納他霉素-蛋白質(zhì)復(fù)合物制備及其抑菌效果評(píng)價(jià)

趙曄，顧沁，張延杰，周戈，徐學(xué)明

1(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(咀香園健康食品(中山)有限公司，廣東 中山，528437)3(浙江老藝人生物科技有限公司，浙江 麗水，323000)

納他霉素(natamycin)，又名匹馬霉素或游鏈霉素(pimaricin)，是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌劑，分子式為C33H47O13，分子量為665.75，是一種兩性物質(zhì)，分子中有1 個(gè)堿性基因和1 個(gè)酸性基因，其電離常數(shù)pKa 值為8.35 和4.6，相應(yīng)的等電點(diǎn)為6.5，熔點(diǎn)為280 ℃［1］，微溶于水和甲醇，難溶于大部分有機(jī)溶劑;在水中的溶解度為50 ～100 mg/L。高溫、紫外線、氧化劑及重金屬等會(huì)影響其穩(wěn)定性［2］。

納他霉素是一種高效、安全、天然的抗真菌試劑，具有低劑量、高效率、抗菌作用時(shí)間長的特點(diǎn)，能夠?qū)Ｐ砸种平湍妇兔咕?，阻止絲狀真菌中黃曲霉素的形成。1982 年7 月，美國FDA 正式批準(zhǔn)納他霉素可用作食品防腐劑;1997 年3 月我國食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)將其作為增補(bǔ)品種批準(zhǔn)使用，批準(zhǔn)使用范圍為乳酪制品、肉類制品(肉湯、西式火腿)、廣式月餅、糕點(diǎn)表面、果汁原漿表面、易發(fā)酵食品加工器皿表面、發(fā)酵酒、沙拉醬等［3］。納他霉素的抑菌機(jī)理為溶解的納他霉素與細(xì)胞膜中的甾醇類物質(zhì)結(jié)合，改變細(xì)胞膜的通透性，從而達(dá)到抑真菌效果［1］。因而低水溶性就成為限制納他霉素抑真菌效果的主要因素［4-5］。

蛋白質(zhì)作為一種生物大分子，能與多種小分子物質(zhì)，如有機(jī)小分子染料、藥物、無機(jī)離子等形成復(fù)合物。作用方式主要是次級(jí)鍵，如氫鍵、范德華力、疏水作用力等。據(jù)報(bào)道，蛋白質(zhì)如β-乳球蛋白(β-LG)可與多種疏水小分子及兩性物質(zhì)形成復(fù)合物，有效地提高疏水分子的水溶性及穩(wěn)定性［6］。本文主要制備納他霉素及大豆分離蛋白的復(fù)合物來提高納他霉素的溶解性，并對(duì)復(fù)合物的抑菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)備

納他霉素(含量95%)，浙江銀象生物科技有限公司;大豆分離蛋白(SPI)，江南大學(xué)食品學(xué)院提供。

菌種:啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)青霉(Penicitlium sp. )、黑曲霉(Aspergilla sp. )、根霉(Rhizopus)，江南大學(xué)食品學(xué)院微生物基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室。

細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3 g ，蛋白胨10 g ，瓊脂20 g ，NaCl 5 g ，加水至1 000 mL ，pH 7.2 ～7.6。

酵母菌采用YPED 培養(yǎng)基:酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加水至1 000 mL，自然pH。

霉菌采用PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂12 ～15 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

MEB 液體培養(yǎng)基:麥芽浸膏20 g，加雙蒸水至1 000 mL，調(diào)pH 至6.9 ±0.2。上述培養(yǎng)基121 ℃高壓滅菌20 min，備用。

TU1901 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用;ZHWY-211C 恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司;ARA520 電子精密天平，美國OHAUS(奧豪斯)公司;生化培養(yǎng)箱;超凈工作臺(tái)(HS-3)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取適量納他霉素，加甲醇溶解，配制成一定的濃度，另取適量的大豆分離蛋白配成溶液，分別用紫外分光光度計(jì)在200 ～400 nm 掃描，得紫外光譜圖。精密稱取納他霉素對(duì)照品100 mg，置于100 mL 容量瓶中，加適量甲醇∶水∶乙酸(60∶40∶5)溶液溶解并定容至刻度，作為儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液，用甲醇∶水∶乙酸(60∶40∶5)溶液分別稀釋為0.5、1、2、3、4、5、6、10、20 mg/L。在λ319nm和λ303nm處測(cè)定吸光度，用雙波長法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［7］。

1.2.2 納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物制備方法

(1)0.5 g 納他霉素溶于80 mL 水(用4 mol/L NaOH 調(diào)pH 至11.5);(2)大豆分離蛋白溶于去離子水5% (w/w);(3)5 mL 上述大豆分離蛋白溶液加入80 mL 納他霉素溶液中攪拌一定時(shí)間;(4)用4 mol/L HCl 調(diào)pH 至5.8，加去離子水至100 mL。

1.2.3 大豆蛋白水解及水解度測(cè)定

水解樣品通過木瓜蛋白酶限制水解大豆分離蛋白制備:用去離子水配制1% SPI 溶液，室溫下攪拌2 h，使其充分水合，80 ℃下水浴10 min 后降溫至55 ℃，用NaOH 溶液調(diào)pH 至7.0，加入木瓜蛋白酶(E/S=3 %)開始酶解，在不同時(shí)間下取樣，樣品在90 ℃滅酶5 min，冷卻至室溫，調(diào)pH 至7.0，用pHstat 法測(cè)定大豆蛋白水解度，4 500 r/min 離心20 min后取上清液凍干。

1.2.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)及測(cè)定方法

納他霉素或復(fù)合物在pH =5.8 ～6.0 平衡溶解24 h 后，4 000 r/min 離心20 min，取上清液稀釋一定倍數(shù)后用雙波長紫外分光光度法測(cè)定溶解度。

1.2.5 納他霉素-蛋白質(zhì)復(fù)合物抑菌圈測(cè)定［8］

取直徑6 mm 的圓形濾紙片，滅菌。吸取20 μL不同復(fù)合物樣品滴到濾紙片上，無菌風(fēng)干備用。將滅過菌的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基放入超凈工作臺(tái)中冷卻至60℃后倒平板。每皿約20 mL，水平放置。用移液槍取0.2 mL 菌懸液加在平板上，用涂布棒均勻涂開。無菌鑷子夾取已風(fēng)干的濾紙片放在接過種的平板上。每皿放3 片，呈正三角形。每個(gè)樣品做3 組平行，放入培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)24 h。拍照記錄并測(cè)量抑菌圈大小。

1.2.6 納他霉素-蛋白質(zhì)最小抑菌濃度測(cè)定

1.2.6.1 納他霉素及納他霉素-大豆分離蛋白原液的制備

納他霉素原液:準(zhǔn)確稱量0.032 g 納他霉素溶于10 mL 無菌水，制得3 200 mg/L 納他霉素溶液懸濁液，吸取1 mL 上述溶液稀釋100 倍，制得32 mg/L 納他霉素原液，記為溶液①。

納他霉素-SPI 復(fù)合物原液:準(zhǔn)確稱量0.032 g 納他霉素溶于10 mL 無菌水，用4mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 至11.5 ～12，加0.32 mL 5%(w/w)SPI 溶液，反應(yīng)一段時(shí)間后調(diào)pH 至5.8，制得含納他霉素3200 mg/L 溶液，吸取上述溶液1 mL 稀釋100 倍，制得32 mg/L 納他霉素-SPI 原液，記為溶液②

1.2.6.2 試管二倍稀釋培養(yǎng)

取7 只滅菌的13 mm×100 mm 試管，編號(hào)為1 ～7，其中7 號(hào)為對(duì)照管。每只試管分裝1 mL 滅菌的MEB 液體培養(yǎng)基。按照表1 進(jìn)行操作。28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察記錄結(jié)果。終點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn):肉眼觀察法。按以下標(biāo)準(zhǔn)記錄MIC 結(jié)果，+ + +:菌生長較生長對(duì)照輕度減少;+ +:菌生長較生長對(duì)照明顯減少;+ :只有薄層菌生長;—:清晰透明。記錄結(jié)果，以清晰透明組對(duì)應(yīng)的抑霉菌劑濃度為最小抑菌濃度，即MIC。

表1 試管二倍稀釋法操作表Table 2 Operation method of two times dilution method

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜掃描圖

如圖1，納他霉素及納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物的紫外光譜顯示，在λ 為290，303，319 nm 處有3 個(gè)尖銳的最大吸收峰，這是納他霉素結(jié)構(gòu)中的環(huán)狀四烯結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的共軛峰。大豆蛋白的紫外光譜顯示，在λ280nm附近有寬峰。大豆蛋白在納他霉素最大吸收波長303nm，319 nm 處的吸收值分別基本沒有變化，且與納他霉素的吸收值相差較大，因此可以選定303 nm，319 nm 做為納他霉素含量測(cè)定波長，在此處蛋白質(zhì)吸收的ΔAλ1-λ2≈0，可以最大限度地減少蛋白質(zhì)吸收的干擾。

圖2 為納他霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到納他霉素的一元線性回歸方程為:ΔA = 0.0213C - 0.0009，R2=0.9998，式中:ΔA 為303 nm、319 nm 吸光度差值;C為濃度，μg/mL。結(jié)果表明，納他霉素吸光值差值與質(zhì)量濃度在0.5 ～20 mg /L 內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 納他霉素、納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物及大豆蛋白紫外光譜圖Fig.1 UV spectra of natamycin，natamycin-SPI and SPI

圖2 雙波長紫外分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of double wavelength UV spectrophotometry

2.2 納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物制備條件優(yōu)化

2.2.1 大豆蛋白水解度對(duì)納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物溶解度的影響

分別取方法1.2.3 制得的水解度DH% =0，2.5，5.43，6.24，6.76，7.43，8.21，9.01 的大豆分離蛋白制備復(fù)合物，所得復(fù)合物的溶解度結(jié)果見圖3。

圖3 蛋白質(zhì)水解度對(duì)復(fù)合物溶解度的影響Fig.3 Influence of different hydrolysis degree of SPI on solubility of natamycin-SPI complex

由圖3 可知，蛋白質(zhì)水解度與復(fù)合物中納他霉素溶解度變化的P ＞0.05，差異不顯著，總體趨于平穩(wěn)。因此使用商品性SPI 直接制備蛋白質(zhì)納他霉素復(fù)合物就工藝而言更簡單。

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物溶解度的影響

反應(yīng)時(shí)間分別為10，30，60，90，120，150 min，用方法1.2.2 制備復(fù)合物，所得復(fù)合物的溶解度結(jié)果見圖4。

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)合物溶解度的影響Fig.4 Influence of different reaction time on solubility of natamycin-SPI complex

由圖4 可知，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，納他霉素溶解度逐漸升高，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于120 min 時(shí)，復(fù)合物溶解度變化不大，趨于平穩(wěn)。因此選取120 min 作為反應(yīng)時(shí)間。

2.2.3 反應(yīng)溫度對(duì)納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物溶解度的影響

選取反應(yīng)溫度分別為30，40，50，60℃按方法1.2.2 反應(yīng)120 min 制備復(fù)合物，所得復(fù)合物的溶解度結(jié)果見圖5。

圖5 不同反應(yīng)溫度對(duì)復(fù)合物溶解度的影響Fig.5 Influence of different reaction temperature on solubility of natamycin-SPI complex

由圖5 可知，反應(yīng)溫度對(duì)納他霉素溶解度影響較大，隨著反應(yīng)溫度的升高，納他霉素溶解度升高，考慮到納他霉素?zé)岱€(wěn)定性較差，尤其在大于100℃環(huán)境中會(huì)很快失活［9］，選取40℃作為反應(yīng)溫度。

2.2.4 反應(yīng)濃度對(duì)納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物溶解度的影響

納他霉素濃度分別為1，2.5，5，7.5，10，12.5 g/L，以m(納他霉素)∶m(大豆蛋白)=2∶1 添加大豆蛋白溶液，按方法1.2.3 在40 ℃下反應(yīng)120 min 制備復(fù)合物，所得復(fù)合物的溶解度結(jié)果見圖6。

圖6 不同底物濃度對(duì)復(fù)合物溶解度的影響Fig.6 Influence of different concentration on solubility of natamycin-SPI complex

由圖6 可知，隨著反應(yīng)體系中納他霉素濃度的增加，復(fù)合物溶解度逐漸升高，當(dāng)納他霉素濃度大于5 g/L 時(shí)，復(fù)合物溶解度又隨之降低。選取5 g/L 作為反應(yīng)濃度。

2.2.5 不同配比對(duì)納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物溶解度的影響

以納他霉素5 g/L 作為反應(yīng)濃度，分別以納他霉素∶蛋白質(zhì)(N∶SPI)=10∶1，8∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2 的配比添加5% (w/w)大豆分離蛋白溶液，按方法1.2.2 在40 ℃下反應(yīng)120 min 制備復(fù)合物，所得復(fù)合物的溶解度結(jié)果見圖7。

圖7 不同配比對(duì)復(fù)合物溶解度的影響Fig.7 Influence of different proportioning on solubility of natamycin-SPI complex

由圖7 可知，隨著N∶SPI 的增大，復(fù)合物溶解度增大，但當(dāng)N∶SPI 大于4∶1 時(shí)，復(fù)合物溶解度不再隨配比增大而增大，因此選取納他霉素∶蛋白質(zhì)=4∶1作為反應(yīng)配比。

2.2.6 反應(yīng)pH 值對(duì)納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物溶解度的影響

反應(yīng)pH 分別設(shè)置為9.5，10，10.5，11，11.5，12，12.5，13，以納他霉素5 g/L 作為反應(yīng)濃度，以納他霉素∶蛋白質(zhì)(N∶SPI)=4∶1 的配比添加5%(w/w)大豆分離蛋白溶液，按方法1.2.2 在40 ℃下反應(yīng)120 min 制備復(fù)合物，所得復(fù)合物的溶解度結(jié)果見圖8。

圖8 不同反應(yīng)pH 值對(duì)復(fù)合物溶解度的影響Fig.8 Influence of different reaction pH on solubility of natamycin-SPI complex

由圖8 可知，反應(yīng)pH 對(duì)復(fù)合物溶解度影響較大，在反應(yīng)pH ＞11.5 時(shí)，復(fù)合物溶解度均較高，考慮到納他霉素在pH ＞12 的環(huán)境中易分解失活，選取pH=11.5 作為反應(yīng)pH。

2.3 納他霉素及納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物的抑菌圈

納他霉素及納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物對(duì)霉菌和酵母抑制活性的測(cè)定結(jié)果如表2。由表2 可以看出，以納他霉素及納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物對(duì)黑曲霉、青霉、根霉及啤酒酵母的抑菌圈直徑分別比較，經(jīng)顯著性分析，P 值分別為0.000 5、0.000 3、0.000 05、0.005，在P ＜0.05 水平上有顯著性差異。

表2 納他霉素、納他霉素-大豆分離蛋白復(fù)合物的酵母菌抑菌圈比較(單位:mm)Table 2 Inhibition zone of natamycin，natamycin-SPI

2.4 納他霉素及納他霉素-大豆分離蛋白復(fù)合物的最小抑菌濃度

如表3 培養(yǎng)結(jié)果所示，霉菌或酵母總數(shù)為104～105個(gè)/mL 時(shí)，納他霉素-大豆分離蛋白復(fù)合物對(duì)啤酒酵母的最低抑菌濃度是2 mg/L，對(duì)青霉的最低抑菌濃度是2 mg/L，對(duì)根霉的最低抑茵濃度是4 mg/L，對(duì)黑曲霉的最低抑茵濃度是2 mg/L，比納他霉素的最小抑菌濃度降低1 倍。

表3 試管二倍稀釋法培養(yǎng)結(jié)果記錄Table 3 Results recorde of minimum inhibitory concentration

3 結(jié)論

納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物對(duì)納他霉素的增溶效果顯著，經(jīng)過制備條件的優(yōu)化，在一定配比反應(yīng)一定時(shí)間后，溶解度能夠提高16 倍，達(dá)到1 600 mg/L;同時(shí)，在此制備條件下得到的納他霉素-大豆蛋白復(fù)合物的抑菌效果好于納他霉素的抑菌效果，最小抑菌濃度降低1 倍。

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