虹彩病毒脅迫下東北林蛙NF－κB和I－κB的差異表達1)

周 旋 肖向紅 張晶鈺 柴龍會 牛曙東 呂 晨

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)

東北林蛙(Rana dybowskii)，屬脊索動物門，兩棲綱，無尾目，蛙科。東北林蛙的養(yǎng)殖是我國經濟動物養(yǎng)殖業(yè)之一，具有很高的經濟價值。近年來，東北林蛙種群數(shù)量逐年下降。研究顯示，蛙病毒屬的虹彩病毒(Rana grylio virus，RGV)是最重要的影響因素之一［1］。該病毒廣泛的宿主范圍、全球分布性以及高致病力，使得它們成為兩棲類全球性的威脅。NF－κB是參與機體先天免疫的一類重要模式識別分子，也是連接先天免疫和獲得性免疫的橋梁。研究證實，NF－κB信號通路是促炎癥基因表達的樞紐之一，可誘導細胞因子、趨化因子、粘附因子、基質金屬蛋白酶(MMP)、環(huán)加氧酶2(cox2)和誘導性一氧化氮合酶(iNos)的表達［2］。但目前對NF－κB信號通路的研究多集中在哺乳動物，兩棲動物的NF－κB相關研究尚未見報道。本實驗以東北林蛙為研究對象，利用熒光定量PCR技術，觀察東北林蛙在受到RGV脅迫后，其體內NF－κB和I－κB分子的時空表達變化。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物及毒株:東北林蛙，40只，健康、雄性，2～3齡，體質量(20±2)g，2012年5月購自黑龍江省帽兒山林場;蛙虹彩病毒RGV9506，由中國科學院武漢水生生物研究所張奇亞教授饋贈，本實驗室傳代培養(yǎng)并保存。

主要試劑:Trizol Reagent，由美國 Invitrogen公司購買;瓊脂糖，由Biowest公司購買;GelRed核酸凝膠染料，由美國Biotium公司購買;2×Taq Master Mix、DNA Marker 2000、50 bp DNA Ladder，由天根生化科技有限公司購買;Prime Script? RT reagent Kit、Real Master Mix(SYBR ? Green Ⅱ)，由 Takara公司購買;小量膠回收試劑盒，由上海華舜生物有限公司購買。

1.2 總RNA提取和檢測

東北林蛙經腹腔注射RGV 1 mL［3］(PBS稀釋為106/mL)脅迫刺激。分別于 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、24.0、48.0、72.0 h 后取背部皮膚、肝臟、脾臟，－80℃保存，以0 h為空白對照組。用Trizol法提取總RNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，紫外分光光度計檢測其吸光度。

1.3 RT-PCR擴增和電泳檢測

使用Primer premier 5.0軟件，根據(jù)實驗室高通量測序結果設計 β－actin、NF－κB1、NF－κB2和 I－κBα mRNA的上下游引物，引物由哈爾濱博仕生物公司合成。引物序列見表1。

表1 β－actin、NF －κB1、NF－κB2和 I－κBα 引物

取500 ng總RNA按照PrimeScript?RT reagent Kit說明書進行反轉錄反應，以反轉錄產物為模板進行PCR反應(以β－actin為陽性對照)。PCR反應體系根據(jù)2×TaqMasterMix說明書配制，反應條件:94℃預變性3 min(94℃變性30 s，NF－κB1 56℃、NF － κB2 52.6 ℃、β －actin 54.5 ℃、I－ κBα 58.5℃退火30 s，72℃延伸1 min)，30個循環(huán)，72℃延伸5 min。產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.4 制作標準曲線

切膠回收目的基因PCR產物，通過紫外分光光度計測定回收產物吸光度及濃度，產物質量濃度測定后，按下列公式計算各產物單位體積(單位:μL)的拷貝數(shù)(N)［4］:N=NA× C/MW。式中:NA為阿伏加德羅常數(shù);C為產物質量濃度(單位:g/μL);MW為產物平均摩爾質量(單位:g/mol，MW=片段長度bp×660/bp)。

用已測質量濃度的切膠回收產物為母液制備質量濃度梯度樣品，在25 μL反應體系中分別加入1 μL各稀釋質量濃度的樣品制作標準曲線。熒光定量PCR反應體系按照Real Master Mix(SYBR?GreenⅡ)說明書配制，熒光定量PCR反應條件:95℃預變性30 s(95℃變性5 s，NF－κB1 56℃、NF－κB2 52.6 ℃、I－ κBα 58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72℃讀板)，40個循環(huán)，95℃延伸15 s。在72～95℃區(qū)間，以0.5℃為遞增梯度進行溶解曲線分析。采用默認設置，自動生成C(t)值，每個樣品重復3次。

1.5 實時熒光定量PCR

熒光定量PCR反應體系按照Real Master Mix(SYBR?GreenⅡ)說明書配制，熒光定量PCR反應條件:95℃預變性30 s(95℃變性5 s，NF－κB1 56℃、NF － κB2 52.6 ℃、I－ κBα 58.5 ℃退火 30 s，72℃延伸30 s，72℃讀板)，40個循環(huán)，95℃延伸15 s。在72～95℃區(qū)間，以0.5℃為遞增梯度進行溶解曲線分析。每個基因的cDNA樣本重復3次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Opticon Monitor 3軟件分析定量結果，取C(t)值的均數(shù)根據(jù)標準曲線計算各樣品拷貝數(shù)。同一部位不同樣本之間表達量差異顯著性檢驗采用SPSS(18.0)的獨立樣本的T－test法。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取結果

利用紫外分光光度計檢測提取的各樣品組織總RNA的OD值，各樣本OD260/OD280全部在1.9～2.1之間，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA的18S、28S RNA條帶清晰(見圖1)，說明樣本無RNA降解、蛋白質污染，總RNA質量符合后續(xù)實驗要求。

圖1 東北林蛙組織總RNA電泳圖

2.2 RT-PCR擴增結果

取500 ng總RNA經RT－PCR，得到目的條帶清晰(見圖2)，無特異擴增及引物二聚體，測序結果與引物設計時片段大小相吻合，且無雜帶，表明反轉錄產物和特異性引物均滿足后續(xù)Real－timePCR實驗要求。測序結果與實驗室高通量測序結果一致。

2.3 標準曲線

選用初始模板拷貝數(shù)適宜的目的基因標準品為母液制備質量濃度梯度樣品(NF－κB2為9.7×(10－1～103)拷貝數(shù)/μL;NF －κB1為1.55×(101～105)拷貝數(shù)/μL;I－κBα為1×(101～105)拷貝數(shù)/μL)。對每個質量濃度的樣品，設定3個重復。圖3展示的是各標準品擴增產物起始模板質量濃度的對數(shù)值與對應C(t)值的關系圖，NF－κB2、NF－κB1、I－κBα的標準方程的回歸系數(shù)均在0.97以上，表現(xiàn)出良好的線性關系。

圖2 目的基因RT－PCR產物電泳圖

圖3 目的基因標準曲線

2.4 NF － κB1、NF －κB2和I－κBα 定量結果

采用實時熒光定量PCR方法檢測RGV脅迫下，NF －κB1、NF－κB2和 I－κBα 在東北林蛙肝臟、脾臟、皮膚中10個時間點的時空表達情況。目的基因溶解曲線為一個明顯的峰(見圖4)，表明在擴增中引物特異性較好，產物單一。C(t)值經標準方程計算出東北林蛙肝臟、脾臟、皮膚不同脅迫時間下的樣品初始拷貝數(shù)(見圖5)，在RGV刺激初期，與對照組相比形成NF－κB1和NF－κB2表達量立即大幅下調。從刺激后0.5 h，2個亞基在3個組織中都有上調趨勢，分別在刺激后2 h(肝臟)和4 h(皮膚)快速上調至峰值，NF－κB1和NF－κB2在肝臟中為760 bp和1082 bp、在皮膚中為551 bp和1 921 bp;在脾臟中2亞基上調趨勢緩慢，分別在16 h(NF－κB2)和24 h(NF －κB1)達到峰值，NF－κB1和NF－κB2分別為758 bp和659 bp。2亞基表達至峰值后開始下調，并在8 h(在肝臟中)和12 h(在皮膚中)下調至初始水平，在脾臟中2亞基72 h才達到初始水平。I－κBα在受刺激初期表達量也立即下調而后上調，并且其上調時間與NF－κB的上調時間點基本相同。統(tǒng)計學分析表明，定量結果有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖4 目的基因溶解曲線圖

3 討論

隨著全球環(huán)境的變化，生物多樣性不斷受到破壞，作為衡量生態(tài)環(huán)境優(yōu)劣的指示動物——兩棲動物數(shù)量正逐年減少。引起兩棲動物種群衰退的原因主要包括新引入的捕食者［5］、紫外線輻射的增加［6］、生境的破壞和退化、化學污染以及由病原微生物引起的感染性疾病的流行［7］等，其中感染性疾病流行與某些兩棲類種群的區(qū)域性滅絕有重要的關聯(lián)［8］。已有研究表明，蛙病毒屬RGV也是兩棲動物重要的病原之一［1］。RGV主要感染兩棲類、爬行類和硬骨魚類［9］。Brunner等［10］研究顯示，實驗室和野生條件下蠑螈(salamandrae)可作為病毒攜帶者而不發(fā)病，并在接觸RGV后能誘導機體產生適應性免疫應答。

蛙類皮膚光滑潮濕并且無角質層保護，其皮膚能夠分泌具有抗微生物活性的物質，作為抵御病原微生物入侵的第一道屏障;肝血竇的枯否氏細胞具有吞噬作用;脾臟作為最活躍的免疫器官是血源性抗原產生應答的主要場所。謝簡等［11］通過RGV人工感染美國青蛙(Rana grylio Stejneger)幼蛙經免疫組化法檢測顯示，病毒感染呈現(xiàn)的陽性反應可深達肝脾臟的實質層，推測肝脾組織可能是RGV感染的主要靶器官?；诖?，本實驗以東北林蛙皮膚、肝臟和脾臟為靶器官，檢測RGV脅迫后各器官中NF－κB的表達變化。

圖5 NF－кB及I－кBα mRNA表達變化趨勢

核轉錄因子κB(NF－κB)能與多種細胞基因啟動子或增強子序列特定位點發(fā)生特異性結合而促進轉錄和表達，在炎癥反應、免疫應答等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。NF－κB位于Toll樣受體(TLR)下游信號通路的樞紐位置，當細胞受到病原體刺激后產生應激反應，使NF－κB與I－κB解離，從而進入細胞核，與相應的靶序列結合，調節(jié)基因轉錄表達，啟動針對病原微生物的固有免疫和獲得性免疫。在果蠅中，NF－κB/Rel同源蛋白 Dorsal和Dif由Toll受體激活，分別在幼體和成體抗真菌和革蘭氏陽性菌的免疫應答中起轉錄激活作用［12］。王冬冬［13］研究顯示，中國明對蝦在受白斑綜合癥病毒(WSSV)刺激后Relish(哺乳動物NF－κB1和NF－κB2的同源蛋白)基因表達呈現(xiàn)先下調，而后上調，再下調，最后恢復正常水平的變化趨勢，并且可調控下游多種效應因子對WSSV進行免疫防御。

兩棲動物是低等水生動物過渡到真正陸生動物的中間類型，在脊椎動物進化史上有著重要地位。本實驗通過熒光定量PCR檢測東北林蛙NF－κB的表達變化，結果顯示，在不同組織中NF－κB1和NF－κB2兩個亞基的表達水平有差異，NF－κB2表達量約是NF－κB1的2倍，且皮膚和脾臟中的表達量明顯高于肝臟。在RGV刺激下，與對照組相比，NF－κB1和NF－κB2表達量立即大幅下調;肝臟和皮膚中，在刺激后2 h(在肝臟中)和4 h(在皮膚中)上調至峰值;在脾臟中，2亞基上調趨勢緩慢，分別在16 h(NF－κB2)和24 h(NF－κB1)達到峰值;2亞基表達至峰值后開始下調，并在8 h(在肝臟中)和12 h(在皮膚中)下調至初始水平，在脾臟中2亞72 h才達到初始水平。即:其表達變化呈現(xiàn)先下調，而后上調，再下調，最后恢復正常水平的趨勢，與WSSV刺激下對明蝦Relish基因的表達趨勢相同［13］。說明在受刺激初期，主要由皮膚和肝臟起到對RGV的抵制作用，但是在刺激后期則主要有脾臟起免疫調控作用。I－κBα在受刺激初期表達量也立即下調而后上調，其上調時間點與NF－κB的上調時間點基本相同。結果表明，NF－κB被激活后，I－κBα也立即上調表達，且與NF－κB結合，使其失去活性。NF－κB/I－κB信號通路與RGV的關系可能極其復雜和緊密，RGV可利用NF－κB1和NF－κB2基因來增強其自身基因的表達，達到自身復制繁殖的目的。東北林蛙也需要依靠NF－κB1和NF－κB2基因調控下游多種免疫相關因子來防御RGV。

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