贛南池塘養(yǎng)殖黑尾近紅鲌胚胎發(fā)育的研究

張愛芳 曹義虎 徐先棟 張建銘 曾柳根 張桂芳

(1.江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西南昌 330039 ;2.贛州市水產(chǎn)研究所，江西贛縣 341100;3.南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西南昌 330039)

黑尾近紅鲌(Ancherythroculter nigrocauda Yihet Woo)隸屬于鯉科、鲌亞科、近紅屬，是長江上游各支流中一種特有性魚類，與廣泛分布于各大水系的翹嘴鲌(culter alburuns Basilewsky)相比，其性情溫順，更易馴化養(yǎng)殖和捕撈，為我國目前規(guī)?；B(yǎng)殖的鲌類新品種。然而國內(nèi)學(xué)者對黑尾近紅鲌的研究起步比較晚，僅從1997 起才開始進(jìn)行研究，2000年以后才陸續(xù)報道黑尾近紅鲌的生物學(xué)、人工繁殖、生化成分、年齡與生長的關(guān)系等相關(guān)的研究［1～5］。目前，國內(nèi)學(xué)者已就胚胎發(fā)育［6～7］以及池塘養(yǎng)殖試驗［8］等方面開展了相關(guān)研究。贛州市水產(chǎn)研究所2008年從武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所引進(jìn)黑尾近紅鲌，并展開了人工繁殖［9］及人工養(yǎng)殖［10］的研究。本課題組已對池塘養(yǎng)殖條件下黑尾近紅鲌的可數(shù)可量性狀［11］、冬片培育技術(shù)［12］及黑尾近紅鲌幼魚的營養(yǎng)需求等展開了研究［13］。本研究中，作者對江西贛南地區(qū)人工引種黑尾近紅鲌胚胎時序和特征的觀察研究，為其苗種繁育技術(shù)的完善提供科學(xué)依據(jù)，以期為這一特有資源在江西地區(qū)的開發(fā)利用和保護(hù)種群數(shù)量提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗時間與地點

實驗于2012年6月28日－7月4日，在贛州市水產(chǎn)研究所進(jìn)行。

1.2 親魚的來源與選擇

1.2.1 親魚的來源

本研究中所用黑尾近紅鲌親本，均來自贛州市水產(chǎn)研究所，共計190尾，雌雄各半，全長247.7±38.9mm，體重568 ±43g。

1.2.2 親魚的選擇

人工催產(chǎn)親魚參照張建銘［9］等介紹，選擇體質(zhì)健壯，無傷病，各鰭完整的鲌魚。雌魚挑選腹部膨大，前后腹部豐滿圓潤，富彈性，腹部外突。腹部朝上時，可見明顯卵巢輪廓。生殖孔呈粉紅色，圓形外翻，用手輕輕擠壓有黃色卵子排出的親本。雄魚挑選鰓蓋、吻部、胸鰭條等部位珠星明顯，腹部較柔軟，生殖孔狹長，凹陷，呈粉紅色，擠壓腹部，有乳白色濃稠精液流出的親本。雌雄配比為1:1。

1.3 人工繁殖及受精卵的獲得

參照張建銘［9］等研究，雌性親本使用10μg/kg LHRH－A2，1000IU/ kg HCG 及5.0mg/kg DOM 三種激素混合使用，雄性親本劑量減半。采用一次注射的方法，注射方法為腹部注射法，注射部位為胸鰭基部。催產(chǎn)時間為17:00－19:00，11h后激素產(chǎn)生效應(yīng)，此時雌魚開始排卵，雄魚排精，6～7h 后結(jié)束。待發(fā)情后，將親魚取出，人工濕法授精，使流出的卵粒和精液混合滴在準(zhǔn)備好的裝滿水的瓷盤內(nèi)，盤內(nèi)已鋪滿干凈的載玻片(25mm×25mm)，用手拍打水面使卵均勻地粘著于玻片上，并將沾滿胚胎的載玻片放置孵化槽中進(jìn)行流水孵化，水溫為26.3～28.5℃。根據(jù)不同時期及發(fā)育的情況進(jìn)行，觀察間隔的時間有所不同。參考殷海成［7］等的報道對早期胚胎發(fā)育的觀察，每隔10～30min 取一次材料;中期胚胎時每隔0.5～1.0 h取材觀察;晚期胚胎時期每隔1.0～1.5h 取材觀察一次，每次隨機(jī)不少于5 片沾滿受精卵的載玻片，固定于4%的多聚甲醛液中。

1.4 胚胎發(fā)育的觀察

將固定好的粘有受精卵的載玻片放置于含有0.001mg 胰蛋白酶的PBS 緩沖液中，進(jìn)行消化處理，根據(jù)不同的發(fā)育時期，處理的時間分別為早期胚胎5～10mins，中期胚胎15～10mins;晚期胚胎25～35mins。取出胚胎并固定，在Olympus 顯微鏡下觀察并用數(shù)碼攝像系統(tǒng)拍照［6］。詳細(xì)記錄發(fā)育時間及各個發(fā)育時期的主要形態(tài)特征，按75%以上胚胎發(fā)育達(dá)到該期的時間，確定發(fā)育期。

2 結(jié)果

2.1 黑尾近紅鲌成熟卵特征

成熟的黑尾近紅鲌卵呈圓形，比重大于水，強(qiáng)粘性。顏色為淡紅色，透明性卵膜，卵黃呈端粒狀，成熟卵的直接為0.91 ±0.04mm(圖1)。

2.2 黑尾近紅鲌受精卵特征

精子與卵子結(jié)合后，受精卵吸水后稍稍膨脹，飽滿而富有彈性，受精卵的直徑為1.20 ±0.03mm(圖2)。受精后30min，胚胎原生質(zhì)向卵的一端流動集中，隆起并逐漸形成凸起的胚盤，帽狀胚盤、約占卵球的1/3。受精后25 min 后，在卵黃和卵膜之間形成富含透明液體的較寬的卵周隙，卵周隙為0.3 ±0.02mm(圖3)。

2.3 卵裂期

此時期包括從2 細(xì)胞到多細(xì)胞，7個發(fā)育階段。胚胎第一次卵裂為受精后1h20min，胚盤頂端中部下陷并逐漸加深形成分裂溝，繼而將胚盤分成大小相似的兩個分裂球，此時胚胎進(jìn)入2 細(xì)胞期(圖4)，分裂方式為經(jīng)裂。1h45min 后，發(fā)生第二次卵裂，形成4個大小相等的分裂球，卵裂溝與第一次卵裂垂，此時胚胎進(jìn)入4 細(xì)胞期(圖5)，分裂方式為經(jīng)裂。第三次卵裂發(fā)生在距離受精2h05min 后，形成8個細(xì)胞，整齊排列成兩行，分裂溝平行于第一次，垂直于第二次，細(xì)胞等大(圖6)，分裂方式為經(jīng)裂，胚胎進(jìn)入8 細(xì)胞期。此后胚胎分別在受精后2h25min，2h45min，3h10min 進(jìn)行第四次、第五次和第六次分裂，形成16 細(xì)胞期，32細(xì)胞期和64 細(xì)胞期。16 細(xì)胞期，分裂方式為緯裂，分裂溝與第一次垂直，有兩個分裂面，形成2層細(xì)胞，膨大呈盤狀，分裂球大小及形狀不同，周邊較大，中間較小(圖7)。32 細(xì)胞期，有4個分裂面，分裂成4 排，2 層，每層16個細(xì)胞排列，分裂球的排列開始不規(guī)則，邊緣分裂溝清晰(圖8)。64細(xì)胞期，此時分裂溝不明顯，分裂球大小不一，且無規(guī)則排列(圖9)。受精3h 30min 后，出現(xiàn)了水平分裂和切線分裂，分裂球越分越小，但界線尚清楚，分裂球大小不一，形狀不規(guī)則，排列不整齊，多層細(xì)胞疊加如同桑椹多細(xì)胞期即桑椹期(圖10)。

2.4 囊胚期

此階段可以分為早中晚三個時期。

囊胚早期:受精后3h50 min，分裂球進(jìn)一步分裂，細(xì)胞越分越小，數(shù)目不斷增加，分裂球細(xì)胞界限模糊，表面顯得平滑，胚胎細(xì)胞團(tuán)隆起而形成高胚胎，此期稱為囊胚早期(圖11)。

囊胚中期:受精后4h10 min，囊胚細(xì)胞向植物極移動，卵裂繼續(xù)進(jìn)行。囊胚層開始變薄向扁平發(fā)展，胚盤高度有所下降較囊胚早期低，界限難以分辨(圖12)。

囊胚晚期:受精后4h30 min，囊胚表面細(xì)胞進(jìn)一步的擴(kuò)散，并向卵黃囊部分下包，胎盤明顯變薄，胚胎進(jìn)入囊胚晚期(圖版13)。

2.5 原腸期

此階段包括三個時期，原腸早期、原腸中期及原腸后期。

原腸早期:受精后4h50 min，囊胚向卵黃四周擴(kuò)展下延，進(jìn)一步的外包，細(xì)胞積累在囊胚的外周邊緣形成胚芽環(huán)(圖14)。

原腸中期:受精后5 h 20 min，胚環(huán)下包約1/2，胚環(huán)增厚(圖15)。

原腸晚期:受精后6 h 30 min，胚盤下包約3/4。(圖16)。

2.6 神經(jīng)胚期

受精后10h 50 min，胚盤繼續(xù)下包，胚體背面中間加厚形成神經(jīng)板，兩側(cè)形成神經(jīng)褶，進(jìn)一步愈合形成神經(jīng)管。隨著胚層進(jìn)一步下包，卵黃栓消失，胚孔逐漸變小直至封閉(圖版17)。

2.7 器官形成期

肌節(jié)出現(xiàn)期:受精后13h20 min，胚體中部模糊的出現(xiàn)3～4 對肌節(jié)，并逐漸向前、后依次增多，胚體頭部膨大，卵黃囊為規(guī)則圓球形(圖18)。

眼基出現(xiàn)期:受精后13h40min，胚體頭部兩側(cè)向外開始隆起，發(fā)育成為前腦、中腦和后腦原基;后端薄而寬，為尾部的發(fā)育原基。在頭部中央兩側(cè)，有一對橢圓形的突起，即眼的原基(圖19)。

眼囊期:受精后14h50 min，已見清晰的眼囊，性狀為橢圓形，出現(xiàn)于胚胎的前端，同時前端隆起更多，可初步的分為前腦泡、中腦泡和后腦泡。肌節(jié)數(shù)量增多，已出現(xiàn)7～8 對(圖20)。

尾芽期:受精后15h30 min，胚體逐漸展長，胚體末端增厚，邊緣出現(xiàn)皮皺，在末端出現(xiàn)錐狀尾牙，游離出卵黃囊，尾芽部有一層膜狀結(jié)構(gòu)把胚體與卵黃囊隔開，眼囊輪廓清晰，且眼囊逐漸變圓。肌節(jié)數(shù)量進(jìn)一步的增多，已達(dá)12～14 對(圖版21)。

耳囊期:受精17h30min 后，在后腦兩側(cè)出現(xiàn)耳囊，呈小泡狀。眼囊開始內(nèi)陷成胚杯，體節(jié)15～16 對，尾芽與卵黃囊開始分離，為耳囊期(圖22)。

尾鰭出現(xiàn)期:受精后19h30min，胚體繼續(xù)延長，胚體尾部的邊緣出現(xiàn)皮褶，尾部離開卵黃囊，出現(xiàn)尾鰭，此時還可見胚體呈微弱的間歇性(圖23)。

晶體形成期:受精后20h30min，脊索非常清晰，眼囊隨著胚胎發(fā)育而不斷擴(kuò)大并向外伸展，通過此處外胚層的誘導(dǎo)作用，使眼囊內(nèi)陷而成雙層壁的眼杯。此后又通過一定的誘導(dǎo)作用形成眼的水晶體原基，直到形成晶體。此時還可見胚體呈微弱的間歇性顫動，肌節(jié)已達(dá)17～18 對(圖24)。

肌肉效應(yīng)期:受精21h20min 后，胚體開始出現(xiàn)間斷性微弱的肌肉收縮，收縮時從背部肌節(jié)開始向尾部傳遞，繼而尾部開始擺動(圖25)。

心臟出現(xiàn)期:受精后22 h 55 min，耳囊中出現(xiàn)一對耳石。在脊索前，卵黃囊前上方，有一串細(xì)胞，即為心臟原基，且開始跳動，胚胎出現(xiàn)血液循環(huán)，血液無色。肌節(jié)已達(dá)22 對(圖26)。

出膜期:受精后36h30 min，開始出膜，1h50 min 出膜完畢。剛出膜的仔魚無色透明，全長為3.98 ±0.37mm，卵黃囊在魚體下方呈現(xiàn)前粗后細(xì)的錐體(圖27)。

3 討論

魚類胚胎發(fā)育速率和出膜率受外界因子影響較大，主要因子有水溫、溶解氧、光照、水質(zhì)以及敵害生物等［14］。魚類的胚胎發(fā)育都需要一個適合的水溫范圍，如果超過或是低于這個范圍，胚胎發(fā)育將停滯、異?；蚴撬劳觥Ｔ诤线m的水溫范圍內(nèi)，卵的發(fā)育時間與溫度呈正相關(guān)［15］。魚卵發(fā)育對溶解氧要求隨種類，卵的類型和特點而不同，魚卵所需氧氣是通過擴(kuò)散得到的，受精卵在不同階段對需氧量要求也不一樣［16］。薛正楷［17］提出黑尾近紅鲌繁殖產(chǎn)卵最低水溫17℃，最適水溫19～24℃，但沒有提出產(chǎn)卵繁殖的最高溫度。本研究中胚胎發(fā)育的溫度為26.3～28.5℃，說明黑尾近紅鲌胚胎能夠在28.5℃水溫中存活，與張建銘［9］報道的結(jié)果一致。采用流水孵化的方法給氧，胚胎能正常發(fā)育，說明流水能夠滿足黑尾近紅鲌的胚胎發(fā)育耗氧量的需求，這與方耀林［18］等報道的團(tuán)頭魴胚胎發(fā)育耗氧量的研究一致。

在人工養(yǎng)殖環(huán)境下，水體的理化因子、餌料來源和營養(yǎng)配比的不同對親魚產(chǎn)生影響，從而進(jìn)一步對成熟卵的顏色及卵徑的大小產(chǎn)生影響［19］。劉丹陽［20］等曾報道興凱湖翹嘴紅鲌、太湖翹嘴紅鲌、巢湖翹嘴紅鲌和海南紅鲌的成熟卵的顏色、吸收后卵徑的大小、吸收后卵周隙及受精卵類型非粘性卵存在著差異性，并指出這種差異性是由于生態(tài)差異及生境差異而導(dǎo)致的。本研究中贛南地區(qū)人工養(yǎng)殖黑尾近紅鲌的卵的顏色及卵徑的大小與殷海成等［7］報道的一致，成熟的黑尾近紅鲌卵呈圓形，比重大于水，強(qiáng)粘性。顏色為淡紅色，透明性卵膜，卵黃呈端粒狀，成熟卵的直接為0.91 ±0.04mm，并沒有出現(xiàn)因為環(huán)境因素的改變而帶來成熟卵子生理生化的改變。這也表示著贛南地區(qū)人工養(yǎng)殖的黑尾近紅鲌的性腺發(fā)育良好，從而進(jìn)一步佐證了贛南地區(qū)適合黑尾近紅鲌的人工養(yǎng)殖，這與本項目組先前的報道一致。

溫度是影響一個物種胚胎發(fā)育速率的主要環(huán)境因素，一般情況下，同種魚類的受精卵在不同溫度條件下，胚胎發(fā)育所需的時間存在一定的差異，通常溫度越高孵化時間越短［21］。殷海成［7］等報道黑尾近紅鲌從受精到出膜在24.5℃時需要約50h;Xiong 等［6］報道在水溫為25.7～27℃(平均水溫26.5℃)條件下，整個發(fā)育過程需要43 h 15 min;而本研究發(fā)現(xiàn)贛南地區(qū)人工養(yǎng)殖黑尾近紅鲌的胚胎在水溫為26.3～28.5℃(平均水溫27.5℃)條件下，整個胚胎發(fā)育過程需要36h30min，這表明溫度是影響黑尾近紅鲌胚胎發(fā)育一個重要的環(huán)境因素，溫度越高所需要的發(fā)育時間越短，這也與鯉科魚類發(fā)育特征一致［22］。贛南地區(qū)人工養(yǎng)殖黑尾近紅鲌胚胎發(fā)育的特征與之前報道的結(jié)果類似，主要區(qū)別在于胚胎各個時期發(fā)育時間的差異性。由不同溫度下黑尾近紅鲌發(fā)育時期所需要的時間(表1)可知:在卵裂期，胚胎在平均水溫27.5℃所需要的時間與平均水溫24.5℃［7］所需要的時間基本一致，而在平均水溫26.5℃所需要的時間比前2個溫度要短，卵裂期胚胎并沒有隨著溫度的升高呈下降趨勢。這與梁正其［23］報道的普安銀鯽的胚胎隨著溫度的升高，發(fā)育時間逐漸縮短的結(jié)果不一致。這也表明黑尾近紅鲌的胚胎在發(fā)育早期存在最佳發(fā)育溫度;在胚胎發(fā)育的中晚期，三種溫度下黑尾近紅鲌的發(fā)育的時間基本上一致;出膜期，平均水溫為24.5℃時需要25h 才能完成出膜，平均水溫26.5℃時需要20h 才能完成出膜，平均水溫為27.5℃時近需14h 就能完成出膜，由此可見溫度對黑尾近紅鲌出膜期影響非常明顯。據(jù)此可以推測溫度對黑尾近紅鲌胚胎發(fā)育的影響主要是在胚胎發(fā)育的早期與出膜期，這可為黑尾近紅鲌的人工繁殖提供指導(dǎo)。

表1 不同溫度下黑尾近紅鲌胚胎發(fā)育時間

圖1-27 不同發(fā)育時期黑尾近紅鲌的主要形態(tài)特征

［1］薛正楷，何學(xué)福.黑尾近紅魚白的年齡和生長研究［J］.西南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2001，26(6):712－717.

［2］薛正楷，何學(xué)福.黑尾近紅鲌的個體繁殖力的研究［J］.西南師范大學(xué)學(xué)報，2001，26(1):90－94.

［3］譚德清，王劍偉，但勝國.黑尾近紅鲌含肉率及肌肉營養(yǎng)成分分析［J］.水生生物學(xué)報，2004，28(2):68－74.

［4］譚德清，王劍偉，嚴(yán)太明，等.黑尾近紅鲌人工繁殖研究［J］.長江流域資源與環(huán)境，2004，13(2):193－196.

［5］白曉慧，王貴英，熊傳喜.不同年齡黑尾近紅鲌消化酶活性比較［J］.淡水漁業(yè)，2007，37(3):30－33.

［6］M.Xiong，Y.Qiao，H.Rosenthal et al.，Early ontogeny of Ancherythroculter nigrocauda and effects of delayed first feeding on larvae J.Appl.Ichthyol.22 (2006)，502–509.

［7］殷海成，呂海英.黑尾近紅鲌人工繁殖及胚胎發(fā)育的研究［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報，2010，25(3):265～269.

［8］王貴英，張訓(xùn)蒲，李清.黑尾近紅鲌在人工養(yǎng)殖條件下的生長［J］.福建水產(chǎn)，2009，3:77～83.

［9］張建銘，曾慶祥，張家海，等.黑尾近紅鲌人工繁殖技術(shù)研究［J］.水產(chǎn)科技情報，2011，38(2):74～76.

［10］曾慶祥，朱恩華，張家海，等.黑尾近紅鲌池塘養(yǎng)殖試驗［J］.中國水產(chǎn)，2010(3):37～38.

［11］曹義虎，馬保新，鄧勇輝，等.池塘養(yǎng)殖條件下黑尾近紅鲌(0 +～2齡)的可量性狀研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39 (33):20498～20500.

［12］曹義虎，陳蓉，鄧勇輝，等.黑尾近紅鮊冬片魚種池塘培育技術(shù)試驗［J］.江西水產(chǎn)科技，2011(2):30～33.

［13］丁立云，曹義虎，周秋白，等.黑尾近紅鲌幼魚對蛋白質(zhì)營養(yǎng)需求的初步研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(10):216～218.

［14］王國恩.魚類早期胚胎發(fā)生及環(huán)境影響［J］.東北師大學(xué)報(自然科學(xué)版)，1988，3:115～131.

［15］Hokanson KEF.Temperature requirements of some percids and adaptations to the seasonal temperature cycle［J］.Journal of the Fisheries Board of Canada，1977，34(10):1524～1550.

［16］Heath D D，Devlin R H，Heath J W，Iwama G K.Genetic environmental and interaction effects on the incidence of jacking in Oncorhynchus tshawytscha (chinook salmon)［J］.Heredity，1994，72(2):146～154.

［17］薛正楷.瀨溪河黑尾近紅鲌生物學(xué)的初步研究.西南師范大學(xué)碩士學(xué)位論文，2001.

［18］方耀林，余來寧.團(tuán)頭妨及其胚胎耗氧率的研究［J］.淡水漁業(yè)，1991，(003):21～23.

［19］Balon E K.Types of feeding in the ontogeny of fishes and the life－h(huán)istory model［J］.Environmental Biology of Fishes，1986，16(1):11－24.

［20］劉丹陽，司力娜，張曉光，等.興凱湖翹嘴鲌胚胎和仔魚發(fā)育的研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，43(3):110～116.

［21］Rombough P J.The effects of temperature on embryonic and larval development［J］.Cambridge University Press，1997，61:177～224.

［22］劉筠.中國養(yǎng)殖魚類繁殖生理學(xué)［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1993:20～101.

［23］梁正其，馬珊，姚俊杰，等.普安銀鯽胚胎發(fā)育的初步研究［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2012，31(6):316～320.