牦牛奶酪中乳酸菌的分離鑒定及發(fā)酵性能分析

楊吉霞，陳芝蘭，楊海燕，黃艾祥，陳宗道，賀稚非,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；3.西藏農(nóng)牧學(xué)院科研處生物技術(shù)中心，西藏 林芝 860000；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；5.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

牦牛是一種能夠在寒冷和缺氧的高原環(huán)境中生存的動(dòng)物，中國(guó)大約有1300萬(wàn)頭，占世界總數(shù)的90%以上[1]，分布于青海、西藏、四川、甘肅、新疆和云南地區(qū)[2]。每頭哺乳期牦牛產(chǎn)奶量為147～487kg[1]，其營(yíng)養(yǎng)成分比普通牛奶高，含有16.9%～17.7%固形物、4.9%～5.3%蛋白質(zhì)、5.5%～7.2%脂肪、4.5%～5.0%乳糖、0.8%～0.9%礦物質(zhì)，普通牛奶含有大約13.3%固形物、3.4%蛋白質(zhì)、4.0%脂肪、4.8%乳糖、0.7%礦物質(zhì)[1,3]。高原牧民將牦牛奶制作成奶酪，是一種重要的延長(zhǎng)奶食用期限的方式，幾千年來(lái)牧民很好地保持了用原料奶或者容器中的天然乳酸菌發(fā)酵的傳統(tǒng)，一方面，不同地域的自然環(huán)境和氣候、不同的原料奶以及不同的加工工藝，造成了不同奶酪中乳酸菌菌種構(gòu)成的差異，可能存在菌種的多樣性，另一方面，在長(zhǎng)期生產(chǎn)實(shí)踐中，奶酪中的乳酸菌可能積累了某些優(yōu)良的發(fā)酵性能，如果能發(fā)掘出其中的優(yōu)良乳酸菌，將有助于豐富工業(yè)發(fā)酵菌種，改變菌種同質(zhì)化嚴(yán)重的現(xiàn)狀。

本研究分別采用表型和基因型方法鑒定牦牛奶酪中的乳酸菌，以探討乳酸菌的構(gòu)成情況。一般來(lái)說(shuō)，綜合運(yùn)用表型和基因型方法，是鑒定乳酸菌、獲得全面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的最佳方式。乳酸菌對(duì)于奶酪質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味的形成起著關(guān)鍵的作用，可分為發(fā)酵菌和非發(fā)酵菌(non-starter lactic acid bacteria，NSLAB)，發(fā)酵菌的主要作用是產(chǎn)酸，使酪蛋白凝固，非發(fā)酵菌產(chǎn)酸弱但耐酸能力強(qiáng)，在奶酪成熟過(guò)程中，產(chǎn)生酶(主要是蛋白酶)裂解蛋白質(zhì)而影響奶酪的質(zhì)構(gòu)，或者與形成風(fēng)味的前體物質(zhì)有關(guān)[4]，此外，乳酸菌產(chǎn)胞外多糖的活性也受到一些學(xué)者的關(guān)注，因?yàn)榘舛嗵羌瓤梢宰鳛樗崮贪l(fā)酵中的增稠劑，改變?nèi)榈牧髯兲匦?，也有免疫調(diào)節(jié)等生理功能[5-6]。本研究對(duì)菌株的產(chǎn)酸活性、產(chǎn)蛋白酶、利用檸檬酸鹽、產(chǎn)胞外多糖等發(fā)酵性能進(jìn)行分析，以篩選有優(yōu)良發(fā)酵性能的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

奶酪樣品采集自西藏、云南、新疆3個(gè)省區(qū)17戶(hù)牧民家庭，西藏樣品4個(gè)(rkz、yzy、nd、mls)，云南樣品5個(gè)(3-1、3-3、3-4、3-5、6-1)，新疆樣品8個(gè)(2#、4#、8#、9#、10#、22#、44#、77#)。將奶酪樣品用無(wú)菌操作裝入無(wú)菌采樣袋中(NASCOB00679WA)，冷藏運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑

乳酸菌表型鑒定所用的培養(yǎng)基和試劑參照文獻(xiàn)[7-9]中的方法配制；石蕊牛奶培養(yǎng)基 美國(guó)BD公司；BBLTM、API?50CHL 生物梅里埃中國(guó)有限公司。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)用的緩沖液和常備試劑按照文獻(xiàn)[10]中的方法配制。Taq酶(5U/μL)、dNTPs(10mmol/L)、10×酶緩沖液、MgCl2(25mmol/L) New England Bio Labs公司；100bp DNA Ladder 美國(guó)Promega公司；瓊脂糖、溶菌酶、蛋白酶K、EDTA-Na2、Tris-base、Guanidine Thiocyanate 美國(guó)Fisher Scientific公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

Lactobacillus casei ATCC 393；Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469和Lactobacillus plantarum ATCC 8014購(gòu)自青島綠谷商貿(mào)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S1000系列高性能PCR儀、164-5050電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Syngene Gene Genius凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)基因有限公司；Biospec-mini型DNA/RNA/蛋白質(zhì)分析裝置 島津中國(guó)有限公司；HB031型金屬恒溫加熱器 上海博彩生物科技有限公司；SIM-F140AY65型制冰機(jī) 日本三洋有限公司；1-15PK型臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的pH值檢測(cè)、菌落計(jì)數(shù)和分離純化乳酸菌

取10g奶酪樣品，用90mL 0.9%生理鹽水(pH7.0)均質(zhì)，測(cè)pH值，然后做10倍系列稀釋?zhuān)?0-1、10-2、10-3、10-4共4個(gè)稀釋度各取1mL，用平板涂布法接種于MRS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48h，測(cè)菌落總數(shù)，設(shè)3個(gè)重復(fù)。根據(jù)形態(tài)特征挑選菌落，用MRS培養(yǎng)基劃線(xiàn)分離至純菌株，將革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性的菌株初步選為乳酸菌。將純化后的菌株分別于－20℃和－80℃冷凍保藏。

1.3.2 乳酸菌菌種鑒定

1.3.2.1 表型鑒定

參照文獻(xiàn)[8-9]的方法，做屬的鑒定實(shí)驗(yàn)：產(chǎn)芽孢、運(yùn)動(dòng)性、硝酸鹽還原反應(yīng)、H2S產(chǎn)生、明膠液化、生成吲哚、精氨酸產(chǎn)氨、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣；菌株在不同的NaCl質(zhì)量濃度(4、6.5、8g/100mL)、不同pH值(3.9、4.5、9.6)、不同溫度(10、15、45℃)條件下的生長(zhǎng)特性；石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)，并判斷出菌屬。

用API?50CHL檢測(cè)菌株的碳水化合物發(fā)酵模式，根據(jù)API的判讀結(jié)果，并參照文獻(xiàn)[8-9]的標(biāo)準(zhǔn)判斷菌種。

1.3.2.2 基因型鑒定

用16S rRNA序列分析法進(jìn)一步驗(yàn)證菌種：用文獻(xiàn)[11]所述異硫氰酸胍法提取乳酸菌基因組DNA，用引物27fF (5’-AGAGTTT GAT(C/T)(A/C)TGGCTCAG-3’)和S-G-Lab-0677-R(5’-CACCGCTACACATGGAG-3’)做PCR擴(kuò)增[12]，25μL反應(yīng)體系為：2.5μL 10×酶緩沖液(無(wú)Mg2+)，2.5μL(25mmol/L)MgCl2，0.5μL dNTPs，0.2μL(10μmol/L)引物，0.2μL Taq DNA酶，50ng模板DNA，加超純水至25μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、40s，30次循環(huán)；72℃延伸7min，目標(biāo)產(chǎn)物約為700bp。產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份公司測(cè)序。將菌株序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中做同源序列搜索，用MEGA 5軟件包將待測(cè)菌株與模式菌株的序列以Clustal W進(jìn)行比對(duì)，用UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic means)法進(jìn)行1000次Bootstrap檢驗(yàn)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。一般來(lái)講，在種分類(lèi)等級(jí)上，如果2個(gè)分類(lèi)單位間的16S rRNA序列同源性大于97.5%，則認(rèn)為屬于同一個(gè)種[13]，對(duì)于同源性低于97.5%的菌株采用種特異性PCR驗(yàn)證，或結(jié)合表型鑒定方法判斷菌種。

L.casei 種特異性PCR：用引物5’-TGCAC TGAGATTCGACTTAA-3’和Y2(5’-CCCACTGC TGCCTCCCGTAGGAGT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[14]，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如前所述，采用標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus casei ATCC393和Lactobacillus rhamnosus ATCC7469；Lactobacillus plantarum ATCC8014分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，目標(biāo)片段長(zhǎng)度約290bp。

1.3.3 乳酸菌發(fā)酵性能分析

1.3.3.1 菌株產(chǎn)酸活性

將活化后的菌株按體積分?jǐn)?shù)1%接種到11g/100mL的脫脂牛奶中(110℃滅菌10min)，初始pH值為6.6，37℃厭氧培養(yǎng)，分別于6h和24h取樣測(cè)可滴定酸，用0.1mol/L NaOH滴定，酚酞作為指示劑，以乳酸的百分比表示結(jié)果[15]。

1.3.3.2 菌株利用檸檬酸鹽的能力

根據(jù)Kempler等[16]的方法檢測(cè)，能夠利用檸檬酸鹽的菌落是深藍(lán)色的(普魯氏藍(lán))，不能利用檸檬酸鹽的菌落保持白色。

1.3.3.3 菌株prt P基因

參照文獻(xiàn)[1 7-1 8]用引物P 6(5’-C A A C A CGGCATGCATGTTGC-3’)和P7(5’-CTGGCGTTCCCACCA TTCA-3’)做PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如前所述，目標(biāo)片斷為393bp。該目標(biāo)片斷與菌株合成蛋白酶相關(guān)，故可用于產(chǎn)蛋白酶菌株的初步篩選。

1.3.3.4 菌株產(chǎn)胞外多糖的活性

配制釕紅牛奶培養(yǎng)基[19]：0.5g/100mL酵母提取物、10g/100mL脫脂乳粉、1g/100mL蔗糖、1.5g/100mL瓊脂、1g/100mL葡萄糖，110℃滅菌10min，待溫度降至約50℃，用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌加入釕紅(終質(zhì)量濃度0.08g/L)，混勻后倒平板。將菌株用劃線(xiàn)法接種，37℃培養(yǎng)72h，產(chǎn)胞外多糖的菌株不被釕紅染色，仍為白色或乳白色菌落。對(duì)于篩選出的陽(yáng)性菌株，參照文獻(xiàn)[20-21]分離提取胞外多糖，用苯酚-硫酸法[22]測(cè)菌株胞外多糖產(chǎn)量，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.0067x－0.0149(R2=0.9958)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的菌落計(jì)數(shù)、pH值和分離純化的乳酸菌

表 1 各地牦牛奶酪樣品的pH值、菌落計(jì)數(shù)及分離純化出的乳酸菌Table 1 pH and colony enumeration of yak milk cheese samples and isolated strains from each sample

如表1所示，西藏、云南、新疆3個(gè)地區(qū)菌落計(jì)數(shù)平均值分別為4.17±0.43、4.30±0.68、3.90±0.59(lg(CFU/g))，pH值平均值分別為4.31±0.39、4.69±0.29、4.52±0.22，地區(qū)之間不存在顯著性差異(菌落計(jì)數(shù)P=0.468＞0.05；pH值P=0.176＞0.05)。與酸奶中乳酸菌的數(shù)量(6～8(lg(CFU/mL)))相比，奶酪中乳酸菌的數(shù)量較低，可能是因?yàn)樵诔ト榍?、腌漬和成熟后，奶酪中的水分活度下降，而且奶酪有一定的含鹽量，多數(shù)pH＜5.0，這些因素都不利于乳酸菌的生長(zhǎng)。

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 表型鑒定

39株乳酸菌主要的生理生化特性列于表2。其中有35株菌在顯微鏡下的形態(tài)為桿狀，芽孢、運(yùn)動(dòng)性、硝酸鹽還原、H2S實(shí)驗(yàn)(與丹毒絲菌屬相區(qū)分)均為陰性；在pH4.5的環(huán)境中生長(zhǎng)(與肉食桿菌屬相區(qū)分)，符合乳桿菌屬的特征。4株菌(T5、Y11、Y14、Y17)在顯微鏡下的形態(tài)為成對(duì)或四聯(lián)狀球菌，芽孢、運(yùn)動(dòng)性、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)均為陰性，不產(chǎn)生H2S或吲哚、在6.5g/100mL NaCl或者pH4.5 MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、在pH9.6中不生長(zhǎng)，在45℃能生長(zhǎng)、能水解精氨酸產(chǎn)氨、不能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)CO2，符合片球菌屬的特征。從樣品中分離出的球菌種類(lèi)和數(shù)量很少，可能與奶酪的水分活度低，pH值較低，致使耐酸性差的球菌生長(zhǎng)受到抑制，到發(fā)酵后期很難存活有關(guān)。

對(duì)于35株乳桿菌用API50CHL檢測(cè)了碳水化合物發(fā)酵模式，參照文獻(xiàn)[8-9]將主要的發(fā)酵模式歸納于表3中。經(jīng)過(guò)API LAB Plus對(duì)結(jié)果的判讀，35株乳桿菌被分為7個(gè)菌種：L. buchneri 2株、L. casei 16株、L. diolivorans 3株、L. fermentum 3株、L. helveticus 3株、L. kefiri 3株和L. plantarum 5株，結(jié)果見(jiàn)表2。

值得指出的是，所有35株乳桿菌在15℃都能生長(zhǎng)，但是根據(jù)文獻(xiàn)[8] L. fermentum和L. helveticus在15℃不生長(zhǎng)，其原因可能是菌株經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期適應(yīng)高原地區(qū)相對(duì)低溫氣候環(huán)境，形成了這種在廣泛溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)的特性，說(shuō)明被分離菌株的適應(yīng)能力增強(qiáng)。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

39株菌用部分16S rRNA序列(V1～V3區(qū))分析法鑒定菌種。35株乳桿菌的鑒定結(jié)果與表型鑒定結(jié)果是一致的，其中25株菌序列同源性≥99%，4株菌(T6、T7、Y10、Y13)為98%，6株菌低于97.5%：T15(97%)、Y18(96%)、Y19(95%)、X21(94%)、X26(97%)、X29(94%)。其中Y19、X21、X26和X29用種特異性PCR進(jìn)一步驗(yàn)證為L(zhǎng). casei(圖1)。

4株球菌也用部分16S rRNA序列分析法鑒定出菌種，序列同源性均高于97.5%。T5為P. acidilactici，Y11、Y14和Y17為P. pentosaceus。

表 2 牦牛奶酪中乳酸菌的主要生理生化特性Table 2 Primary biochemical and physiological characteristics of isolated strains from yak milk cheeses

圖 1 L.casei種特異性PCR鑒定結(jié)果Fig.1 Profi le of PCR amplicons with L. casei species specifi c primers

圖 2 用乳酸菌16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree originated from partial 16S rRNA sequences of lactic acid bacteria isolates.

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)顯示了不同菌種之間清晰的分類(lèi)關(guān)系。L. casei、L. plantarum、L. diolivorans、L. fermentum和L. helveticus的菌株完全按照菌種各自聚為一類(lèi)，L. buchneri和L.kefi ri組的聚類(lèi)稍有偏差，Y15和Y10沒(méi)有歸在相應(yīng)的組里，球菌Y14、Y17也沒(méi)有歸在P. pentosaceus組內(nèi)，可能是因?yàn)榕c模式菌株的序列同源性比較低。39株菌的序列數(shù)據(jù)都提交到GenBank，注冊(cè)號(hào)為JN836453～JN836491。

表 3 API 50CHL測(cè)出的牦牛奶酪中乳桿菌的碳水化合物發(fā)酵模式Table 3 Carbohydrate fermentation patterns of isolated lactobacilli by API 50CHL

2.2.3 乳酸菌菌株按地區(qū)的分布情況

表 4 各地區(qū)乳酸菌菌株的分布情況Table 4 Regional distribution of identified lacticacid bacteria from yak milk cheeses

由表4可知，從云南地區(qū)樣品分離出的乳酸菌中共鑒定出7個(gè)菌種，多樣性最為豐富，其次為西藏地區(qū)樣品(鑒定出5個(gè)菌種)，從新疆樣品中僅鑒定出3個(gè)菌種。新疆樣品乳酸菌主要是L. casei為優(yōu)勢(shì)菌種。

2.3 乳酸菌的發(fā)酵性能

2.3.1 乳酸菌的產(chǎn)酸活性

通過(guò)測(cè)39株菌在11g/100mL脫脂牛奶中培養(yǎng)6h和24h時(shí)可滴定酸(圖3)分析乳酸菌的產(chǎn)酸活性。培養(yǎng)6h時(shí)，可滴定酸的范圍是0.24%～1.08%，培養(yǎng)24h時(shí)的范圍是0.63%～2.19%，產(chǎn)酸活性最強(qiáng)的是X24(L. diolivorans)。國(guó)外文獻(xiàn)[17]將6h可滴定酸值大于0.6%作為篩選產(chǎn)酸能力強(qiáng)的乳酸菌的標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)中有8株菌滿(mǎn)足這一條件：X24、X38、X29、X25、X21、X22、X30、X35。

圖 3 菌株在11g/100mL脫脂牛奶中培養(yǎng)6h和24h后的可滴定酸Fig.3 Titratable acidity of 11 g/100 mL non-fat dry milk after incubation with each isolate for 6 h and 24 h

一般來(lái)說(shuō)，乳桿菌屬大多屬于非起酵菌種(non-starter lactic acid bacteria)(L. delbrueckii 和L. helveticus中的嗜熱菌種除外)，產(chǎn)酸活性不強(qiáng)[4]。在本實(shí)驗(yàn)中，有少數(shù)乳桿菌產(chǎn)酸活性達(dá)到了發(fā)酵菌種的水平，可能是由于在長(zhǎng)期生產(chǎn)過(guò)程中積累而成的優(yōu)良特性。

2.3.2 利用檸檬酸鹽

乳酸菌發(fā)酵檸檬酸鹽的活性與風(fēng)味前體物質(zhì)雙乙酰的形成有關(guān)，因此可以影響奶酪的風(fēng)味和香味[16]。39株菌中有23株能發(fā)酵檸檬酸鹽(表2)，其中T4、T7、Y10、Y13、X25、X28、Y36、Y37利用檸檬酸鹽的能力比較強(qiáng)。

2.3.3 prt P基因篩選

圖 4 乳酸菌prt P基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Prt P gene amplifi cation results obtained from LAB isolates

10株菌prt P基因擴(kuò)增陽(yáng)性(圖4)：T7、Y19、X21、X22、X23、X26、X28、X29、X30、X34，即這些菌株能產(chǎn)生蛋白水解酶。乳酸菌的蛋白酶用于降解酪蛋白和多肽，產(chǎn)生大量的自由氨基酸，從而影響奶酪的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味[4,17]。

2.3.4 產(chǎn)胞外多糖

9株菌產(chǎn)胞外多糖(圖5)：T3、T4、T5、T7、T8、Y11、Y14、Y17、X29。胞外多糖產(chǎn)量如表5所示，產(chǎn)量最高的菌株是T8，為(193.00±1.75)mg/L。

圖 5 釕紅平板培養(yǎng)基篩選產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌Fig.5 Colony on ruthenium red milk plates with or without exopolysaccharide-producing capability

表 5 乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量Table 5 Exopolysaccharide yield of selected lactic acid bacteria

3 結(jié) 論

3.1 本研究從西藏、云南、新疆采集了17份自然發(fā)酵的牦牛奶酪，用MRS培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)平均值分別為4.17±0.43、4.30±0.68、3.90±0.59(lg(CFU/g))，pH值平均值分別為4.31±0.39、4.69±0.29、4.52±0.22，地區(qū)之間不存在顯著性差異(菌落計(jì)數(shù)P=0.468＞0.05；pH值P=0.176＞0.05)。

3.2 從17份牦牛奶酪樣品中，用表型和基因型相結(jié)合的方法鑒定出39株乳酸菌，其中乳桿菌35株，分別為L(zhǎng). buchneri 2株、L. casei 16株、L. diolivorans 3株、L. fermentum 3株、L. helveticus 3株、L. kefiri 3株和L. plantarum 5株，片球菌4株，分別為P. acidilactici 1株、P. pentosaceus 3株。乳桿菌占總菌株89.7%，為優(yōu)勢(shì)菌屬。

3.3 從各地區(qū)的菌株分布情況來(lái)看，云南樣品乳酸菌共有7個(gè)菌種，多樣性最為豐富，其次為西藏樣品乳酸菌(鑒定出5個(gè)菌種)，新疆樣品乳酸菌僅有3個(gè)菌種，主要是L. casei為優(yōu)勢(shì)菌種。

3.4 通過(guò)測(cè)菌株在11g/100mL脫脂牛奶中37℃培養(yǎng)6h和24h后的可滴定酸，篩選出8株菌X24、X38、X29、X25、X21、X22、X30、X35產(chǎn)酸活性較強(qiáng)，有可能作為發(fā)酵菌種。

3.5 菌株T7在檸檬酸鹽利用、prt P基因擴(kuò)增和產(chǎn)胞外多糖活性實(shí)驗(yàn)中結(jié)果均為陽(yáng)性，有可能作為非發(fā)酵菌種，在奶酪成熟過(guò)程中對(duì)風(fēng)味質(zhì)地的形成產(chǎn)生影響。

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