胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展

王榮春，孫建華，何述棟，馬 鶯,*

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150010)

1 胰蛋白酶抑制劑的分類及結(jié)構(gòu)

胰蛋白酶(Trypsin)在脊椎動(dòng)物中，作為消化酶而起作用。其在胰臟以酶的前體——胰蛋白酶原被合成的。胰蛋白酶原受腸激酶或胰蛋白酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷。其不僅起消化酶的作用，而且能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其他酶的前體，起活化作用。

胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor，TI)普遍存在于自然界的動(dòng)物、植物和微生物中，目前，研究較多的胰蛋白酶抑制劑主要來源于人類主要的糧食，如豆科、喬本科，在十字花科中也有報(bào)道。而在動(dòng)物界中，動(dòng)物的血液、胰臟，以及酵母菌、鏈霉菌屬等微生物中亦有胰蛋白酶抑制劑的存在。蛋白酶抑制劑可分為絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、金屬蛋白酶抑制劑4大類。而胰蛋白酶抑制劑屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine proteinase inhibitor，Serpin)家族。

1.1 胰蛋白酶抑制劑的分類

胰蛋白酶抑制劑可以與胰腺分泌的絲氨酸蛋白酶系(如胰蛋白酶、糜蛋白酶等)發(fā)生不可逆的反應(yīng)。胰蛋白酶抑制劑與其靶酶的相互作用，通常與酶和底物之間的相互作用一樣，屬于互補(bǔ)型作用機(jī)制。胰蛋白酶抑制劑與胰蛋白酶(或糜蛋白酶)相互反應(yīng)時(shí)，抑制劑暴露在外的活性中心(反應(yīng)位點(diǎn))與靶酶的活性中心通過氫鍵相連，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而導(dǎo)致酶活性中心的閉鎖，使靶酶的活性喪失，且此反應(yīng)是不可逆的。與通常的酶催化反應(yīng)相比，胰蛋白酶與其抑制劑之間反應(yīng)的米氏常數(shù)(Km)很低，故胰蛋白酶與其抑制劑的親和力大，兩者可以迅速結(jié)合成無活性、不可逆的復(fù)合物。與一般的酶的底物不同，酶對(duì)抑制劑的反應(yīng)位點(diǎn)的肽鍵并不能作用，抑制劑與酶結(jié)合后其活性中心的肽鍵并不裂解或裂解速率極慢。因此，該復(fù)合物雖然可以分解成游離的酶和變性或未變性的抑制劑，但解離速率非常緩慢[1]。

1.2 胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)

胰蛋白酶抑制劑根據(jù)分子質(zhì)量、半胱氨酸含量、反應(yīng)位點(diǎn)的數(shù)量主要可分為Kunitz型抑制劑、Bowman-Birk型抑制劑、PotatoⅠ型、PotatoⅡ型及Kazal型。其中研究最為廣泛和深入的是Kunitz型抑制劑及Bowman-Birk型抑制劑兩類，分別是庫尼茲胰蛋白抑制劑(Kunitz type Trypsin inhibitor，簡(jiǎn)稱KTI)和鮑曼-貝爾克胰蛋白酶抑制劑(Bowman-Birk type Trypsin inhibitor，簡(jiǎn)稱BBTI)。

1947年，Kunitz[2]首次自大豆中分離和結(jié)晶出Kunitz胰蛋白酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)其分子質(zhì)量約20.1kD，其半胱氨酸含量相對(duì)低，分子內(nèi)含有2個(gè)二硫鍵和1個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)，該反應(yīng)位點(diǎn)一般只能與胰蛋白酶相互作用[3-4]。大豆中的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑，分子內(nèi)含有181個(gè)氨基酸殘基，2個(gè)二硫鍵(Cys39～Cys86、Cys138～Cys145)，分子中多以松散的線團(tuán)狀的分子存在，位于138位和145位的半胱氨酸之間形成了二硫鍵，結(jié)合形成了一個(gè)由8個(gè)氨基酸組成的小環(huán)，另外在39位和86位的半胱氨酸之間形成了第2個(gè)二硫鍵。其活性中心位于第63位的精氨酸和第64位的異亮氨酸，這2個(gè)氨基酸位于分子的外部，并且一個(gè)KTI分子抑制劑能鈍化1個(gè)分子胰蛋白酶。其他來源的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑也被陸續(xù)研究。而來自牛的胰腺的胰蛋白酶抑制劑也屬于Kunitz型，其分子質(zhì)量為6.5kD，含有3個(gè)二硫鍵，但同樣只有1個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)。利用晶體學(xué)和圓二色性方法研究大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的蛋白結(jié)構(gòu)主要由β折疊組成，同時(shí)由12組反向平行的β-股以疏水側(cè)鏈、隨機(jī)卷曲和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)穩(wěn)定形成的十字交叉的區(qū)域[5]。Kunitz型胰蛋白酶抑制劑已經(jīng)從刺桐(Erythrina)、四棱豆(Psophocarpus tetragonolebus)、牧豆樹(Prosopis julifl ora)、葵花籽、洋紫荊(Bauhina variegata)、鳳凰木(Delonix regia)、豬屎豆(Crotalaria paulina)、黎豆(Mucuna pruriens)、海紅豆(Adenanthera pavonina)、棕色腰豆等植物的種子及土豆等提取獲得[6-14]。

Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑(BBTI)于1946年由Bowman[15]自大豆中分離獲得。該Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑的分子質(zhì)量大約為8kD，富含半胱氨酸，包含2個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)及7個(gè)二硫鍵。2個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)分別抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，反應(yīng)位點(diǎn)的單邊結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。一環(huán)狀結(jié)構(gòu)為胰蛋白酶結(jié)合區(qū)域含有4個(gè)二硫鍵，可抑制胰蛋白酶的活性，而另一環(huán)狀結(jié)構(gòu)為胰凝乳蛋白酶的結(jié)合區(qū)，存在3個(gè)二硫鍵，可與胰凝乳蛋白酶相結(jié)合抑制其活性。由于分子內(nèi)富含二硫鍵和亞基間的極性相互作用，這些BBTI的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性較好[16]。目前已從多種來源中分離純化得到BBTI。Song等[17]自中國竹臭蛙的皮膚分泌物中提取獲得只有62個(gè)氨基酸的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑。Ye等[18]自蠶豆中，利用色譜法分離了分子質(zhì)量為7.5kD的Bowman-Birk型抑制劑，其具有抗菌作用，可抑制HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶活性，同時(shí)對(duì)鼠的脾細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用。

PI-Ⅰ和PI-Ⅱ家族是一類誘導(dǎo)型的蛋白酶抑制劑。其中PI-Ⅰ家族包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅰ和番茄蛋白酶抑制劑Ⅰ，它們的分子質(zhì)量為8.1kD，只有1個(gè)活性中心，主要抑制胰蛋白酶，而對(duì)胰凝乳蛋白酶抑制作用較弱。PI-Ⅱ家族包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑Ⅱ和番茄蛋白酶抑制劑Ⅱ，由2個(gè)重復(fù)序列構(gòu)成，分子質(zhì)量為24kD，包含2個(gè)活性中心，能抑制胰蛋白酶和凝乳蛋白酶。而關(guān)于Kazal型胰蛋白酶抑制劑的研究進(jìn)展，鄭青亮等[19]作過較全面的綜述。

2 胰蛋白酶抑制劑的生物功能

胰蛋白酶抑制可以與生物的胰蛋白酶結(jié)合，不可逆形成無酶活性的復(fù)合物，從而抑制了生物對(duì)蛋白質(zhì)的消化、吸收和利用等能力，也因此被稱為抗?fàn)I養(yǎng)因子。而昆蟲攝入蛋白酶抑制劑后，其與昆蟲腸道的蛋白酶形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而使昆蟲的蛋白消化酶活性受到抑制。同時(shí)，蛋白酶和蛋白酶抑制劑的復(fù)合物還可能作為一個(gè)負(fù)反饋信號(hào)抑制昆蟲的進(jìn)食。這種重效應(yīng)將降低害蟲對(duì)食物蛋白的有效利用率同時(shí)也減少了食物的攝取，最終導(dǎo)致昆蟲由于缺乏必需的營養(yǎng)(蛋白質(zhì))停止發(fā)育并最終死亡?？瓜x害是胰蛋白酶抑制劑的生物功能。胰蛋白酶抑制劑的生理作用除了抗微生物、抗蟲害外，其對(duì)生物的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至細(xì)胞的凋亡也都有調(diào)節(jié)作用。而近些年來人們也注意到了胰蛋白酶抑制劑的抗病毒和抗癌作用，并廣泛開展了這方面的相關(guān)研究。

在抗病毒方面，Evandro等[20]自豆類中提取了Kunitz型胰蛋白酶抑制劑，該抑制劑可以抑制對(duì)HIV-1增殖至關(guān)重要的HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶的活性，從而使得此胰蛋白酶抑制劑具有了抑制HIV-1增殖的可能性。Ye等[18]發(fā)現(xiàn)來自蠶豆的Bowman-Birk型抑制劑也同樣具有抑制HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶活性的作用。這些研究都說明胰蛋白酶抑制及具有抑制病毒增殖的可能性。

在抗腫瘤方面，Ho等[21]自北海道黑豆中提取的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑顯示了對(duì)MCF-7乳房癌細(xì)胞增殖的抑制作用，此研究也表明了該胰蛋白酶抑制劑可能具有抗癌的作用。Kobayashi等[22]報(bào)道了自大豆中提取的胰蛋白酶抑制劑通過下調(diào)uPA尿激酶纖維蛋白溶酶原激活物從而阻止卵巢癌細(xì)胞的擴(kuò)散，該研究同樣證實(shí)了胰蛋白酶抑制劑可能存在抗癌的生理活性。自蠶豆中提取、分離獲得了分子質(zhì)量為15kD的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑，除了可以抑制HIV-1的反轉(zhuǎn)錄酶的活性外，同時(shí)具有通過誘導(dǎo)染色質(zhì)凝聚和細(xì)胞凋亡而抑制HepG2肝腫瘤細(xì)胞增殖的能力。Evandro等[23]自宮粉羊蹄甲提取的一種新型的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(BvvTI)，除了具有抑制HIV-1的反轉(zhuǎn)錄酶的活性外，還可明顯地抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-1增殖作用，同時(shí)對(duì)細(xì)胞活素類和細(xì)胞凋亡都有影響。

胰蛋白酶抑制劑的這些生物活性賦予了應(yīng)用于醫(yī)藥的潛力[24]。但關(guān)于胰蛋白酶的抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞和HIV-1的逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制機(jī)制到目前為止還未明確，需要進(jìn)一步的研究探討。

3 胰蛋白酶抑制劑的提取及純化方法

3.1 提取

因胰蛋白酶抑制劑多為小分子，帶微弱電荷的蛋白質(zhì)分子，大多數(shù)胰蛋白酶抑制劑的提取研究中，采用水作為提取溶劑，如Ee等[25]利用10倍體積的無菌水將研磨后的金合歡種子在4℃的條件下攪拌2h，進(jìn)行胰蛋白酶抑制劑的提取。同時(shí)也可利用低濃度的酸性水溶液、鹽溶液或中性的緩沖液對(duì)胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行提取。王轉(zhuǎn)花等[26]曾經(jīng)分別用磷酸緩沖液、0.2mol/L硫酸、0.4mol/L三氯乙酸以及水提法從苦蕎種子中提取胰蛋白酶抑制劑，對(duì)4種提取方法所得產(chǎn)物的抑制活性及柱層析純化結(jié)果比較表明，以磷酸緩沖溶液為提取介質(zhì)，經(jīng)熱變性、鹽析及Sephadex G-100柱層析分離后苦蕎胰蛋白酶抑制劑的活性和得率較高，是較為理想的提取方法。Liu等[27]利用冰冷的50mmol/L磷酸鈉緩沖溶液(pH6.5)自西番蓮果中粗提胰蛋白酶抑制劑。在該研究中，為了避免西番蓮果中各種成分間的反應(yīng)，在提取之前，利用液氮作為研磨助劑。對(duì)于植物基質(zhì)和動(dòng)物基質(zhì)的提取前處理略有不同，對(duì)于植物基質(zhì)的提取去脂等步驟并非必不可少，但對(duì)于動(dòng)物組織的基質(zhì)，由于富含脂類和糖類物質(zhì)，所以前處理往往是必需的且較為復(fù)雜。

3.2 純化

利用各種溶劑提取獲得的粗提物同時(shí)還含有較多其他種類的蛋白質(zhì)，胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)研究和性質(zhì)研究則要求必須對(duì)粗提物進(jìn)行純化或精制。因粗提物中的蛋白種類繁多，單一依靠胰蛋白酶抑制劑的某一性質(zhì)很難將其從諸多蛋白質(zhì)中純化出來，所以，對(duì)胰蛋白酶抑制劑的純化一般是在利用離心、鹽沉后再用純化效率較高的色譜法進(jìn)行進(jìn)一步純化，且多為2種以上的色譜法結(jié)合使用進(jìn)行分離純化，如離子色譜與排阻色譜結(jié)合，或離子色譜與親和色譜相結(jié)合等。在色譜分離之前也可利用梯度鹽析(一般常使用為硫酸銨)的方法進(jìn)行初步分離[28]。在色譜分離后利脫鹽，再經(jīng)冷凍干燥獲得純化物質(zhì)。如Zhang等[29]在提取青蛙皮膚分泌物中胰蛋白酶抑制劑時(shí)，首先利用含有0.1mol/L NaCl和5mmol/L EDTA的50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液將青蛙皮膚上的分泌物洗溶于該溶液中，離心去除不溶物，再利用DEAE-瓊脂糖A-50離子交換色譜柱(2.6cm×30cm)進(jìn)行第一次色譜分離。洗脫的含有胰蛋白酶抑制活性的部位將被進(jìn)行第二次分子質(zhì)量色譜分離，使用的色譜柱為瓊脂糖凝膠G-75(2.6cm×100cm)，獲得的具有活性的部位被冷凍干燥后進(jìn)行脫鹽。

利用胰蛋白酶固定于色譜柱的填料中，制成親和色柱，利用這樣的色譜柱可實(shí)現(xiàn)對(duì)胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行一步式純化。但由于成本原因，現(xiàn)階段這種純化方法未得到廣泛應(yīng)用[30-31]。如Zhang等[32]利用殼聚糖將一蛋白酶抑制劑進(jìn)行了固定化，并檢測(cè)到其在熱和酸堿條件下有著優(yōu)于天然胰蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定性，且引法能對(duì)大豆胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行較快速的分離純化，具有應(yīng)用于工業(yè)的潛力。

4 胰蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究方法

蛋白結(jié)構(gòu)研究是胰蛋白酶抑制劑研究的重要內(nèi)容。研究胰蛋白酶抑制劑的研究方法大多采用已成熟的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析方法，如X射線衍射法、圓二色光譜法(CD)、核磁共振法(NMR)等。Shee等[5]探討了自咖喱仔中提取的胰蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其與穩(wěn)定性的關(guān)系。該研究闡明在CD研究中顯示，這種胰蛋白酶抑制劑在自然條件下，含有大約46%的β-股、30.1%的α-螺旋、16.2%的轉(zhuǎn)角以及6.9%的隨機(jī)卷曲。當(dāng)溫度上升，α螺旋可轉(zhuǎn)變成卷曲，其對(duì)胰蛋白酶的抑制活性和α螺旋的含量有關(guān)。同課題組[33]對(duì)該胰蛋白酶抑制劑的結(jié)晶結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了初步的X射線衍射分析，以PEG-8000作為沉淀劑利用坐滴氣相擴(kuò)散法獲得Kunitz型胰蛋白酶抑制劑，其結(jié)晶為四方晶系，晶胞參數(shù)為a=b=75.8、c=150.9?。Zhao等[34]利用NMR方法，分析了來源于擬南芥的胰蛋白酶抑制劑的三維結(jié)構(gòu)，這種蛋白包括一段α螺旋、兩段由β折疊形成的反平行結(jié)構(gòu)，同時(shí)這兩段節(jié)后連接有β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。α螺旋和抑制環(huán)區(qū)域與β折疊通過3個(gè)二硫鍵相連接，4個(gè)二硫鍵將蛋白質(zhì)的N末端和C末端相連接。對(duì)胰蛋白酶抑制因子的結(jié)構(gòu)討論中，近年來利用計(jì)算機(jī)模擬和X射線衍射法、CD、NMR相結(jié)合的方法也有報(bào)告[13,35]。圖1為來源于豇豆的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，該蛋白有2個(gè)相似的亞基，每個(gè)含有30個(gè)氨基酸殘基、14個(gè)半胱氨酸，形成了7個(gè)二硫鍵，為典型的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[36]。

對(duì)于胰蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的研究還有很多可探討的空間，尤其是結(jié)構(gòu)與抗腫瘤、抗病毒等功能之間的關(guān)系，以及功能的作用機(jī)制等問題，需要進(jìn)一步研究。

圖 1 自豇豆提取的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[36]Fig.1 Protein structure of the Bowman-Birk trypsin inhibitor from Vigna unguiculata seed[36]

5 胰蛋白酶抑制劑的臨床應(yīng)用及潛在應(yīng)用

胰蛋白酶抑制劑在很多方面具有應(yīng)用的潛力，包括：1)胰腺可產(chǎn)生多種消化酶，如胰蛋白酶、脂肪酶、糜蛋白酶等，胰蛋白酶原沒有活性，當(dāng)受到膽汁和腸液中的腸激酶的激活后，產(chǎn)生活性，而胰蛋白酶有可能激活其他的酶，這些酶對(duì)胰腺產(chǎn)生消化作用，對(duì)胰腺造成傷害。由于胰蛋白酶抑制劑對(duì)絲氨酸蛋白酶具有光譜的抑制作用，可以結(jié)合胰蛋白酶和胰凝乳酶等消化酶，使消化酶失活，從而治療由于消化酶過多而對(duì)胰腺造成了損傷的胰腺炎。2)有研究表明胰蛋白酶抑制劑與內(nèi)源抗蟲物質(zhì)具有協(xié)調(diào)性，可增加抗蟲性，因此如果將外源蛋白酶抑制劑的基因轉(zhuǎn)入具有內(nèi)源性抗蟲次物質(zhì)的植物，可能會(huì)獲得具有高抗蟲性的新品種。很多學(xué)者做了此方面的嘗試，如Hilder等[37]將豇豆胰蛋白酶抑制劑的基因成果轉(zhuǎn)入煙草葉片中，并得以表達(dá)，提高了煙草的抗蟲害性。3)如前面所述，胰蛋白酶抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶的活性具有抑制作用，而大豆中Bowman-Birk的胰蛋白酶抑制劑，被研究證明具有阻止細(xì)胞惡性化，降低多種癌癥發(fā)病率的作用，如肺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等作用，蛋白酶抑制因子與受體的結(jié)合能夠調(diào)節(jié)蛋白酶的活性，抑制其對(duì)基底膜的浸潤(rùn)，阻斷腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此胰蛋白酶抑制劑有治療癌癥和抗病毒的可能性。

6 結(jié) 語

胰蛋白酶抑制劑作為小分子的功能蛋白，其提取分離、結(jié)構(gòu)特性及功能特性的研究方法日趨成熟，但對(duì)于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系、生理功能的作用機(jī)制(如抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制等)以及胰蛋白酶抑制劑的應(yīng)用等問題還有待解決，而這些問題的解決需要多個(gè)領(lǐng)域的技術(shù)相結(jié)合才能得以完成。

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