硫酸軟骨素提取與純化方法研究

陳婷 嚴(yán)凌苓 成長玉

(1.江西生物科技職業(yè)學(xué)院動科系，江西南昌 330200 ;2.達(dá)州市食品藥品檢驗所，四川達(dá)州 635000)

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，簡稱CS)是來自動物軟骨組織的一類天然的酸性黏多糖(muc－opolysaccharide)——糖胺聚糖。研究發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)主要是作為治療風(fēng)濕和類風(fēng)濕疾病的藥物。近年來，隨著對其生理功能和生化性質(zhì)研究的深入，發(fā)現(xiàn)CS 具有抗凝、抗炎、抗血栓、抗癌及降低心肌耗氧量，促進(jìn)冠狀動脈循環(huán)、降血脂、抗凝血和防止血管硬化等作用［1］。對冠心病、動脈粥樣硬化、心絞痛、心肌缺氧、心肌梗塞等心血管疾病的治療有一定療效;還對神經(jīng)細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、腎細(xì)胞等具有保護(hù)作用;CS 還可活化脂解酶，使脂肪降解，因此是防止肥胖有效物質(zhì);CS 可與某些物質(zhì)調(diào)制成化妝品用于保護(hù)皮膚的健美;CS 還具有保水性、保膠性和高粘性，我國出口到日本、韓國的CS 都被用作食品添加劑。因此CS 是國內(nèi)外流行的保健品和化妝品以及醫(yī)藥品的重要原料［2］。

1 硫酸軟骨素的概況

1.1 種類與分布

硫酸軟骨素是一種酸性粘多糖——糖胺聚糖，有多種異構(gòu)體，它們均由D－葡萄糖醛酸、N－乙酰－D－氨基半乳糖硫酸脂為單位組成。只是硫酸基團的位置不同而有A、C、D和E 四種異構(gòu)體。

硫酸軟骨素為結(jié)締組織的基本成分，與其他粘多糖共存，分布很廣。玻璃樣軟骨、頸韌帶、角膜、骨、軟骨肉腫、動脈、髓核、鞏膜、齒、人血清、尿、牛腦及脊髓、鹿茸及鹿角、長吻角鱉軟骨、烏賊皮中均含有。在軟骨中的含量占干燥量的20～40%。玻璃樣軟骨中也由于動物種、年齡、部位、疾病等不同，硫酸軟骨素的種類及量也不同。自然界中硫酸軟骨素多存在于動物軟骨、喉骨、鼻骨(豬含41%)、牛、馬中膈和氣管(含36%～39%)中，其他如腿骨、韌帶、皮膚、角膜等組織中也含有。魚類軟骨中含量很豐富，如鯊魚骨中含50%～60%，結(jié)締組織中含量很少。腔腸動物、海綿動物、原生動物也含有硫酸軟骨素。

1.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)

硫酸軟骨素是氨基己糖和葡萄糖醛酸交替連接而成的直鏈分子，通常含有50～70個雙糖單位，分子量為10000～50000D［3］。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同硫酸軟骨素可分為硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B、硫酸軟骨素C、硫酸軟骨素D和硫酸軟骨素E 等多種類型，如下圖所示［4］。

1.3 物理性質(zhì)

硫酸軟骨素為白色、無臭、略帶咸味的固體粉末。由于其分子結(jié)構(gòu)中帶有羥基、羧基、硫酸基等極性基團，故具有較強的吸濕性、易溶于水、難溶于甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、乙醚等多種有機溶劑。硫酸軟骨素的水溶液呈粘稠性，在強酸、強堿及高溫條件下易降解為分子量較小的低聚糖，導(dǎo)致溶液粘度下降［5］。

1.4 化學(xué)性質(zhì)

多數(shù)硫酸軟骨素含有－SO3H和－COOH 等基團，是一種聚陰離子的高分子化合物，易與Na+、K+、Ca2+、Mg2+等陽離子結(jié)合［6，7］。

1.4.1 還原性

硫酸軟骨素含有半縮醛基，具有還原性，可將堿性酒石酸銅溶液中的Cu2+還原成紅色的氧化亞銅。

1.4.2 降解反應(yīng)

硫酸軟骨素在中性低溫條件下較穩(wěn)定，而在高溫強酸條件下易發(fā)生降解反應(yīng)，使其分子量降低。硫酸軟骨素也可在硫酸軟骨素裂解酶ABC或硫酸軟骨素裂解酶B 等的作用下發(fā)生降解。

1.4.3 沉淀反應(yīng)

硫酸軟骨素含有的硫酸基可與Ba2 +離子發(fā)生沉淀反應(yīng)，沉淀物(BaSO4)在鹽酸或硝酸中均不溶解。

1.4.4 糖脎試驗

硫酸軟骨素可與苯肼在一定條件下發(fā)生反應(yīng)生成糠脎［8］。

2 硫酸軟骨素的提取

硫酸軟骨素屬于酸性黏多糖，廣泛存在于動物的器官軟骨，目前酸性黏多糖的提取方法主要有降解法和非降解法.非降解法僅用于非蛋白多糖的黏多糖—透明質(zhì)酸，而降解法適用于包括透明質(zhì)酸在內(nèi)的所有酸性黏多糖。硫酸軟骨素的提取采用降解法，降解法又包括堿提取法和蛋白酶提取法兩種。根據(jù)這些性質(zhì)，硫酸軟骨素的提取方法有很多，歸納起來，主要有以下幾種［9］:

2.1 中性鹽法

先用l0%氯化鈣提取，氯仿－戊醇(1:4)除去蛋白質(zhì)，2倍量乙醇沉淀，最后以Lloyd 試劑精制。而以透析法除雜質(zhì)、氯化六氨合鈷純化，或一磷鎢酸純化，均可使工藝簡化。以30%氯化鉀或30%氯化鉀加1%碳酸鉀提取，高嶺土吸附除去雜蛋白，可提高產(chǎn)品收率。該方法提取的產(chǎn)品較白，各項指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)，也不會造成環(huán)境污染，但是產(chǎn)率較低，造成原材料的大量浪費，對經(jīng)濟效益有一定的影響。

2.2 堿提取法

2.2.1 濃堿提取法

將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入骨質(zhì)量1.5倍的l5%氫氧化鈉溶液，室溫下進(jìn)行浸提l2～16 h(分兩次進(jìn)行)，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值到2.8～3.2，雙層紗布過濾30 min，留下濾液。將濾液調(diào)節(jié)pH 到8.5～9.0，按骨質(zhì)量的4%加入胰蛋白酶，于50～54℃水解6 h，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 到6.5，升高溫度到80～90℃，加入活性炭進(jìn)行脫色反應(yīng)，然后過濾，在濾液中加入1.5倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀分層4h，所得沉淀即為硫酸軟骨素，在60℃下干燥即得最終產(chǎn)品。

2.2.2 稀堿提取法

將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入骨質(zhì)量6倍的2%氫氧化鈉溶液，60℃下進(jìn)行浸提24 h(分兩次進(jìn)行)，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值到2.5～3.0，雙層紗布過濾，留下濾液。將濾液調(diào)節(jié)pH 值到8.5～9.0，按骨質(zhì)量的4%加入胰蛋白酶，于5O～54℃水解7 h，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 到5～7，升高溫度到80～90℃，加入0.5%活性炭進(jìn)行脫色反應(yīng)，然后過濾，在濾液中加入1.5倍體積的無水乙醇和1.5%的氯化鈉溶液進(jìn)行沉淀分層6h。所得沉淀再次加入1.5%的氯化鈉溶液和3倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，所得即為硫酸軟骨素，然后在60～65℃下干燥即得最終產(chǎn)品。

2.3 堿鹽法

2.3.1 稀堿稀鹽提取法

將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入均為骨質(zhì)量6倍的0.5%氫氧化鈉和2%的NaC1 混合溶液，室溫下進(jìn)行浸提30 h(分兩次進(jìn)行)，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值到8.5～9.0，加入骨質(zhì)量4%的胰蛋白酶進(jìn)行水解。水解后升溫到80～90℃，加入骨質(zhì)量1.5%的滑石粉，過濾;加入1.7倍體積的無水乙醇進(jìn)行沉淀，過濾后再加入1.5%的氯化鈉溶液進(jìn)行沉淀過濾;加入1.7倍體積的無水乙醇再次進(jìn)行沉淀過濾，所得沉淀物于60℃下干燥即得最終產(chǎn)品。

2.3.2 稀堿濃鹽提取法

將粉碎好的軟骨碎片稱重后，加入骨質(zhì)量5倍的0.4%氫氧化鈉和20%的氯化鈉混合溶液(pH 值為13)，室溫下進(jìn)行浸提30h(分兩次進(jìn)行);用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值到7.8，升溫到80～90℃，加入骨質(zhì)量4%的滑石粉，將鹽解液調(diào)節(jié)pH 值到2～3，過濾1h;將濾液加入1.5倍體積的水進(jìn)行稀釋，同時調(diào)節(jié)pH 值到6.5;加入1.7倍體積的無水乙醇沉淀12h，將沉淀物加入1.5%的氯化鈉溶液進(jìn)行沉淀過濾;加入1.7倍體積的無水乙醇再次沉淀8h，所得沉淀物于60℃下干燥即得最終產(chǎn)品。

2.4 酶提取法

2.4.1 稀堿——酶解提取法

鄒開朗［10］等提出稀堿與酶解相結(jié)合法生產(chǎn)硫酸軟骨素。先將軟骨在80℃水中煮4－6 h，然后按原料(干質(zhì)量)與2%氫氧化鈉的比例為1:6.25的量加入氫氧化鈉溶液，室溫提取1.5 h，然后用鹽酸調(diào)pH 值到6.0－6.5，雙層紗布過濾:留下濾液，濾渣再以1:0.12的質(zhì)量比加入2%的氫氧化鈉溶液，于40℃下提取lh，再用雙層濾布過濾;棄濾渣，取濾液。合并2次濾液，并測量體積待用。濾液調(diào)節(jié)pH 值到8.0～9.0，按濾液與胰酶1000:0.5的比例加入胰酶，于40～50℃水解lh 后，再按1000:0.5的質(zhì)量比加入胃蛋白酶，40～50℃水解1.5h，過濾后加入高嶺土和活性炭附。用氯仿反萃取法萃取濾液，留水層。調(diào)水層pH 值至6.8～7.2，再加入2.5倍體積的95%以上乙醇沉淀，即得硫酸軟骨素。

2.4.2 復(fù)合酶酶解提取法

王鳳琴［11］等用復(fù)合酶解法提取硫酸軟骨素。把豬肋、喉、氣管等軟骨預(yù)處理后，以骨粉1:3的比例加入去離子水，加入原料量1%的復(fù)合酶，于55℃攪拌酶12～15 h。復(fù)合酶水解液用鹽酸調(diào)pH 值7.5，加入2%的醋酸鈉溶液，攪拌溶解后，升溫到85℃，保溫20min，過濾去殘渣，濾液加入胰酶酶解。經(jīng)酶解后的酶解液在85℃下維持15min，過濾，乙醇沉淀，干燥磨粉后得成品。影響該工藝水解反應(yīng)的因素為酶解溫度、pH 值與加酶量，利用正交試驗得出優(yōu)化條件為溫度50℃、pH值8.6～8.9、加酶量0～39L，收率達(dá)17.84%。采用全新的雙酶酶解工藝和中空纖維超濾等現(xiàn)代技術(shù)生產(chǎn)硫酸軟骨素，由于酶作用專一性強的特點，質(zhì)量穩(wěn)定、收率高，產(chǎn)品顏色潔白，生產(chǎn)周期較短。

2.4.3 酶解－樹脂提取法

將軟骨絞碎，加1 mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡，40℃保溫水解2 h 或加pH 值為7.5的水浸泡，用蛋白酶55℃保溫水解20 h，再加鹽酸中和至近中性，過濾;調(diào)整濾液中NaCI 濃度達(dá)到0.5 moI/L后，將溶液通過Amberlite IRA－933 離子交換樹脂柱吸附完畢;用0.5 mol/L的NaCI 液洗滌，再用1.8moI/L的氯化鈉液洗脫，流速2 L/h，洗脫液脫鹽，乙醇沉淀，離心分離，收集沉淀，真空干燥，即得成品。應(yīng)用此工藝制得的硫酸軟骨素樣品，經(jīng)紙電泳檢查為單一區(qū)帶，抗原物質(zhì)試驗結(jié)果為陰性，含硫量為7.2%。其優(yōu)點是酶水解或稀堿水解與樹脂交換技術(shù)相結(jié)合，保證了硫酸軟骨素分子不降解，解決了成品純度的問題。該方法簡便，收率高，是一種較有實用價值的制備方法［12］。

2.5 超聲輔助法

超聲輔助法是利用超聲波的空化作用，使物料周圍形成空穴，從而有利于硫酸軟骨素提取的方法。采用超聲輔助的堿提酶解法提取硫酸軟骨素，其提取物中硫酸軟骨素的含量和得率并無明顯提高，但可大大縮短提取時間。

蒲志軍［13］等利用超聲波法制備硫酸軟骨素，其原理是在堿性條件下蛋白質(zhì)易離解和超聲波的熱學(xué)機制促使蛋白質(zhì)快速解離而達(dá)到去雜蛋白的目的，然后升溫(85～90℃)均能使解離的蛋白質(zhì)變性吸附到白陶土上，從而使硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)分離，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

2.6 乙酸抽提法

Nakand［14］等利用乙酸水溶液提取硫酸軟骨素。先把鮮軟骨上的脂肪、肉及其他軟組織去掉，在－20℃冷凍，使用前在4℃解凍，把軟骨放在水中，用乙酸調(diào)節(jié)pH 值為4.5，在37℃下抽提7 h。抽提液沸騰濃縮后，在90℃下干燥即得硫酸軟骨素粗品，影響硫酸軟骨素浸出率的主要影響因素是pH 值。該工藝流程簡單，成本較低，可以考慮商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。但是目前在國內(nèi)還沒有廠家用這種工藝生產(chǎn)硫酸軟骨素。

3 硫酸軟骨素的純化

3.1 溶劑法

溶劑法是利用軟骨中不同化學(xué)成分的溶解性差異，而將硫酸軟骨素與其它雜質(zhì)相互分離的純化方法［15］。硫酸軟骨素含有的硫酸基、羧基和羥基等親水性基團，使其易溶于水，不溶于乙醇、甲醇、丙醇和丙酮等有機溶劑。一定條件下，采用乙醇沉淀法可得到純度為70%～78%的硫酸軟骨素。將較低純度的硫酸軟骨素溶于濃度為2%(w/v)的NaCl 溶液中，加入定量乙醇，于低溫下靜置后離心，重復(fù)以上步驟可依次得到較高純度的硫酸軟骨素。采用甲醇和丙醇也可得到同樣的效果。

3.2 季銨鹽沉淀法

溶液中以聚陰離子形式存在的硫酸軟骨素可與季銨鹽類化合物(如溴化十六烷基三甲銨或氯化十六烷基吡啶等)形成水溶性很小的季銨鹽絡(luò)合物。這些絡(luò)合物在低離子強度的水溶液中不溶解，當(dāng)其增大到臨界離子強度時，可發(fā)生解離并溶解，利用該性質(zhì)可使硫酸軟骨素得到分離純化。季銨鹽類化合物沉淀法一般需要控制硫酸軟骨素的濃度為0.1%～1.0%(w/v)范圍內(nèi)，硫酸軟骨素與季銨鹽發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的質(zhì)量比為1:3，沉淀后季銨鹽的最終濃度應(yīng)大于0.05%(w/v)［16］。

3.3 超濾膜法

超濾膜法是利用濾膜孔徑的不同使硫酸軟骨素與其它非多糖類雜質(zhì)分離，而得到分子量分布范圍較窄且純度較高的硫酸軟骨素的方法。采用管形的三氧化二鋁膜純化硫酸軟骨素，其濾膜的孔徑分別為100nm、50nm、20nm，溶液的透過速度分別為90 L·h－1·m－2、60 L·h－1·m－2、43L·h－1·m－2，硫酸軟骨素的截流率均可達(dá)到100%，雜質(zhì)透過率分別為50%、65%、70%。

3.4 色譜法

溶液中的硫酸軟骨素以聚陰離子的形式存在，采用陰離子交換劑通過交換吸附可對其進(jìn)行純化。離子交換色譜法是依靠庫侖力的作用將物質(zhì)吸附在交換劑上，然后選擇合適的溶液進(jìn)行洗脫，達(dá)到其純化的目的［17］。采用Dowex－X2型強堿型陰離子交換樹脂，梯度洗脫體系為硼酸－氯化鈉溶液，流速為2.0mL·min－1，柱溫55℃，壓力為1.5～3.4kg·cm－2。當(dāng)氯化鈉溶液濃度為1.5mol·L－1時，可得到純度較高的硫酸軟骨素，回收率為85%。

3.5 電泳法

根據(jù)化合物所帶電荷類型和數(shù)量的不同，采用電泳法可將硫酸軟骨素與其它雜質(zhì)分離開。電泳法具有分辨率、目標(biāo)物純度和回收率均較高的特點。采用雙相電泳法純化硫酸軟骨素時，第一相電泳條件為pH 值6.0的吡啶/醋酸/水(10∶ 1∶ 89，v/v)緩沖液，電場強度為7.5V·cm－1，電泳時間為60min;第二相電泳條件為pH 值7.7 醋酸鋇緩沖液，電場強度為7.5V·cm－1，電泳時間為130min，可得到純度為82%(w/w)的硫酸軟骨素。采用瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0.05mol·L－1的1，2－二氨基丙烷緩沖液(pH9.0)，電流強度為50mA，電泳時間為80min，可得到純度為90%(w/w)的硫酸軟骨素，但其回收率僅為45%［18］。

4 展望

目前對CS的工藝研究大多是對現(xiàn)有方法的優(yōu)化，今后的研究仍會以減少提取劑用量、提高收率與產(chǎn)品純度為目標(biāo)，并逐漸將研究成果應(yīng)用于實際生產(chǎn)中。在結(jié)構(gòu)分析方面，則要優(yōu)化現(xiàn)有方法，加強對不同來源CS 及其衍生物結(jié)構(gòu)的認(rèn)識，并注重將活性與結(jié)構(gòu)研究相結(jié)合。

CS 是重要的生化藥物，因其特有的生物活性而廣泛用于臨床。未來的研究應(yīng)在加強生產(chǎn)工藝、分析技術(shù)和活性研究的基礎(chǔ)上開發(fā)新的CS 資源，重視擴展其在功能食品、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用。

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