薏米酒發(fā)酵前淀粉液化及糖化條件的優(yōu)化

郭克娜，姜璐璐，闞建全,,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400716)

薏米(Coix lachryma-jobi)，又名薏苡仁、苡米、米仁，是我國(guó)民間傳統(tǒng)的中藥，也是一種膳食佳品?！侗静菥V目》謂其“健脾益胃、補(bǔ)肺清熱、祛風(fēng)勝濕、養(yǎng)顏駐容、輕身延年”。大量研究報(bào)道表明，薏仁提取物薏仁油、薏仁酯、薏仁多糖等有很強(qiáng)的生物活性，如健胃、消炎、利尿、止痛、降血糖、抗癌等[1-7]。近年來(lái)隨著保健食品的風(fēng)行，國(guó)外特別是日本對(duì)薏米進(jìn)行了較為深入的研究和開(kāi)發(fā)。但是雖然以薏米為原料的營(yíng)養(yǎng)食品、藥膳佳肴層出不窮，但對(duì)薏米酒的研究和生產(chǎn)卻少見(jiàn)報(bào)道。主要由于薏米淀粉顆粒較大，且不易α化[8-9]，如果不將薏米淀粉進(jìn)行充分液化和糖化就進(jìn)行酒精發(fā)酵，再加上薏米本身的特殊氣味，研制出的薏米酒往往因?yàn)楦泄儋|(zhì)量上的缺陷不能被大多數(shù)消費(fèi)者所接受，因此無(wú)法實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。所以在酒精發(fā)酵之前，對(duì)薏米原料的液化和糖化工藝進(jìn)行研究，保證薏米酒發(fā)酵的品質(zhì)與穩(wěn)定性就顯得非常重要。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)薏米淀粉進(jìn)行水解，研究液化和糖化工藝的最優(yōu)條件，旨在為后期薏米的酒精發(fā)酵提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米，市售，選用顆粒飽滿，無(wú)發(fā)黃無(wú)霉變的薏米，在高速粉碎機(jī)中粉碎后過(guò)40目標(biāo)準(zhǔn)篩，備用。

α-淀粉酶(酶活力3700U/g)、糖化酶(酶活力10萬(wàn)U/g) 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 薏米淀粉水解工藝流程

1.2.1 液化工藝流程

1.2.2 糖化工藝流程

1.3 分析方法

1.3.1 薏米主要成分的測(cè)定方法

淀粉：酸水解法[10]；粗蛋白：微量凱氏定氮法[10]；粗脂肪：索氏抽提法[10]；粗多糖：比色法[10]；水分測(cè)定：卡爾·費(fèi)休法[10]。

1.3.2 水解液相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定方法

還原糖(以葡萄糖計(jì))測(cè)定：斐林試劑法[10]；溶液相對(duì)密度：密度計(jì)法；DE值[11]：又叫葡萄糖當(dāng)量值，是還原糖(以葡萄糖計(jì))占溶液中干物質(zhì)的百分比，計(jì)算公式如下：

1.3.3 薏米淀粉液化工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)[12-19]

將薏米粉按料液比1：10(m/V)糊化后，進(jìn)行液化工藝的優(yōu)化。單因素試驗(yàn)基本條件定為α-淀粉酶添加量1%、pH 6.5、溫度70℃、液化時(shí)間3h。改變其中一個(gè)條件，固定其他條件以分析各因素對(duì)液化效果的影響。各因素梯度分別為α-淀粉酶添加量0.25%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%；pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0；溫度55、60、65、70、75、80℃；液化時(shí)間1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h。

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定4個(gè)因素的合適水平范圍，再選取L9(34)正交表，以液化DE值為考核指標(biāo)，設(shè)計(jì)了四因素三水平的正交試驗(yàn)，以確定液化最優(yōu)條件組合。以上試驗(yàn)每個(gè)處理重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 薏米淀粉糖化工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在最佳液化工藝條件下進(jìn)行糖化工藝的優(yōu)化。單因素基本條件設(shè)定為糖化時(shí)間3h、糖化酶添加量1%、溫度60℃、pH4.5。改變其中一個(gè)條件，固定其他條件以分析各因素對(duì)糖化效果的影響。各因素梯度分別為糖化時(shí)間1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h；糖化酶添加量0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；溫度45、50、55、60、65、70℃；pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取L9(34)正交表，以糖化DE值為考核指標(biāo)，設(shè)計(jì)了四因素三水平的正交試驗(yàn)，以確定糖化最優(yōu)條件組合。以上試驗(yàn)每個(gè)處理重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理方法

采用Origin Lab Origin Pro v7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 薏米主要成分的分析結(jié)果

表 1 薏米主要成分Table 1 Major components of coixseeds

由表1可知，薏米中含量最高的成分是淀粉，此外薏米是禾本科一年生草本植物中蛋白質(zhì)及脂肪含量較高的一類，其蛋白質(zhì)含量比稻米約高出2倍[4]，脂肪含量是稻米的6倍左右。而薏米中重要的生理活性成分薏仁多糖的含量也非常可觀。

2.2 薏米淀粉液化最佳工藝條件的確定

2.2.1 α-淀粉酶添加量對(duì)液化液DE值的影響

圖 1 α-淀粉酶添加量對(duì)液化液DE值的影響Fig.1 Effect of α-amylase amount on DE of liquefaction

由圖1可知，隨著α-淀粉酶添加量增加，DE值迅速升高；但當(dāng)加酶量大于2.00%時(shí)，DE值基本趨于穩(wěn)定。這是由于加酶量小于2.00%時(shí)，底物質(zhì)量濃度大于淀粉酶的質(zhì)量濃度，反應(yīng)速率受加酶量的影響較大，DE值隨著加酶量的增加而快速增大；加酶量大于2.00%時(shí)，隨著酶質(zhì)量濃度逐漸增大，一部分酶分子沒(méi)有機(jī)會(huì)和底物接觸，致使水解液DE值基本不再變化。考慮到成本因素，選取2.00%為較優(yōu)的α-淀粉酶添加量。

2.2.2 pH值對(duì)液化液DE值的影響

圖 2 pH值對(duì)液化液DE值的影響Fig.2 Effect of pH on DE of liquefaction

由圖2可知，水解液DE值隨著pH值的增大先升高后降低，pH值在7左右，即薏米糊化后在自然狀態(tài)下液化時(shí)DE值最大，達(dá)到18.72%。因?yàn)閜H值會(huì)影響酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性和極性基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而影響酶分子的構(gòu)象以及酶與底物的結(jié)合力和催化能力[20]。α-淀粉酶最適作用pH值為6.0～7.0，在這個(gè)pH值范圍內(nèi)，α-淀粉酶才能很好的發(fā)揮作用。水解液過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)影響其穩(wěn)定性，導(dǎo)致酶活性降低甚至失去活性。因此，較優(yōu)的液化pH值為7.0左右。

2.2.3 液化溫度對(duì)液化液DE值的影響

圖 3 液化溫度對(duì)液化液DE值的影響Fig.3 Effect of temperature on DE of liquefaction

由圖3可知，水解液DE值隨著溫度的升高先增大后降低，溫度為65℃時(shí)DE值最大，達(dá)到17.49%。液化溫度同時(shí)影響化學(xué)反應(yīng)速率和酶的活性，當(dāng)溫度小于65℃時(shí)，隨著溫度的升高，單位時(shí)間內(nèi)酶分子與底物間的有效碰撞次數(shù)增加，液化反應(yīng)速率加快；而當(dāng)溫度超過(guò)65℃時(shí)，隨著溫度的繼續(xù)升高，α-淀粉酶變性失活，液化反應(yīng)速率迅速下降。因此，液化的較優(yōu)溫度在65℃左右。

2.2.4 液化時(shí)間對(duì)液化液DE值的影響

圖 4 液化時(shí)間對(duì)液化液DE值的影響Fig.4 Effect of liquefaction time on DE of liquefaction

由圖4可知，隨著液化時(shí)間的延長(zhǎng)，水解液DE值逐漸增大，在3h之前增加很快，然后趨于穩(wěn)定。淀粉的液化分兩個(gè)階段，開(kāi)始時(shí)α-淀粉酶首先使直鏈淀粉快速降解，產(chǎn)生寡糖，使溶液黏度快速下降；然后作用于支鏈淀粉產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖和一系列α-限制糊精，同時(shí)使寡糖緩慢水解成葡萄糖和麥芽糖，從而使淀粉液化。后一階段反應(yīng)速率比前一階段要慢得多，這可能是導(dǎo)致液化3h后DE值趨于穩(wěn)定的主要原因。另外，隨著水解程度的加深，α-1,4-糖苷鍵減少，淀粉中存在的α-1,6-糖苷鍵影響了α-淀粉酶的水解速度，同時(shí)不斷積累的酶解產(chǎn)物也會(huì)抑制酶的活性，使水解逐漸變慢。為了節(jié)約時(shí)間以提高效率，確定液化時(shí)間為3h。

2.2.5 薏米淀粉液化的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表 2 薏米淀粉液化條件優(yōu)化L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal tests of liquefaction of coixseed starch

表 3 薏米淀粉液化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance for liquefaction of coixseed starch

由表2可知，各因素對(duì)液化液DE值都有影響，其影響主次順序?yàn)椋簻囟龋睛?淀粉酶添加量＞pH值＞時(shí)間。由表3方差分析可知，α-淀粉酶添加量和溫度對(duì)液化效果有顯著影響；pH值和液化時(shí)間對(duì)液化效果影響不顯著。由此可得出最佳組合為A3B1C1D3，但此組并未出現(xiàn)在試驗(yàn)組中，故進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出該條件下水解液DE值為22.12%，低于試驗(yàn)組中液化DE值最高的組合，故確定液化最優(yōu)水平組合為A3B2C1D3，即α-淀粉酶用量2.0%、pH 6.5、溫度60℃、液化時(shí)間3.0h。

2.3 薏米淀粉糖化最佳工藝條件的確定

2.3.1 糖化時(shí)間對(duì)糖化液DE值的影響

圖 5 糖化時(shí)間對(duì)糖化液DE值的影響Fig.5 Effect of saccharification time on DE of saccharification

由圖5可知，2.5h之前糖化液DE值隨著糖化時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，2.5h之后趨于平緩。這是因?yàn)樘腔磻?yīng)剛開(kāi)始時(shí)，底物的濃度較高，反應(yīng)速度受時(shí)間的影響較大；隨著反應(yīng)的進(jìn)行底物濃度逐漸降低，反應(yīng)速率也隨之降低，2.5h后DE值無(wú)顯著變化(P＞0.05)。綜合考慮糖化效果和生產(chǎn)效率，選取2.5h為較優(yōu)糖化時(shí)間。

2.3.2 糖化酶添加量對(duì)糖化液DE值的影響

圖 6 糖化酶添加量對(duì)糖化液DE值的影響Fig.6 Effect of glucoamylase amount on DE of saccharification

由圖6可知，加酶量小于1.5%，水解速度隨酶用量的增加而升高；加酶量大于1.5%時(shí)，糖化DE值變化不大(P＞0.05)?？紤]到成本因素，選取1.5%為較優(yōu)的糖化酶添加量。

2.3.3 糖化溫度對(duì)糖化液DE值的影響

圖 7 糖化溫度對(duì)糖化液DE值的影響Fig.7 Effect of temperature on DE of saccharification

由圖7可知，水解液DE值隨著溫度的升高先升高后降低，溫度為65℃時(shí)達(dá)到最大值。這是因?yàn)樘腔冈谑覝刂?5℃內(nèi)起糖化作用；超過(guò)65℃糖化酶失活嚴(yán)重。因此，較優(yōu)的糖化溫度為65℃。

2.3.4 pH值對(duì)糖化液DE值的影響

圖 8 pH值對(duì)糖化液DE值的影響Fig.8 Effect of pH on DE of saccharification

由圖8可知，隨著pH值的增大，水解液DE值先升高后降低，pH值為5時(shí)DE值達(dá)到最大73.3%，隨后迅速下降。原因是糖化酶的最適作用pH值為4.0～4.5，pH值過(guò)大或過(guò)小都會(huì)導(dǎo)致酶蛋白變性，從而影響酶分子與底物分子的結(jié)合和催化，最終影響水解速率。因此，確定糖化pH值為5.0。

2.3.5 薏米淀粉糖化的正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表 4 薏米淀粉糖化條件優(yōu)化L9(34)正交試驗(yàn)與結(jié)果Table 4 Orthogonal tests of saccharification of coixseed starch

表 5 薏米淀粉糖化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Analysis of variance for saccharification of coixseed starch

由表4可知，各因素對(duì)糖化DE值影響主次順序?yàn)椋簳r(shí)間＞糖化酶加酶量＞溫度＞pH值。由表5方差分析可知，時(shí)間對(duì)糖化效果有極顯著影響，而糖化酶的添加量對(duì)糖化效果有顯著影響。由此可得出最佳組合為A2B3C3D3，但此組并未出現(xiàn)在試驗(yàn)組中，故進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出該條件下水解液DE值為75.7%，低于試驗(yàn)組中糖化DE值最高的組合，故確定糖化最優(yōu)水平組合為A2B3C1D2，即糖化時(shí)間2.5h、糖化酶添加量2.5%、溫度55℃、pH4.5。在此最優(yōu)水平組合下得到的最終水解液中還原糖含量和DE值分別為6.87g/100mL和76.4%。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)薏米酒精發(fā)酵之前的液化和糖化工藝進(jìn)行了研究，確定最佳液化工藝條件為：α-淀粉酶添加量2.0%、pH6.5、液化溫度60℃、液化時(shí)間3.0h，此時(shí)液化液的DE值為22.55%，過(guò)濾后水解液澄清透明，色澤淺黃，不黏稠。在此條件下液化后的料液，再加入糖化酶進(jìn)行糖化的最佳工藝參數(shù)為：糖化時(shí)間2.5h、糖化酶加酶量2.5%、糖化溫度55℃、pH4.5，最終水解液中還原糖含量和DE值分別為6.87g/100mL和76.4%。為后續(xù)薏米酒精發(fā)酵的研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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