蒼白芽孢桿菌D-阿拉伯糖異構(gòu)酶克隆表達(dá)及D-塔格糖制備

張 娥，張 梁，石貴陽*

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

D-阿拉伯糖異構(gòu)酶(D-AI，EC5.3.1.3)，系統(tǒng)名稱為D-阿拉伯糖醛-酮糖異構(gòu)酶，催化D-阿拉伯糖(醛糖)異構(gòu)為D-核酮糖(酮糖)[1]。蒼白芽孢桿菌中的D-阿拉伯糖異構(gòu)酶，不僅可以催化D-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化生成D-核酮糖，同時還可以催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化生成D-塔格糖(tagatose)[2]。

D-塔格糖是一種在自然界中存在但較為稀有的天然六碳酮糖，是果糖的一種差向異構(gòu)體[3]，相對分子質(zhì)量180.16，甜度為蔗糖的92%，甜味特性與蔗糖相似，而產(chǎn)生的熱量只為蔗糖的1/3，所以被稱之為低熱量甜味劑[4]。此外，塔格糖對強(qiáng)力甜味劑還有很好的協(xié)同增效作用，包括甜蜜素、糖精、阿斯巴甜、安賽蜜、甜菊糖、紐甜和三氯蔗糖等[5]。2001年，美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)其為普遍公認(rèn)安全食品(GRAS)[3]。許多食品(如滅菌牛乳、超高溫滅菌乳、乳粉、熱可可、各種干酪、某些品種的酸乳、嬰兒配方食品)以及某些植物、藥物中都存在有一定量的塔格糖[3]。D-塔格糖具有抑制高血糖、改善腸道菌群、抗齲齒等功能，以甜味劑、賦形劑、保濕劑和穩(wěn)定劑等形式作為各種添加劑，被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域[6-7]。

目前塔格糖的生產(chǎn)方法主要有兩大類：化學(xué)催化法和生物轉(zhuǎn)化法[8]。化學(xué)催化合成是利用各種化學(xué)催化劑將D-半乳糖催化為D-塔格糖。在這個過程中容易產(chǎn)生很多副產(chǎn)物，而且這些雜質(zhì)與D-塔格糖混在一起很難分離，因此D-塔格糖的產(chǎn)率不高。

生物轉(zhuǎn)化法中有一種是以半乳糖醇為原料，利用各種微生物的半乳糖醇脫氫酶將其氧化為D-塔格糖，如Mycobacterium smegmatis[9]，但考慮到半乳糖醇是一種比較貴的試劑(500～800$/kg)[10]，所以這種方法的價值不大；另一種是通過L-阿拉伯糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化半乳糖生成塔格糖。1993年，Cheetham等[11]首次報道了利用微生物的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-AI)活性發(fā)酵D-半乳糖生產(chǎn)D-塔格糖的研究。目前研究較多的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)塔格糖的方法是利用L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖，但對利用D-阿拉伯糖異構(gòu)酶來催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖還未見報道。

本實驗采用一種新型耐熱型D-阿拉伯糖異構(gòu)酶來高效生產(chǎn)D-塔格糖，利用實驗室保藏的菌種經(jīng)過基因工程的方法構(gòu)建成含有D-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的工程菌，并用該工程菌所表達(dá)的D-阿拉伯糖異構(gòu)酶合成D-塔格糖。同時研究pH值、溫度、金屬離子及底物濃度等因素對酶合成D-塔格糖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒼白芽孢桿菌(Geobacillus pallidus)是由江南大學(xué)工業(yè)微生物保藏中心所得，編號CICIM B3101；宿主菌E.coli JM109、BL21(DE3)、pET-28a載體等均來自本實驗室保藏；PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

DNA polymerase、pMD-18T載體、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒 生工生物工程(上海)有限公司；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶SacⅠ、Xho Ⅰ及PCR產(chǎn)物純化試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司；蛋白電泳標(biāo)樣 中國科學(xué)院上海生化研究所；D-塔格糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫金屬浴鍋 杭州博日科技有限公司；Sonics 750超聲波細(xì)胞破碎儀 美國Sonic & Materials有限公司；PCR儀 東勝龍創(chuàng)新生物科技有限公司；UV-2100分光光度計 尤尼科上海儀器有限公司；垂直板狀電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Alpha Innotech凝膠成像系統(tǒng) 美國Alpha Innotech公司；4K15型臺式高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；全自動制冰機(jī) 英國Grant公司；DW3型冷凍干燥機(jī) 丹麥Het公司；AKTA Purifi er蛋白分離純化儀 美國通用電氣公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)D-阿拉伯糖異構(gòu)酶菌株的篩選

LB(種子)培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5、蛋白胨10、氯化鈉10，pH 7.0～7.2，0.1MPa滅菌20min。固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：D-阿拉伯糖1.5、酵母膏10、蛋白胨10、無水乙酸鈉10、K3PO40.2、MgSO4·7H2O 0.2、FeSO4·7H2O 0.2、NaCl 0.01，pH7.0，0.1MPa滅菌20min。

將菌種通過種子培養(yǎng)基活化后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h。將發(fā)酵液6000r/min離心10min，收集菌體，用PBS緩沖液(pH7.0，0.2mol/L)洗滌兩次，再將收集的菌體于冰浴中超聲波破碎至澄清，離心收集上清得細(xì)胞破碎液。取細(xì)胞破碎液進(jìn)行酶反應(yīng)，酶反應(yīng)條件：0.5mL酶液+1mL 0.83mol/L的D-半乳糖(pH7.0，內(nèi)含5mmol/L MnCl2)60℃，反應(yīng)1h，取0.1mL反應(yīng)液加入0.9mL 0.1mol/L鹽酸終止反應(yīng)。取反應(yīng)液適當(dāng)稀釋后，利用半胱氨酸-咔唑法[12]測定酶活。取25mL具塞試管7個，分別加100μg/mL的D-塔格糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、50、100、200、300、400、500μL，再用蒸餾水分別補(bǔ)充至1mL，然后每管中加入0.2mL 1.5%的半胱氨酸鹽酸溶液，6mL 70%的濃硫酸溶液，搖勻后，立即加入0.2mL 0.12%的咔唑酒精溶液，搖勻于60℃保溫10min，取出冰浴中冷卻10min，在波長560nm處比色，以D-塔格糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)線性曲線y=0.02479x+0.0081(R2=0.99646)。

酶活力單位定義：以D-半乳糖為底物，每毫升發(fā)酵液每分鐘轉(zhuǎn)化生成1μg D-塔格糖所需的酶量，作為一個酶活力單位，以U表示。

1.3.2 D-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的PCR擴(kuò)增

蒼白芽孢桿菌基因組DNA的提取方法參照細(xì)菌基因組DNA的制備[13]。

根據(jù)NCBI中報道的G.pallidus D-阿拉伯糖異構(gòu)酶(D-AI)基因序列(數(shù)據(jù)庫登記號為GenBank：AB429010.1，GI：226069485)為模板，設(shè)計PCR引物P1/P2：P1：5’- GCCGAG CTCATGGCAAAAGATCCACGATATG-3’，P2：5’- CCCC TCGAGTTATTTATAGATCGGCCCAAAGT-3’，其中P1包含Sac Ⅰ限制性酶切位點，P2包含XhoⅠ限制性酶切位點。

以蒼白芽孢桿菌基因組DNA為模板，以P1/P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：dNTPs、10×Buffer各2.5μL，上下游引物各0.5μL，模板1μL，滅菌的雙蒸水18μL，Taq酶0.3μL。其擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)熱5min，94℃變性30s，54℃退火45s，72℃延伸2min，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果分析后，純化回收。

1.3.3 蒼白芽孢桿菌D-AI基因重組菌的構(gòu)建

將純化PCR產(chǎn)物連接到pMD-18T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，篩選氨芐抗性陽性克隆。挑取陽性克隆接種至氨芐抗性LB培養(yǎng)基，提質(zhì)粒用XhoⅠ和SacⅠ酶切驗證并測序鑒定，將測序正確的重組質(zhì)粒pET-28a-DAI和表達(dá)載體pET-28a分別用XhoⅠ和SacⅠ雙酶切后，用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中，篩選卡那抗性陽性克隆。

1.3.4 對重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE凝膠電泳檢測

挑取含重組質(zhì)粒pET-28a-DAI的陽性克隆菌株和空載對照pET28a/DE3于50μg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.6～0.8時，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.0mmol/L，30℃條件下再誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，離心收集菌體，用PBS緩沖液(pH7.0，0.2mol/L)洗滌后，于冰浴中超聲波破碎至澄清，離心收集上清得重組菌懸液，然后利用半胱氨酸-咔唑法[12]測定其酶活力。

取20μL樣品加入5μL的Loading Buffer，煮沸10min，12000r/min離心10min，上樣量15μL，采用10%分離膠、5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE鑒定蛋白表達(dá)與否。

1.3.5 酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究

將50mL重組菌培養(yǎng)液于6000r/min離心10min，收集細(xì)胞，用10mL 0.2mol/L pH 7.4磷酸緩沖液重懸進(jìn)行超聲破碎。破碎液經(jīng)8000r/min離心20min，收集上清，0.22μm濾膜過濾后使用美國GE公司的鎳柱His-Trap HP進(jìn)行純化，再用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。

1.3.5.1 最適pH值以及pH值穩(wěn)定性的測定

分別用0.2mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.0～6.0)、0.2mol/L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0～8.0)、0.2mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH8.0～10.0)配制酶液，加入到0.8mol/L的底物溶液中，酶-底物反應(yīng)體系在60℃反應(yīng)1h，測定各pH值條件下對應(yīng)的相對酶活力，并以最高酶活力為100%。

再將酶液置于0.2mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH4.0～6.0)、0.2mol/L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(pH6.0～8.0)、0.2mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH8.0～10.0)中，于60℃保溫1h，然后在60℃與底物反應(yīng)1h，測定各pH值條件下對應(yīng)的相對酶活力，并以最高酶活力為100%。

1.3.5.2 最適溫度以及溫度穩(wěn)定性的測定

將酶-底物反應(yīng)體系分別置于30、40、50、60、70、80、90℃條件下反應(yīng)1h，測定各溫度對應(yīng)的相對酶活力，并以最高酶活力為100%。

再將酶液在30、40、50、60、70、80、90℃條件下保溫1h，再與底物在60℃反應(yīng)1h，測定各溫度下對應(yīng)的相對酶活力，并以最高酶活力為100%。

1.3.5.3 金屬離子對酶活力的影響

在酶-底物反應(yīng)體系中，加入離子濃度終濃度為5mmol/L的各種金屬離子，60℃反應(yīng)1h，測定在不同金屬離子下對應(yīng)的相對酶活力，并以未加離子的酶活力為相對酶活力100%。反應(yīng)條件：用純化后的酶液，半乳糖濃度為0.83mol/L，反應(yīng)pH值為7.0，在60℃條件下反應(yīng)12h，不同的是每個體系所加的金屬離子不同。

1.3.6 最佳酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件的選擇

1.3.6.1 pH值對酶轉(zhuǎn)化的影響

選取pH6.0、7.0、8.0的反應(yīng)體系進(jìn)行粗酶液的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其他條件不變。反應(yīng)條件：采用D-阿拉伯糖異構(gòu)酶粗酶液，半乳糖濃度0.83mol/L，在60℃反應(yīng)，測定不同pH值條件下，轉(zhuǎn)化率隨時間的變化曲線。

1.3.6.2 溫度對酶轉(zhuǎn)化的影響

選取溫度為50、60、65℃的反應(yīng)體系進(jìn)行粗酶液的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其他條件不變。反應(yīng)條件：用D-阿拉伯糖異構(gòu)酶粗酶液，半乳糖濃度0.83mol/L，反應(yīng)pH7.0，測定不同溫度下，轉(zhuǎn)化率隨時間的變化曲線。

1.3.6.3 底物質(zhì)量濃度對酶轉(zhuǎn)化的影響

分別在D-半乳糖質(zhì)量濃度為5、10、18、25、50g/L條件下測定轉(zhuǎn)化反應(yīng)，其余條件不變。反應(yīng)條件為：將D-阿拉伯糖異構(gòu)酶粗酶液加入到不同質(zhì)量濃度底物中，反應(yīng)pH 7.0，在60℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，測定轉(zhuǎn)化率隨時間的變化曲線。

1.4 D-半乳糖轉(zhuǎn)化率的計算

采用半胱氨酸-咔唑法[12]，計算反應(yīng)一段時間后總反應(yīng)體系中生成D-塔格糖的量，與反應(yīng)體系中加入D-半乳糖的量的比值，即為D-半乳糖的轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)D-阿拉伯糖異構(gòu)酶菌株的篩選結(jié)果

表 1 5株菌酶比活力對比(n=3)Table 1 Specifi cactivity of five strains (n=3)

從實驗室保藏的1000株菌種中篩選出90株能產(chǎn)該酶的菌株，經(jīng)過復(fù)篩后選出5株酶活較高的菌株，如表1所示，分別是Geobacillus pallidus、Klebsiella pneumoniae、Escherichia coli K-12 W3110，Bacillus mojavensis、Pseudofirmus jessenii。其中有較高酶比活力的是Geobacillus pallidus。

2.2 含D-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的重組菌的構(gòu)建

以G.pallidus基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條1800bp的特異性條帶，其大小與理論值一致(圖1)。

圖 1 目的基因PCR擴(kuò)增D-AIFig.1 PCR result of target gene from D-AI

重組質(zhì)粒pET-28a-DAI經(jīng)XhoⅠ和SacⅠ雙酶切后，得到5400bp和1800bp的兩條帶(圖2)。

圖 2 重組質(zhì)粒pET-28a-DAI酶切驗證Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of pET-28a-DAI

對比測序結(jié)果和GenBank中報道的G.pallidus D-阿拉伯糖異構(gòu)酶(D-AI)基因的序列100%重合。

2.3 對D-阿拉伯糖異構(gòu)酶的誘導(dǎo)表達(dá)以及酶的分離純化

通過SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)在該誘導(dǎo)菌株中產(chǎn)D-AI的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量靠近70kD，跟報道的分子質(zhì)量67kD[1]很相近。根據(jù)軟件計算，該誘導(dǎo)菌株D-AI理論分子質(zhì)量應(yīng)為66.237kD(圖3a)。通過鎳柱His-Trap HP，用濃度為300mmol/L的咪唑?qū)⒛康牡鞍紫疵撓聛?圖3b)。

誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件是細(xì)胞在37℃條件下培養(yǎng)4h后，添加至終濃度為1.0mmol/L的IPTG，然后在30℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，酶活達(dá)到最高，為4.998U/mL。

圖 3 D-AI的誘導(dǎo)表達(dá)(a)及SDS-PAGE電泳(b)純化Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of inducible expression SDS-PAGE electrophoresis of purifi ed enzymes

2.4 D-阿拉伯糖異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 酶反應(yīng)最適pH值以及pH值穩(wěn)定性

圖 4 酶反應(yīng)最適pH值曲線Fig.4 Enzyme reaction optimum pH curve

圖 5 酶的pH值穩(wěn)定性曲線Fig.5 pH stability curves

由圖4可知，隨著體系從酸性向中性過渡，相對酶活逐漸升高，而當(dāng)體系逐漸偏堿性后，相對酶活力迅速下降，所以純化酶液的最適反應(yīng)pH值為7.0。由圖5可知，純化酶液的pH值穩(wěn)定范圍較寬，在pH6.0～8.0范圍內(nèi)放置lh后，酶活均能保持90%以上。且在相同pH值為6.0的體系下，磷酸鹽體系明顯比檸檬酸鹽體系能更好的作用于該酶，可能原因是檸檬酸鹽對該酶有一定的抑制作用；同樣，在相同pH值為8.0的體系下，磷酸鹽體系明顯比甘氨酸-氫氧化鈉體系能更好的作用于該酶，可能原因是甘氨酸對該酶有一定的抑制作用，因此選擇pH 7.0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液是最合適的。

2.4.2 最適溫度以及溫度穩(wěn)定性

圖 6 酶反應(yīng)最適溫度曲線Fig.6 Optimal enzyme reaction enzyme reaction

圖 7 酶的熱穩(wěn)定性曲線Fig.7 Thermal stability curve

由圖6、7可知，純化酶液最適溫度為60℃。在30～60℃條件下溫度穩(wěn)定性良好，基本變化不大，但是在70℃時相對酶活力降低為60%，隨著溫度繼續(xù)升高，酶的熱穩(wěn)定性和酶活力顯著降低，在90℃時相對酶活力降低到只有15%，基本快完全失活了。

結(jié)果表明，實驗所得的D-阿拉伯糖異構(gòu)酶是一種耐熱性能較好的酶，它可以在較高溫度下進(jìn)行催化反應(yīng)。高的反應(yīng)溫度可以增加糖的溶解性，減少微生物生長，消除在反應(yīng)過程中因溫度變化所需的能耗[14]，這對酶的催化反應(yīng)是十分有利的。在用半乳糖生產(chǎn)塔格糖的工業(yè)化應(yīng)用中，D-阿拉伯糖異構(gòu)酶可以滿足高溫(＞50℃)生成的要求。

2.4.3 金屬離子對酶活性的影響

表 2 金屬離子對酶活性的影響(n=3)Table 2 Effect of metal ion on enzyme activity (n=3)

添加某些金屬離子可以起到利于酶發(fā)揮活性與維持熱穩(wěn)定性的作用，所以本實驗考察了加入不同離子(濃度均為5mmol/L)對D-阿拉伯糖異構(gòu)酶酶活性的影響，由表2可知，Mn2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Ba2+分別增強(qiáng)酶活力92%、30%、21%、55%、8%，而Mg2+和Cu2+則分別對酶活力產(chǎn)生了不同程度的抑制。

Mn2+是大多數(shù)目前發(fā)現(xiàn)的D-AI反應(yīng)需要的金屬離子，不同濃度的Mn2+對酶活性影響很大，因此分析了不同濃度的Mn2+對酶活性的影響。

圖 8 不同濃度的Mn2+對酶活性的影響Fig.8 Effect of different concentration of Mn2+ on enzymatic activity

由圖8可知，隨著Mn2+濃度的增加，相對酶活力逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)液中Mn2+濃度達(dá)到5mmol/L時，相對酶活力達(dá)到最高。因此在做酶的轉(zhuǎn)化實驗時可以加入終濃度為5mmol/L的Mn2+來進(jìn)行反應(yīng)。

2.5 最佳酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件的選擇

2.5.1 pH值對D-阿拉伯糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化的影響

圖 9 pH值對酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig.9 Effect of pH on enzymatic conversion reaction

由圖9可知，pH6.0和pH7.0時不同反應(yīng)時間對酶轉(zhuǎn)化率的影響不大。pH值為8.0的時候轉(zhuǎn)化率偏低一點，原因是在偏酸性條件下產(chǎn)物D-塔格糖比較穩(wěn)定，而在偏堿性環(huán)境下D-塔格糖不穩(wěn)定，容易轉(zhuǎn)化形成其他物質(zhì)，造成其含量偏低。

2.5.2 溫度對D-阿拉伯糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化的影響

由圖10可知，溫度對酶轉(zhuǎn)化率的影響比較明顯，60℃時轉(zhuǎn)化率最高。50℃的轉(zhuǎn)化率低于60℃的轉(zhuǎn)化率，原因是反應(yīng)溫度未達(dá)到酶的最適反應(yīng)溫度，因此酶與底物沒有更好的結(jié)合在一起，導(dǎo)致產(chǎn)物含量偏低。而65℃的轉(zhuǎn)化率最低，是因為溫度過高，使部分酶失活，導(dǎo)致酶活性位點與底物不能更多的結(jié)合，對酶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了較大影響，從而使轉(zhuǎn)化率降低。

圖 10 溫度對酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig.10 Effect of temperature on enzymatic conversion reaction

2.5.3 不同質(zhì)量濃度的底物對D-阿拉伯糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化的影響

圖 11 底物質(zhì)量濃度對酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響Fig.11 Effect of substrate concentration on enzymatic conversion reaction

由圖11可知，在12h之內(nèi)，隨著底物質(zhì)量濃度的逐漸增加，D-塔格糖的生成量是逐漸增加的。在反應(yīng)過程中，酶的質(zhì)量濃度為定值，底物的起始質(zhì)量濃度較低時，酶促反應(yīng)速率與底物質(zhì)量濃度成正比，即隨底物質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)所有的酶與底物結(jié)合生成產(chǎn)物后，即使再增加底物質(zhì)量濃度，產(chǎn)物質(zhì)量濃度也不會增加，酶促反應(yīng)速率也不增加。在18g/L底物質(zhì)量濃度時參與酶反應(yīng)后轉(zhuǎn)化率更高一些，因此確定半乳糖質(zhì)量濃度為18g/L最為合適。在12h之內(nèi)，隨著轉(zhuǎn)化時間的逐漸增加，D-塔格糖的生成量是逐漸增加的，在轉(zhuǎn)化12h后基本達(dá)到動態(tài)平衡，在18g/L底物質(zhì)量濃度時其最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)41.6%。

3 結(jié) 論

由于野生菌株培養(yǎng)不易以及酶制備較困難(產(chǎn)酶水平低)，因此，通過基因工程技術(shù)對其進(jìn)行高效制備是實現(xiàn)其工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵步驟之一。同時，阿拉伯糖異構(gòu)酶催化半乳糖異構(gòu)化為塔格糖的反應(yīng)為一可逆過程，在高溫條件下，此反應(yīng)平衡偏向于塔格糖。因此，高溫阿拉伯糖異構(gòu)酶的獲得在塔格糖工業(yè)生產(chǎn)和高效制備中具有十分重要的意義。

本研究選擇耐高溫型菌株Geobacillus pallidus基因組DNA作為模板，用PCR方法克隆得到D-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因D-AI，并將其轉(zhuǎn)入表達(dá)載體pET-28a中表達(dá)。經(jīng)SDSPAGE分析，30℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，酶活力達(dá)到最高，且目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在于菌體中。

D-阿拉伯糖異構(gòu)酶的最適反應(yīng)溫度和pH值分別為60℃和7.0，而報道的大部分異構(gòu)酶的最適溫度都小于60℃，且最適pH值均在偏堿性條件，但塔格糖的穩(wěn)定pH值范圍是在2.0～7.0，所以該酶比報道的酶更適合生產(chǎn)塔格糖。Mn2+對D-阿拉伯糖異構(gòu)酶有明顯的激活作用，而Cu2+則對D-阿拉伯糖異構(gòu)酶有顯著的抑制作用，可使酶幾乎完全失活。

將底物質(zhì)量濃度為18g/L的D-半乳糖(含5mmol/L的Mn2+)，加入pH值為7.0的重組細(xì)胞粗酶液中，在60℃條件下反應(yīng)12h，可達(dá)到最高轉(zhuǎn)化率為41.6%，有報道顯示，來源于耐高溫菌Bacillus stearothermophilis IAM 1100l基因的重組阿拉伯糖異構(gòu)酶菌株，全細(xì)胞反應(yīng)24h后D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率才達(dá)到39.8%[15]。這表明具有生物活性的重組D-AI在大腸桿菌E.coli(BL21)中成功表達(dá)了，且該D-AI具備工業(yè)化生產(chǎn)D-塔格糖的潛能，但D/L-AI催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖的過程仍然需要更進(jìn)一步的比較研究。

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