米根霉Fp-6 利用紅薯發(fā)酵生產L-乳酸

黃筱萍，黃國昌，印培民

(江西省科學院微生物研究所，江西 南昌，330029)

乳酸是世界上三大有機酸之一，在化工、醫(yī)藥、食品加工等領域有著廣泛的用途。目前，工業(yè)化生產L-乳酸多發(fā)玉米、大米和木薯淀粉糖為原料。隨著糧食來源食物作物的淀粉糖價格不斷攀升，乳酸發(fā)酵工業(yè)的利潤逐漸降低，因此開發(fā)低成本發(fā)酵工藝，尤其是采用各種廉價非糧生物質原料進行發(fā)酵生產是降低乳酸生產成本，促進聚乳酸產業(yè)快速發(fā)展的重要技術趨勢。

目前國內外尚未見有關以紅薯為原料進行L-乳酸發(fā)酵的報道，主要以細菌發(fā)酵菊芋、木質纖維素、木薯原料的研究居多，但是L-乳酸光學純度不如以米根霉生產菌高［1-3］。我們通過引進高產優(yōu)質的紅薯品種進行栽培，篩選出高淀粉產量的紅薯品種，并以之為原料進行了L-乳酸發(fā)酵的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

米根霉Fp-6(Rhizopus oryzae Fp-6)，由江西省科院生物技術有限責任公司分離保存。

1.1.2 紅薯品種

①梅營1 號;②秦薯5 號;③FL-19;④蘇薯303;⑤豫薯王;⑥徐薯22;⑦紅星431;⑧秦薯4 號。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基(%):馬鈴薯斜面(PDA)培養(yǎng)基，馬鈴薯200，蔗糖20，瓊脂20，水1 000 mL，pH自然。

(2)種子培養(yǎng)基(%):玉米淀粉5.0，葡萄糖5.0，(NH4)2SO40.135 ，無機鹽微量，CaCO31.0，115 ～120 ℃滅菌30 min。

(3)基礎發(fā)酵培養(yǎng)基(%):淀粉12，(NH4)2SO41.35，無機鹽 微量，消泡劑0.01 ～0.03，CaCO3在發(fā)酵過程中補加。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

(1)斜面菌種培養(yǎng):用少量無菌水(約5 ～10 mL)洗脫斜面孢子制成懸液，或直接挑取菌絲，接種于PDA 斜面上，于28℃培養(yǎng)10 ～14 d。

(2)一級種子液培養(yǎng):將斜面孢子洗脫液接入錐形瓶中，使培養(yǎng)基中孢子終濃度為1.0 ×106～2.0 ×106CFU/mL。于30℃，200 r/min 搖床培養(yǎng)12 ～16 h。

(3)二、三級種子液培養(yǎng):接種量5%，培養(yǎng)溫度，35 ℃，空氣流量0.1 ～0.25 vvm，轉速300 r/min，培養(yǎng)9 ～15 h。

(4)發(fā)酵:接種量5%，培養(yǎng)溫度35 ℃，通氣量:0.05 ～0.2 vvm，采用間斷添加25% ～30% 的無菌CaCO3溶液的方法控制pH 在5.5 ±0.5。

1.2.2 紅薯的預處理

(1)紅薯淀粉制備［4］:稱取紅薯100 kg，清洗，粉碎，用石磨研磨成漿，用2 ～3 倍體積的清水洗2 次，先后分別用20 目和100 目篩過濾，濾液靜置沉淀過夜，棄上清液，沉淀用清水清洗后靜置沉淀，棄上清液，沉淀置烘箱中烘干即為紅薯淀粉。

(2)去皮紅薯液化液的制備:紅薯蒸煮，去皮，磨碎，液化，濃縮備用。

(3)紅薯液化液的制備:紅薯蒸煮，磨碎，液化，濃縮備用。

(4)去有機N 紅薯液化液制備:紅薯洗凈稱重，加水粉碎，漿液靜置過夜，棄上清液，加水攪勻后靜置沉淀，棄上清液，液化，測定含糖量和總N 量，濃縮備用。

1.2.3 分析方法

(1)L-乳酸、富馬酸、甘油等含量分析:LC-10Avp型液相色譜儀(日本島津)，檢測器RID-10A 示差檢測器，色譜柱OAapak-A，柱溫40 ℃，流動相0.75 mmol/L H2SO4，分析流速1 mL/min，進樣量20 μL。

(2)L-乳酸光學純度分析:LC-10Avp 型液相色譜儀，檢測器SPD-10Avp 紫外檢測器，色譜柱SUMICHIRAL OA-5000(φ 4.6 mm×150 mm)，柱溫40 ℃，波長254 nm，流動相1 mmol/L CuSO4溶液，分析流速1 mL/min，進樣量10 μL。

(3)殘?zhí)菧y定:發(fā)酵液于10 000 r/min 離心5 min，取上清液，采用DNS 顯色法測定糖濃度。

(4)淀粉含量測定［5］:參照GB/T5009.9 -2003。紅薯洗凈去皮后，切成細絲，稱取100 g 左右，并加入等量的水，用豆?jié){機打成勻漿，立刻稱取勻漿10 g，參照GB/T5009.9—2003 中酸水解法進行檢測。

(5)水分測定［6］:參照GB/T 5009.3—2003。

(6)N 含量測定［7］:凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5—1985。

2 結果與討論

2.1 高淀粉紅薯品種的篩選和組分分析

共種植了8 個品種的紅薯，產量和組分見表1。

表1 不同品種紅薯畝產量和淀粉產量Table 1 Acre yield and starch acre yield of sweet potato varieties

紅星431 淀粉量最高，其次是豫薯王、梅營1 號、FL-19、秦薯5 號，其他低于20%，紅星431 淀粉含量和畝產淀粉量最高，但其含N 量也最高，雖然豫薯王淀粉含量比梅營1 號稍高，但其畝產量低，畝產淀粉亦低于梅營1 號，因此選用紅星431 和梅營1 號作為發(fā)酵試驗優(yōu)質品種。

2.2 紅薯淀粉的制備

分別取紅星431 和梅營1 號鮮薯各100 kg，制備發(fā)酵用粗紅薯淀粉原料，分別測定淀粉提取收率。

表2 鮮薯制備淀粉過程中各參數(shù)Table 2 Parameters in the process of starch preparation with fresh sweet potato

影響淀粉收率的原因可能有以下2 種:(1)紅薯的粉碎程度，顆粒粉碎的大小可能影響紅薯中的淀粉完全釋放出來;(2)在濾渣的洗滌過程中，由于洗滌條件限制，淀粉可能不能完全洗至水中，部分淀粉被帶到廢渣中而影響最后的淀粉收率。改進粉碎紅薯和洗滌設備可提高淀粉收率。

2.3 搖瓶發(fā)酵產酸試驗

2.3.1 不同預處理紅薯對L-乳酸產量的影響

以3 種不同預處理的紅薯為原料，折成淀粉量為120 g/L，分別液化后，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，采用一級種發(fā)酵，接種量10%，200 r/min，35 ℃培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結束后發(fā)酵液定容至100 mL，分別測定光學純度、乳酸含量、殘?zhí)橇亢途w干重。

表3 不同預處理紅薯原料對L-乳酸產量的影響Table 3 The effect of sweet potato starch with different pre-preparation on L-Lactic acid yield

與對照玉米淀粉為原料的產酸水平相比，搖瓶發(fā)酵48 h，利用紅薯淀粉為原料發(fā)酵產酸水平、菌體干重和殘?zhí)菨舛染c玉米淀粉相同。而使用紅薯液化液發(fā)酵過程中，菌絲體量大大增加，為淀粉原料的4～6 倍，且菌絲體纏繞成大塊的團狀，產酸水平大大下降，這可能是由于紅薯中含有較豐富的有機N 源，米根霉在富有機N 培養(yǎng)基中過度繁殖生長，在搖瓶培養(yǎng)過程中菌絲體纏繞成大塊的團狀，影響O2的傳質，不利乳酸的生成。去皮紅薯液化液為原料的培養(yǎng)液中其菌體濃度最高，表明紅薯皮中可能含有可抑制菌體生長的因子。雖然利用紅薯淀粉發(fā)酵生產L-乳酸產量與玉米淀粉相似，產量最高，但從發(fā)酵成本考慮，制備紅薯淀粉生產流程長，且會造成一部分淀粉流失，同時有大量有機廢水排放，增加發(fā)酵原料成本和廢水處理運行成本，因此以下試驗均采用紅薯液化糖作為發(fā)酵原料。

2.3.2 紅薯中的有機氮濃度對米根霉菌絲體的生長和產L-乳酸產量的影響

在玉米淀粉為原料的發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中添加不同濃度的有機N 源，有機N 來源為制備紅薯淀粉(紅星431)時的上清廢液，試驗Ⅰ組的有機N 的添加量分別為1.0，0.75，0.5，0.25 和0.125 g/L，不加無機N，試驗Ⅱ組除添加有機N 源外，再按常量添加無機N，分別考察有機氮濃度對菌體生長和產酸的影響，以及在不同有機N 濃度的條件下無機N 對米根霉發(fā)酵產酸的影響，結果見表4。

2 組試驗結果均表明，隨著紅薯中有機N 濃度的增加，菌體量明顯增加，為正常發(fā)酵菌量的2 ～6 倍。在未添加無機N 的條件下，發(fā)酵液中有機N 濃度低于0.5 g/L 時對產酸影響不大，但菌體量隨著有機N濃度的增加而明顯增加。當發(fā)酵液中有機N 濃度高于0.5 g/L 時，菌體生長過盛，嚴重影響產酸，產酸量明顯下降。在試驗Ⅱ組的結果與試驗Ⅰ組相似，但在相同的有機N 濃度條件下，添加無機N 能明顯促進乳酸的生成，尤其是在有機N 濃度低于0.5 g/L 時，加入無機N 源對產酸影響更加顯著。因此在以紅薯液化糖為原料發(fā)酵生產L-乳酸時，控制發(fā)酵液中有機N 濃度在0.5 g/L 內比較適宜。同時添加無機N 源有利于發(fā)酵產酸。

表4 有機N 和無機N 對米根霉發(fā)酵產酸的影響Table 4 The effects of organic N and inorganic N on L-Lactic acid fermenting by Rhizopus oryzea

2.3.3 C/N 比對L-乳酸發(fā)酵的影響

梅營1 號紅薯液化糖濃度為120 g/L 時，液化糖液中有機N 含量為0.51 g/L。玉米淀粉中有機N含量為0.13 g/L，(NH4)2SO4的添加分為2 組，一組按正常的添加量全部添加，另一組根據原料配比中的有機N 量，添加一定量的無機N 量，保持C/N=90。搖瓶發(fā)酵48 h，結果見表5。

表5 C/N 比對L-乳酸發(fā)酵的影響Table 5 The effect of C/N on L-Lactic acid fermenting

1 ～2 號為對照組，3 ～7 號為添加常量的無機鹽的試驗Ⅰ組，8 ～12 號為固定C/N 比為90 的試驗Ⅱ組。試驗Ⅰ組中隨著C 源配料中紅薯液化液添加量的增加，C/N 比從77 逐漸下降至54，菌體量和副產物甘油明顯增加，L-乳酸的產量逐漸減少，這進一步驗證紅薯液化糖中含有的有機氮會促使菌體生長過盛，導致菌絲結團，影響產酸速度和糖轉化率;當控制C/N 比為90 時，與對照組和試驗Ⅰ組相比，L-乳酸產量略偏低，且發(fā)酵液中副產物甘油和富馬酸含量明顯偏高，這表明無機N 對米根霉發(fā)酵生產L-乳酸具有促進作用。結果表明，適宜的C/N 比為在添加1.35 g/L 的(NH4)2SO4條件下，C/N 比≥65%有利于L-乳酸的發(fā)酵產酸。

2.3.4 50 L 罐發(fā)酵放大試驗

2.3.4.1 未去除有機N 的紅薯液化糖對發(fā)酵的影響

分別制備紅星431 和梅營1 號紅薯液化糖，當總糖濃度為120 g/L 時，紅星431 液化液和梅營1 號液化液中有機N 濃度分別為1.11 和0.51 g/L。根據搖瓶試驗結果，在50L 發(fā)酵罐中分別用玉米淀粉+紅星431 紅薯液化糖和梅營1 號紅薯液化糖為原料，試驗罐1 為玉米淀粉對照罐，罐2 為60 g/L 玉米淀粉+60 g/L 紅星431 紅薯液化糖，罐3 梅營1 號120 g/L紅薯液化糖，(NH4)2SO4添加量均為1.35 g/L，三罐為平行試驗，采用三級種發(fā)酵，比較發(fā)酵周期和糖轉化率。發(fā)酵結果見表6，發(fā)酵液中乳酸和殘?zhí)亲兓妶D1。

表6 50 L 罐發(fā)酵結果Table 6 The results of fermentation in 50 L fermentor

圖1 發(fā)酵過程中L-乳酸和殘?zhí)亲兓疐ig.1 Transformations of L-lactic acid and residual sugar in the process of fermentation

由于紅薯漿液化糖中有機氮含量較高，在發(fā)酵前期，尤其是在發(fā)酵10 ～18 h，在攪拌和通氣條件下，發(fā)酵液大量起泡，必須流加消泡劑進行消泡，同時要降低攪拌速度和空氣流量，攪拌速度從200 r/min 降至120 r/min ，通氣量亦根據發(fā)泡的情況適時調節(jié)，溶氧比對照罐1 低20% ～40%，由于溶氧下降，副產物富馬酸和甘油濃度明顯高于1 號罐。發(fā)酵趨勢亦表明在發(fā)酵前期，以玉米淀粉為原料的罐1 產酸明顯較紅薯液化糖高，試驗罐2 和罐3 發(fā)酵周期延長了6 ～8 h，終糖轉化率亦比以玉米淀粉低?？赡苁怯捎谇捌跒榭刂瓢l(fā)酵液起泡，改變發(fā)酵控制條件而造成產酸延遲和發(fā)酵周期延長。菌體量比對照玉米淀粉為原料的罐1 高50%左右，這也是造成糖轉化率偏低的主要原因。

2.3.4.2 去除部分有機N 的紅薯液化糖對發(fā)酵的影響

由于紅薯液化糖中含有機N 高，在發(fā)酵罐發(fā)酵過程中會產生大量的泡沫，同時菌體量明顯增加，從而造成發(fā)酵過程控制難度，增大染菌機率，使產酸量下降，發(fā)酵周期延長，因此對紅薯糖化糖的制作進行了改進，即紅薯洗凈稱重后，加水粉碎，漿液靜置過夜，棄上清液，再加水，攪勻后靜置沉淀，棄上清，這樣可去除紅薯中絕大部分有機N，沉淀加淀粉酶液化，測定含糖量和總N 量。

試驗罐1 為玉米淀粉對照罐，罐2 為120 g/L 改進制作的紅星431 紅薯液化糖，其有機N 濃度為0.068 g/L，罐3 為120 g/L 改進制作的梅營1 號紅薯液化糖，其有機N 濃度為0.03 g/L，(NH4)2SO4添加量均為1.35 g/L，三罐為平行試驗，采用三級種發(fā)酵，比較發(fā)酵周期和糖轉化率。發(fā)酵結果見表7，發(fā)酵液中乳酸和殘?zhí)亲兓妶D2。

經過去除有機N 的紅薯液化糖，在發(fā)酵過程中未發(fā)生大量起泡的現(xiàn)象，其發(fā)酵周期和糖轉化率均與以玉米淀粉為原料基本相同，乳酸產生和糖消耗速率無明顯差異，發(fā)酵副產物富馬酸和甘油濃度亦無明顯增加，發(fā)酵周期48 h，糖轉化率均≥80.0%，光學純度均為100%?？梢匀〈衩椎矸圩鳛榘l(fā)酵原料。

表7 50 L 罐發(fā)酵結果Table 7 The results of fermentation in 50 L fermentor

圖2 發(fā)酵過程中L-乳酸和殘?zhí)亲兓疐ig.2 Transformations of L-lactic acid and residual sugar in the process of fermentation

3 結論

采用2 個高淀粉紅薯品種為原料，米根霉發(fā)酵生產L-乳酸，紅薯液化糖中的有機N 濃度對發(fā)酵影響顯著。在搖瓶發(fā)酵過程中表現(xiàn)為菌體量明顯增加，菌體量隨著有機N 濃度的增加而明顯增加，菌體量為淀粉原料的菌量的2 ～6 倍，且副產物富馬酸和甘油濃度亦呈增加趨勢。在50 L 罐發(fā)酵過程中，發(fā)酵前期會大量發(fā)泡，需流加消泡劑和控制攪拌速度和空氣流量進行消泡，這樣導致發(fā)酵前期產酸較低，發(fā)酵周期延長，富馬酸和甘油濃度亦有所增加，使乳酸產量和糖轉化率比淀粉糖略低。采用去除大部分有機N的紅薯液化糖進行50L 罐發(fā)酵，其糖轉化率≥80%，發(fā)酵周期為48 h，與淀粉類糖相同，完全可替代玉米淀粉作為原料生產L-乳酸。

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