茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的純化及酶學性質(zhì)

呂海鵬，張 悅，費冬梅，林 智*

(中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，國家茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，浙江 杭州 310008)

近年來，茶葉中的甲基化兒茶素成分因其有顯著的抗氧化、抗衰老、抗過敏等功效引起了科研工作者的關(guān)注；目前已在相關(guān)資源篩選[1-2]、基因克隆[3-4]以及生物活性評價[5-6]等方面取得了很大的研究進展。然而，甲基兒茶素的天然資源十分有限，只有極少數(shù)的茶樹品種中的甲基兒茶素含量在1%以上[7-9]，加之由化學合成途徑獲得甲基兒茶素相對困難。因此，為了開發(fā)利用這種天然功能成分，甲基兒茶素的酶學合成更具有重要的研究意義[10-11]。

在酶學合成方面，筆者所在的研究團隊在前期的研究過程中，首先研究了重組大腸桿菌內(nèi)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(EOMT)的誘導表達條件[12]；繼而分析推斷出EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化EGCG后生成的不同類型的EGCG甲基化衍生物[13]；并查明了甲基化衍生物酶促合成的反應條件[14]；但在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶粗酶液的比活力很低，致使甲基化兒茶素的得率也比較低；因此，十分有必要對該酶進行分離純化從而提高其催化活性。

本研究擬在上述研究基礎之上，進一步開展EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的分離純化研究，并查明其酶學特性，以期獲得純度較高、活性較強的EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶。該結(jié)果將有助于研究甲基化EGCG的酶學合成技術(shù)從而實現(xiàn)后續(xù)較大規(guī)模的甲基化兒茶素的酶法制備，也有助于進一步研制開發(fā)甲基兒茶素相關(guān)的新型功能食品和天然藥物等。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

基因重組茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌工程菌由本實驗室構(gòu)建和保存[12]。宿主菌(感受態(tài)細胞)E.coli BL21(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

鎳離子螯合柱(HisTMTrapHP) 美國GE Healthcare Bio-Science AB公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準 美國Bio-Rad公司；Bug Buster Master Mix菌體裂解液 美國Novagen公司；咪唑、牛血清白蛋白、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG，純度≥98%)、氨芐青霉素(Amp)、瓊脂粉 阿拉丁試劑(上海)有限公司；S-腺苷-甲硫氨酸對甲苯磺酸鹽(SAM)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 美國Sigma公司；蛋白胨、酵母提取物 英國Oxoid公司。

Waters 2489-2690高效液相色譜儀 美國Waters公司；Buchi R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；BS-1E振蕩培養(yǎng)箱 金壇市環(huán)宇科學儀器廠；Eppendorf 5810R冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 重組茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的制備

1)取1μL重組質(zhì)粒加入剛剛?cè)诨谋磉_感受態(tài)細胞BL(21)DE3中，輕輕混勻，冰上孵育30min；42℃熱激1min，置于冰上3～5min后均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基(Amp+)上，37℃培養(yǎng)過夜。2)從平板中挑取單克隆于100mL液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min培養(yǎng)約5～7h，使菌液生長至對數(shù)期；按1%的接種比例接種于新的10瓶500mL LB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)37℃、200r/min培養(yǎng)至菌液生長至對數(shù)前期約4h；加入IPTG溶液使其終濃度達到50mmol/L，20℃、150r/min培養(yǎng)誘導蛋白表達。3)將過夜誘導的菌液于4℃、5000r/min離心收集菌體；將得到的約20g菌體保存于－80℃冰箱；4)取10g菌體，用50mL磷酸緩沖液混勻，－20℃冷凍1h，超聲溶解菌體，如此反復3次后于4℃，5000r/min離心10min，收集上清液作為粗酶液用于純化。

1.2.2 重組茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的純化

1)將粗酶液用注射器通過0.45μm濾膜，除去其中的菌體殘骸及其他雜質(zhì)。2)蛋白層析柱用純水清洗5個體積，而后再用磷酸緩沖液平衡5個體積。3)上樣，攪拌均勻，放置4h(期間0.5h攪拌一次)。4)采用梯度法開始洗脫，咪唑濃度分別為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500mmol/L，并將沒有結(jié)合的蛋白丟棄。5)收集各個濃度咪唑洗脫液所得。6)對收集的各管洗脫液進行A280nm比色，以磷酸緩沖液做空白，保留吸光度大于零的洗脫液。7)對A280nm的各洗脫液組分進行SDS-PAGE電泳，確定目的蛋白的位置和洗脫液咪唑濃度。8)將較純的目的蛋白各組分合并，繼而用磷酸緩沖液透析以除去咪唑。

1.2.3 蛋白分子質(zhì)量和濃度的測定

采用Laemmli法進行SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量；采用Lowry法，以牛血清蛋白為標準測定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 酶活力測定

取1mL酶液加入15mL反應液(含2mmol/L MgCl2和DTT、0.4mmol/L SAM、0.3mmol/L EGCG)，于35℃水浴中反應1h，加入0.2mL 1mol/L鹽酸終止反應。加入25mL乙酸乙酯萃取離心，取乙酸乙酯層真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮干燥后，用1.0mL水溶出，再加入0.5mL水潤洗后混勻，HPLC檢測甲基化兒茶素的生成量，以此生成量表示酶活力。1個酶活力單位是指在35℃反應條件下，1min內(nèi)甲基供體SAM向底物EGCG轉(zhuǎn)移1μmol甲基(－CH3)所需的酶量。

HPLC分析條件參照文獻[14-15]進行。色譜柱：Waters Sunfire C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相A為2%冰乙酸，流動相B為乙腈，流速為1mL/min，柱溫40℃，檢測波長280nm，進樣量10μL，梯度洗脫，流動相B在25min內(nèi)由12%線性梯度變化到25%，25.5min回到初始狀態(tài)，平衡10min。

1.2.5 重組茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的酶學性質(zhì)測定

1.2.5.1 最適反應溫度

在pH7.5時，測定不同反應溫度(25、30、35、40、45、50℃)條件下EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活力，確定其最適反應溫度。

1.2.5.2 最適反應pH值

在溫度為35℃時，測定不同pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)條件下EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活力，確定其最適反應pH值。

1.2.5.3 酶的動力學常數(shù)

在最適反應溫度和最適pH值條件下，以EGCG為底物，分析測定EGCG-O-轉(zhuǎn)移酶的動力學常數(shù)；用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法繪出1/[V]-1/[S]直線，其斜率是Km/Vmax，在縱軸上的截距為1/Vmax，橫軸上的截距為－1/Km。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的鎳離子螯合柱親和純化

由圖1可知，當洗脫液中的咪唑濃度為10～30mmol/L時，有部分雜質(zhì)蛋白被洗脫下來，說明在純化的起始過程中，可先用濃度為30mmol/L的咪唑洗脫液去除大腸桿菌體內(nèi)以及反應體系中可能存在的一些原有的雜蛋白；當洗脫液中的咪唑濃度為40～90mmol/L時，無蛋白質(zhì)被洗脫出來，說明大部分雜蛋白可能已洗脫干凈；當洗脫液中咪唑濃度大于100mmol/L時，目的蛋白開始被洗脫出來，當咪唑濃度為200mmol/L時，目的蛋白被大量洗脫出來；此外，當洗脫液中咪唑濃度為300～500mmol/L時也有少量的目的蛋白被洗脫出來。可見，在純化EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的過程中，可采用梯度洗脫的方法進行洗脫。100～300mmol/L咪唑?qū)挠镜乐须s蛋白含量已經(jīng)很少(箭頭所示為目的蛋白)，說明此濃度范圍純化效果較好，可獲得高純度的EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶；經(jīng)分析檢測，酶的純度超過95%，分子質(zhì)量約為27.6kD。

圖 1 0～500mmol/L的咪唑洗脫蛋白的SDA-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE analysis of protein eluted by PBS with 0 — 500 mmol/L imidazole

表 1 重組茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的純化結(jié)果Table 1 Summary of purification of recombinant tea EGCG-Otransferase

重組茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的純化結(jié)果見表1，采用鎳離子親和層析可以實現(xiàn)對重組茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的快速純化，得到純度較高的EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的酶蛋白。

2.2 重組茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的酶學性質(zhì)

2.2.1 最適反應溫度

分別測定重組茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶在25～50℃條件下的酶活力，考察EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化反應的最佳溫度。以酶活力最高值為100%，對不同溫度作圖，結(jié)果見圖2。EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的最適反應溫度在35℃左右。

自發(fā)現(xiàn)O-甲基轉(zhuǎn)移酶以來，已從植物中直接分離純化或經(jīng)基因克隆獲得了多種O-甲基轉(zhuǎn)移酶，通過研究其酶學性質(zhì)發(fā)現(xiàn)O-甲基轉(zhuǎn)移酶的最適反應溫度在35℃左右，最適pH值在6.5～8.0之間。比如Noriko等[16]從荷蘭鳶尾中克隆表達的2種咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，并發(fā)現(xiàn)其最適溫度為35℃，最適pH值為7.5～8.0；Wang等[17]研究表明仙女扇(Clarkia breweri)中的丁香酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶最適溫度為35℃，最適pH值為7.5。

圖 2 溫度對EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on tea EGCG-O-transferase activity

2.2.2 最適反應pH值

預實驗結(jié)果表明，當緩沖液pH值小于6.0時，向反應體系中加入EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶后，反應體系會迅速變渾濁，經(jīng)HPLC檢測未發(fā)現(xiàn)任何新物質(zhì)生成，這表明當pH值小于6.0時，EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶會發(fā)生失活。實驗分別測定重組茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶在pH6.0～8.5條件下的酶活力，考察EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化反應的最適pH值。以酶活力最高值為100%，對不同 pH值作圖，結(jié)果見圖3。該酶的最適反應pH值為7.5。此結(jié)果與Noriko[16]、Wang[17]等的研究結(jié)果基本一致。

圖 3 pH值對EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on tea EGCG-O-transferase activity

2.2.3 酶動力學參數(shù)的確定

在最適反應溫度35℃和最適pH 7.5條件下，以EGCG作為底物，測定酶反應的反應速率，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖。由圖4可知，其回歸方程為：y = 0.0134x +0.1336(R2=0.9943)， EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的Km值為0.100mmol/L，Vmax為7.485mg/(L·min)。Km值的大小表示酶對底物親合力的大小，Km越小表明酶對底物的親合力越強。

圖 4 雙倒數(shù)法測定EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的米氏常數(shù)Fig.4 Km determination of tea EGCG-O-transferase by doublereciprocal plot

3 結(jié) 論

重組茶樹EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶經(jīng)過HisTMTrap親和層析純化后，可得到純度超過95%的重組融合蛋白，純化倍數(shù)為22.51倍，酶活回收率為34.54%，酶比活力達到0.0186U/mg，酶分子質(zhì)量約為27.6kD。

酶學性質(zhì)測定結(jié)果表明，該酶的最適反應溫度為3 5 ℃，最適p H 值為7.5；以EGCG作為反應底物，得到Lineweaver-Burk雙倒數(shù)線性回歸方程為y= 0.0134x+0.1336(R2=0.9943)，Km為0.100mmol/L，Vmax為7.485mg/(L·min)。

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