡家利.豬圓環(huán)病毒分子生物學研究進展［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2010（10）：26-28.

［13］ 何 雷，張彥明，向 華，等.表達豬白介素2基因重組腺病毒的構建及其免疫增強作用［J］.西北農業(yè)學報，2010，19（11）：1-7.

［14］ Sun Y，Liu D F，Wang Y F，et al.Generation and efficacy evaluation of a recombinant adenovirus expressing the E2protein of classical swine fever virus［J］.Res Vet Sci，2010，88（1）：77-82.

［15］ Wu J Q，Barab N D，Chau D，et al.Complete protection of mice against a lethal dose challenge of western equine encephalitis virus aftter immunization with an adenovirus-vectored vaccine［J］.Vaccine，2007，25（22）：4368-4375.

［16］ 李宏宇，孫 元，常天明，等.共表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因和豬瘟病毒E2基因的重組腺病毒的構建及其在小鼠模型上的免疫原性分析［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2010，32（3）：161-166.

［17］ 王先煒.豬圓環(huán)病毒2型人工感染和重組腺病毒基因工程疫苗研究［D］.江蘇南京：南京農業(yè)大學，2006.

［18］ 陳邦黨，馬 翔，馬依彤，等.細菌內同源重組法快速制備重組腺病毒［J］.新疆醫(yī)科大學學報，2009，32（12）：1667-1669.

［19］ Jinyong L，Zhong L D，Xiaoji L，et al.A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system［J］.Nature，2007，10：1236-1247.