葡萄醋抗氧化活性比較研究

孫瑩瑩，劉建書，李志西,*，張 強(qiáng)

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.陜西省功能食品工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710054)

葡萄為葡萄屬落葉木質(zhì)藤本植物的果實(shí)，別名蒲萄、蒲桃、蒲陶、賜紫櫻桃等。葡萄的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，富含葡萄糖、有機(jī)酸及各種維生素。葡萄的保健功能源于它含有豐富的多酚類物質(zhì)，如沒食子酸、兒茶素、白藜蘆醇、原花青素、單寧等[1]。植物多酚是一類很有應(yīng)用前景的天然抗氧化劑及自由基清除劑[2]。Bagchi等[3]研究發(fā)現(xiàn)原花青素是很有效的自由基清除劑，王忠合等[4]研究證明原花青素具有很強(qiáng)的抗氧化、抗癌、保護(hù)心血管及抗衰老等多種功效。夏蘭蘭等[5]研究證明葡萄籽多酚化合物具有很強(qiáng)的抗氧化能力及抗癌作用。

葡萄醋以葡萄為原料，經(jīng)過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵釀制而成，富含醋酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸等多種有機(jī)酸[6]，口感醇厚、風(fēng)味獨(dú)特，是集調(diào)味、營(yíng)養(yǎng)、保健為一體的新型發(fā)酵制品。有關(guān)葡萄醋的研究前人已做了一定的工作。楊艷彬等[7]報(bào)道了一種葡萄醋發(fā)酵工藝，通過獲得較高含量的白藜蘆醇來提高葡萄醋的品質(zhì)和保健功能。顧立眾[8]設(shè)計(jì)了疊式動(dòng)態(tài)表面發(fā)酵塔來生產(chǎn)葡萄醋。李鳳英等[9]利用葡萄皮渣為原料釀造葡萄醋，為葡萄皮渣的綜合利用提供一條新的思路。但是關(guān)于葡萄發(fā)酵產(chǎn)物(醋及其酒醪)的抗氧化活性比較研究目前還少見報(bào)道。本研究以巨峰、京亞、藤稔、美麗葡萄的鮮果為原料，比較不同品種的葡萄釀制的葡萄醋及其酒醪的抗氧化活性的強(qiáng)弱，為葡萄的深加工及綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

巨峰、京亞、藤稔葡萄采于河南偃師，美麗葡萄采于陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院示范基地。

酵母菌 湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌 上海中科伍佰豪生物有限公司；福林酚試劑 上海荔達(dá)生物科技有限公司；蘆丁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國(guó)Sigma公司；總抗氧化能力試劑盒 南京建成生物工程研究所；沒食子酸 成都曼斯特生物科技有限公司；無水碳酸鈉、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-1700型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；TD5A臺(tái)式離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；202-00干燥箱 北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司；噴射式自吸發(fā)酵罐 實(shí)驗(yàn)室自制[10]。

1.2 方法

1.2.1 葡萄醋發(fā)酵工藝

葡萄醋發(fā)酵操作要點(diǎn)：將清選后的葡萄鮮果輕度破碎后，加入0.1%活性酒用干酵母，置于10L的小型發(fā)酵罐內(nèi)，在25℃的條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵72h后，離心分離(4000r/min，10min)得到葡萄酒醪。再按照1：10的體積比接入活化的醋酸菌液，于33℃的溫度條件下，利用噴射式自吸發(fā)酵罐[10]進(jìn)行液態(tài)深層發(fā)酵。

1.2.2 總抗氧化能力測(cè)定

總抗氧化能力測(cè)定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行。在37℃條件下，每分鐘內(nèi)1mL樣品溶液使反應(yīng)體系的吸光度每增加0.01時(shí)，計(jì)為一個(gè)總抗氧化能力單位。

式中：A測(cè)定為測(cè)定管吸光度；A對(duì)照為對(duì)照管吸光度；N為反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)(反應(yīng)液總體積/取樣量)；n為樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.2.3 還原能力測(cè)定

采用普魯士藍(lán)法[11]。分別取1.0mL不同體積分?jǐn)?shù)的樣品溶液，然后加入0.2mol/L pH6.6的磷酸緩沖液2.5mL混勻，再加入1g/100mL的鐵氰化鉀溶液2.5mL，充分混勻，置于50℃水浴20min后，加入10g/100mL的三氯乙酸溶液2.5mL，3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，加蒸餾水2.5mL以及0.1g/100mL的FeCl3溶液1mL，混勻，在波長(zhǎng)700nm處測(cè)定吸光度。

1.2.4 DPPH自由基清除能力測(cè)定[12-13]

將2mL 0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液分別加入到2mL含有20、35、50、65、80μL的樣品水溶液中混勻，室溫避光反應(yīng)30min后，在波長(zhǎng)517nm處測(cè)定吸光度記為Ai，同時(shí)將2mL DPPH乙醇溶液和2mL無水乙醇混勻按上述方法測(cè)定吸光度計(jì)為Ac，以及2mL樣品水溶液和2mL無水乙醇混勻按上述方法測(cè)定吸光度記為Aj。根據(jù)式(2)計(jì)算清除率。

1.2.5 總多酚含量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法[14]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。準(zhǔn)確配制0.02mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取此標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于10mL容量瓶中，依次加入Folin-Ciocalteu試劑1.0mL和7.5g/100mL碳酸鈉溶液3.0mL，用蒸餾水定容至10mL，搖勻，顯色2h，在波長(zhǎng)765nm處測(cè)定吸光度。以吸光度(A765nm)為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=99.371x+0.0168(R2=0.9993)。

將不同的樣品稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，配成樣品溶液，準(zhǔn)確吸取各種樣品溶液1mL，分別置于10mL容量瓶中，按上述方法分別測(cè)定吸光度(A)，代入回歸方程計(jì)算樣品中的總多酚含量，每組做3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 總黃酮含量的測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法[15]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品。用120℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁準(zhǔn)確配制0.08mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取此標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于10mL容量瓶中，加入5g/100mL的NaNO2溶液0.5mL混合均勻，放置6min，然后加入10g/100mL的Al(NO3)3溶液0.5mL混合均勻，放置6min，最后加入4g/100mL的NaOH溶液3mL，以蒸餾水定容，放置15min，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度。以吸光度(A510nm)為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=11.538x+0.002(R2=0.9997)。

將不同的樣品稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，配成樣品溶液，準(zhǔn)確吸取各種樣品溶液1mL，置于10mL容量瓶中，按上述方法分別測(cè)定吸光度(A)，代入回歸方程計(jì)算樣品中的總黃酮含量，每組做3個(gè)重復(fù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件處理，數(shù)據(jù)以±s的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種的葡萄醋及其酒醪總抗氧化能力比較

從圖1可見，不同品種葡萄醋及其酒醪的總抗氧化能力有較大差異。其中，藤稔葡萄發(fā)酵產(chǎn)物(醋和酒醪)的總抗氧化能力最高，巨峰、京亞葡萄次之，美麗葡萄最弱；各品種葡萄醋的總抗氧化能力都稍低于相應(yīng)的酒醪，表明在醋酸發(fā)酵過程中發(fā)酵液的總抗氧化能力有小幅下降。這與鄭淑彥等[16]對(duì)枳椇醋發(fā)酵過程中發(fā)酵液的抗氧化活性的研究結(jié)果一致。還可以看出，葡萄醋的總抗氧化能力遠(yuǎn)高于蘋果醋和桃醋。這可能是由于葡萄中含有比較豐富的多酚類物質(zhì)，如白藜蘆醇和原花青素等，經(jīng)過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵，這些多酚類物質(zhì)都很好的保留在發(fā)酵產(chǎn)物——葡萄醋中，所以使得葡萄醋的總抗氧化能力相對(duì)較強(qiáng)。

圖 1 不同品種的葡萄醋及其酒醪的總抗氧化能力Fig.1 Total antioxidant capacity of vinegar and wine mash produced from different grape cultivars

2.2 不同品種的葡萄醋及其酒醪還原能力的比較

圖 2 不同品種的葡萄醋及其酒醪的還原能力Fig.2 Reducing power of vinegar and wine mash produced from different grape cultivars

從圖2可見，以蘋果醋和桃醋為參照，4個(gè)品種的葡萄醋及其酒醪都有比較強(qiáng)的還原能力，測(cè)定結(jié)果明顯高于蘋果醋和桃醋。并且，隨著樣品加入量的增加，還原能力也隨之增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。葡萄醋及其酒醪的還原能力在品種間具有較大的差異，藤稔葡萄醋及其酒醪的還原能力最強(qiáng)，巨峰、京亞葡萄次之，美麗葡萄最弱。同一品種的葡萄釀制的葡萄醋與其酒醪的還原能力比較接近。一般而言，樣品的還原能力通常與其抗氧化能力呈正相關(guān)，本研究與前人研究結(jié)果[17-19]一致。

2.3 不同品種的葡萄醋及其酒醪清除DPPH自由基能力的比較

圖 3 不同品種的葡萄醋及其酒醪清除DPPH自由基的能力Fig.3 DPPH radical scavenging capacity of vinegar and wine mash produced from different grape cultivars

從圖3可見，葡萄醋及其酒醪清除DPPH自由基的能力在品種間差異很大；同一品種葡萄釀制的葡萄醋與其酒醪在清除DPPH自由基的能力方面差異較小。藤稔葡萄發(fā)酵產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)，巨峰、京亞葡萄次之，美麗葡萄最弱。這與總抗氧化能力和還原能力的測(cè)定結(jié)果高度一致，其原因可能與葡萄中的總多酚、總黃酮含量有關(guān)。4個(gè)葡萄品種釀制的醋及其酒醪清除DPPH自由基的能力都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于桃醋和蘋果醋，并且隨著加入量的增加，清除率也隨之增加，呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。

2.4 不同品種的葡萄醋及其酒醪總多酚、總黃酮含量的比較

黃酮是一類在植物界中分布廣泛、具有多種生物活性的多酚類化合物，在人體內(nèi)可以清除游離自由基，具有抗衰老、預(yù)防心血管疾病和癌癥等功效[20]。植物多酚類物質(zhì)具有很好的抗氧化功能，一般來說總多酚含量越高，其抗氧化活性就越強(qiáng)[21]。不同品種的葡萄醋及其酒醪的總黃酮及總多酚含量的測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表 1 不同品種的葡萄醋及其酒醪中總黃酮和總多酚的含量Table 1 Total phenol and total flavonoid contents of vinegar and wine mash produced from different grape cultivars mg/L

從表1可見，葡萄酒醪及其醋的總黃酮和總多酚含量在品種之間有較大的差異。樣品總多酚含量排序?yàn)椋禾亠契玻咎亠祝揪薹宕祝揪薹寰契玻揪﹣喆祝揪﹣喚契玻久利惥契玻久利惔祝咎掖祝咎O果醋，總黃酮含量的高低排序與總多酚含量的排序一致。

Yang Jun[22]、Dávalos[23]等得出葡萄的抗氧化活性與酚類物質(zhì)的含量密切相關(guān)。為了驗(yàn)證葡萄醋及其酒醪的抗氧化活性是否也與總多酚、黃酮含量密切相關(guān)，故以總多酚、黃酮含量與實(shí)驗(yàn)樣品的還原能力， DPPH自由基的半清除率(IC50)及總抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示。

表 2 抗氧化活性與總多酚及其總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)(n=8)Table 2 Correlation coefficients between antioxidant activity and the contents of total phenol or total flavonoid

從表2可見，葡萄發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性與多酚類物質(zhì)含量有很強(qiáng)的相關(guān)性(P＜0.01)，多酚類化合物是葡萄醋及其酒醪中的主要抗氧化成分。

3 結(jié) 論

本研究初步評(píng)價(jià)了4個(gè)品種的葡萄釀制的葡萄醋及其酒醪的抗氧化活性。通過葡萄醋與桃醋和蘋果醋對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)品種的葡萄醋抗氧化活性均遠(yuǎn)高于桃醋和蘋果醋，說明葡萄醋有比較強(qiáng)的抗氧化活性。葡萄醋及其酒醪的抗氧化活性在品種間差異很大，藤稔葡萄的發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性最強(qiáng)，巨峰、京亞葡萄次之，美麗葡萄最弱；葡萄醋及其酒醪的抗氧化活性與總多酚和總黃酮含量有極顯著(P＜0.01)的相關(guān)關(guān)系。

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