甘油體系研究奶糖內(nèi)源性甲醛的生成機(jī)理

陳 梅，呂春華，朱曉雨，陳笑梅,*，莫衛(wèi)民

(1.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 杭州 310016)

甲醛具有較高的毒性，已被世界衛(wèi)生組織(WHO)確定為致癌和致畸的物質(zhì)。近年來(lái)，“大白兔奶糖含甲醛”、食品中違禁使用吊白塊和水發(fā)產(chǎn)品用甲醛浸泡等事件頻繁發(fā)生，已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。大量研究[1]表明甲醛可在動(dòng)植物體內(nèi)自然產(chǎn)生，是一種自身的代謝產(chǎn)物，是某些氨基酸生物合成所必需的前提物質(zhì)。Yamagata等[2]發(fā)現(xiàn)甲醛可在一些蔬菜、水果、發(fā)酵制品中自然產(chǎn)生，Bianchi等[3]在水產(chǎn)中檢測(cè)到有較高本底含量的內(nèi)源性甲醛。張文德[4]發(fā)現(xiàn)食用菌類(lèi)、水產(chǎn)品、果蔬類(lèi)、糧食類(lèi)、乳制品等食品中均含有天然甲醛。馬永均等[5]調(diào)查表明，在66個(gè)水果樣品中，甲醛含量超過(guò)1.0mg/kg的有11個(gè)，1.0～0.5mg/kg的有22個(gè)，小于0.5mg/kg的有33個(gè)。水果(植物)呼吸作用使復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)在酶的作用下緩慢分解為簡(jiǎn)單有機(jī)物——醇類(lèi)、酮類(lèi)、醛類(lèi)以及CO2和水等，在細(xì)胞代謝的生化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生微量的甲醛。乳品中的甲醛來(lái)源于乳脂肪的酶類(lèi)反應(yīng)和氨基化合物等物質(zhì)的美拉德反應(yīng)，是復(fù)雜反應(yīng)過(guò)程中代謝或產(chǎn)生的中間產(chǎn)物[4]。各種乳制品中能測(cè)出包括甲醛在內(nèi)的多種羰基化合物，鮮牛乳中曾分離出甲醛、乙醛、丙醛、己醛、苯甲醛等物質(zhì)[4]，乳酸菌都有生產(chǎn)甲醛及乙醛的能力，例如，在蛋白質(zhì)分解酶的作用下，乳蛋白生成肽、氨基酸類(lèi)化合物在微生物的作用下脫去氨基后，可以轉(zhuǎn)變?yōu)槿?、酮、醇?lèi)，產(chǎn)生奶酪特有的風(fēng)味[6]。文獻(xiàn)[7-9]報(bào)道，食品中內(nèi)源性甲醛的生成也可能和其加工的工藝有關(guān)。

乳制品含有豐富的蛋白質(zhì)和還原糖，其主要蛋白——酪蛋白和乳清蛋白的賴(lài)氨酸殘基活性較強(qiáng)，易與乳糖發(fā)生美拉德反應(yīng)[10]。文獻(xiàn)[11]報(bào)道美拉德反應(yīng)原理為Amadori產(chǎn)物裂解產(chǎn)生羰基和α-二羰基化合物會(huì)繼續(xù)與氨基化合物反應(yīng)，使氨基化合物失去1分子CO2生成少1個(gè)碳原子的醛類(lèi)。馮大炎等[12]認(rèn)為面包烘烤時(shí)美拉德反應(yīng)和Strecker降解反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行產(chǎn)生了一些醛酮類(lèi)物質(zhì)，如甲醛、丙醛、異戊醛等。陳華[13]認(rèn)為相等量的甘氨酸和葡萄糖混合加熱100～150℃時(shí)產(chǎn)生的Strecker醛類(lèi)為甲醛。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)奶糖中的甲醛問(wèn)題，調(diào)查奶糖原料乳粉和糖類(lèi)中甲醛的本底含量及其高溫處理后甲醛含量的變化；找出乳粉是奶糖內(nèi)源性甲醛形成的關(guān)鍵物質(zhì)，進(jìn)一步分析乳粉高溫體系甲醛生成的特性；模擬奶糖熬糖工藝，考察不同糖類(lèi)的添加對(duì)乳粉高溫處理甲醛生成的影響；通過(guò)對(duì)乳粉主要成分分析進(jìn)一步找出乳粉中甲醛形成的關(guān)鍵物質(zhì)并驗(yàn)證其高溫反應(yīng)特性，以期闡明奶糖中內(nèi)源性甲醛生成的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大白兔牌奶糖為市售；伊利、光明、雅士利等品牌乳粉(蛋白質(zhì)含量18.5%～40.0%、乳糖含量31.5%～54.8%)為市售。

甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/mL) 環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所；2,4-二硝基苯肼(DNPH，優(yōu)級(jí)純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酪蛋白、乳清蛋白 上海源聚生物科技有限公司；乳糖 上海伯奧生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、果糖 美國(guó)Acros Organics公司；甘油 江蘇強(qiáng)盛化工有限公司；乙腈、甲醇(色譜純) 美國(guó)Tedia公司；所有試劑均為分析純，所用水為去離子水。

配制的DNPH溶液：稱(chēng)取DNPH 0.50g，用乙腈溶解并定容至250mL，質(zhì)量濃度為2g/L。pH5磷酸鹽緩沖液：稱(chēng)取13.6g KH2PO4，加入500mL水中，混勻后用NaOH溶液調(diào)至pH5.0。配制的衍生液：將DNPH溶液與pH5.0磷酸鹽緩沖液，按體積比1：1混合。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀(配G1315B二極管陣列檢測(cè)器) 美國(guó)Agilent公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫振蕩器 太倉(cāng)市科教器材廠；高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；電子天平(感量0.0001g) 瑞士Mettler Toledo公司；旋渦混合器 太倉(cāng)華利達(dá)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備公司。

1.3 方法

1.3.1 甲醛生成模擬與定量

稱(chēng)取2.25g甘油于8mL螺紋口樣品瓶中，加入0.25g樣品(乳粉、酪蛋白、乳清蛋白)，再按一定比例加入一定量的糖(糖添加實(shí)驗(yàn)、乳粉內(nèi)源性甲醛生成因子探究實(shí)驗(yàn))，旋緊螺帽。于80℃水浴中靜置10min，渦旋混勻。置于烘箱中120℃加熱60min。

1.3.2 甲醛生成特性

參考1.3.1節(jié)準(zhǔn)備樣品。在相同加熱時(shí)間條件下，將完全混勻的樣品分別置于60、80、100、120℃加熱60min；相同加熱溫度條件下，將全混勻的樣品置于120℃烘箱中分別加熱20、40、60、80、100min。

1.3.3 甲醛的測(cè)定

1.3.3.1 甲醛的衍生反應(yīng)

常溫條件下，稱(chēng)取2.00g樣品于50mL塑料離心管中，加入20mL衍生液。高溫處理后的樣品，用20mL衍生液將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至50mL塑料離心管中。旋緊管塞，渦旋混勻。置于60℃恒溫振蕩器中，150r/min振搖提取60min，取出冷卻至室溫。

1.3.3.2 凈化

將1.3.3.1節(jié)的提取液，以不低于4000r/min離心5min。若離心后溶液澄清，過(guò)0.45μm微孔濾膜，濾液供HPLC法測(cè)定。若離心后溶液渾濁或分層，在提取液中加入8g硫酸銨，混勻，以不低于4000r/min離心5min。移取上清液于20mL刻度試管中，下層溶液用10mL乙腈重復(fù)萃取1次，合并上清液，用乙腈定容至20.0mL，混勻后過(guò)0.45μm微孔濾膜，濾液供HPLC法測(cè)定。

1.3.4 甲醛衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

[14]，分別移取適量的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，于10mL具塞刻度試管中，用衍生液定容至10mL。蓋上塞后混勻，于60℃水浴中加熱60min，取出冷卻至室溫。溶液過(guò)0.45μm微孔濾膜，濾液供HPLC法測(cè)定。高溫體系甲醛的測(cè)定實(shí)驗(yàn)，甲醛標(biāo)準(zhǔn)的衍生體系中需分別加甘油0.90g，參見(jiàn)上述操作制備。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Agilent色譜柱C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(60：40，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫30℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)：350nm；進(jìn)樣量：10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫處理中甲醛的收集及檢測(cè)方法的研究

2.1.1 高溫處理中甲醛收集方法的研究

奶糖熬糖工藝在120℃，為研究在此溫度條件下奶糖及其各成分甲醛的含量變化，首先需研究這些物質(zhì)在高溫處理時(shí)甲醛的收集方法。因甲醛是揮發(fā)性物質(zhì)，奶糖及其各成分經(jīng)高溫處理產(chǎn)生的甲醛，若沒(méi)有收集直接冷卻測(cè)定，甲醛將部分揮發(fā)。本實(shí)驗(yàn)比較了甘油體系和水體系對(duì)奶糖經(jīng)高溫處理產(chǎn)生的甲醛的收集效果，結(jié)果表明，甘油體系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較好。甘油沸點(diǎn)較高，120℃時(shí)仍為液態(tài)，反應(yīng)體系的均勻性和熱傳導(dǎo)性較好；水沸點(diǎn)為100℃，120℃時(shí)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，揮發(fā)帶走部分甲醛，反應(yīng)體系均勻性不佳，對(duì)實(shí)驗(yàn)裝置的密封性要求高，而且存在因壓力過(guò)大爆炸的風(fēng)險(xiǎn)。

2.1.2 甘油體系中甲醛檢測(cè)方法的研究

參考文獻(xiàn)[15]，衍生液提取法能夠有效提取樣品中游離態(tài)和可逆結(jié)合態(tài)的甲醛，同時(shí)避免樣品中內(nèi)源性甲醛的形成，是一種較合理的前處理方法。文獻(xiàn)中甲醛的衍生反應(yīng)在水-乙腈(1：1，V/V)的體系中進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)甲醛的衍生體系中含有甘油，需考察甘油對(duì)衍生反應(yīng)的影響。在甲醛衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入一定量的甘油，通過(guò)比較衍生產(chǎn)物的峰面積考察甘油對(duì)甲醛衍生反應(yīng)的影響，結(jié)果表明：甘油含量≤2mL時(shí)，甲醛衍生物的峰面積與不加甘油時(shí)相比，誤差在5%以內(nèi)。此時(shí)，甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2～10.0m/kg的線性方程為y=345.8x+20.33，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99990。甘油含量＞2mL，試劑空白偏高，線性關(guān)系不佳。

2.2 高溫處理對(duì)奶糖主要成分糖類(lèi)甲醛生成的影響

圖 1 奶糖經(jīng)高溫處理后甲醛含量的變化Fig.1 Change of formaldehyde content in different carbohydrates treated at 120 ℃ for 60 min

考察奶糖的主要原料糖類(lèi)經(jīng)高溫處理后甲醛含量的變化，以探究奶糖中內(nèi)源性甲醛生成的主要原因。見(jiàn)圖1。糖類(lèi)的甲醛本底值均較低，高溫處理后4種糖的甲醛含量略有增加，其中葡萄糖中的甲醛含量變化最大，由0.46mg/kg增加到5.65mg/kg。糖類(lèi)中甲醛略有增加，可能是因?yàn)樘穷?lèi)物質(zhì)高溫時(shí)分解產(chǎn)生小分子質(zhì)量代謝產(chǎn)物甲醛[16]。

2.3 高溫處理對(duì)奶糖原料乳粉甲醛生成的影響

如圖2所示，6種乳粉的甲醛本底值為0.58～2.97mg/kg，高溫處理后甲醛含量增加至12.6～23.7mg/kg。6種乳粉中A、B、C、D、E為成人乳粉，F(xiàn)為嬰兒乳粉，表明乳粉高溫處理后甲醛含量顯著增加具有普遍性。A、B為同一品牌的脫脂乳粉和全脂乳粉，高溫處理后甲醛含量分別為15.9、12.6mg/kg，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，表明乳粉中脂肪不是影響高溫甲醛生成的主要因素。

圖 2 乳粉經(jīng)高溫處理后甲醛含量的變化Fig.2 Change of formaldehyde content in different milk powder treated at 120 ℃ for 60 min

2.4 乳粉高溫體系甲醛生成的影響因素

2.4.1 加熱溫度和時(shí)間對(duì)乳粉甲醛生成的影響

圖 3 乳粉-甘油體系甲醛生成的溫度曲線(a)和時(shí)間曲線(b)Fig.3 Temperature curve (a) and time curve (b) for the generation of formaldehyde in milk powder-glycerin system

由圖3a可知，隨著加熱溫度升高甲醛含量增加。溫度高于80℃時(shí)，甲醛生成顯著(P＜0.05)；加熱溫度為100℃和120℃時(shí)，甲醛含量分別是本底值的16.9倍和34.6倍。由圖3b可知，加熱時(shí)間為20～60min時(shí)，甲醛生成量隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增加(P＜0.05)，至60min時(shí)，甲醛的生成量達(dá)到最大；在60～100min之間甲醛生成速率變緩。馬志玲等[10]研究表明熱處理的強(qiáng)度越大，乳糖與賴(lài)氨酸殘基的結(jié)合越強(qiáng)烈，美拉德反應(yīng)越容易進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，溫度大于80℃，加熱時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)生的甲醛含量越多，超過(guò)60min后，甲醛含量基本不變。因此選擇乳粉-甘油體系120℃高溫處理60min作為乳粉高溫體系處理?xiàng)l件。

2.4.2 糖類(lèi)添加對(duì)乳粉高溫處理甲醛生成的影響

由圖4可知，隨著乳糖、葡萄糖、果糖量增加，甲醛生成量隨之增大；其中葡萄糖的添加影響最顯著(P＜0.05)，甲醛的最高生成量為182.5mg/kg，果糖和乳糖次之，甲醛的最高生成量分別為45.9、31.9mg/kg，蔗糖添加對(duì)甲醛生成影響不明顯。4種糖添加對(duì)乳粉高溫處理甲醛生成影響的順序?yàn)槠咸烟牵竟牵救樘牵菊崽牵@與Mauron[17]的研究結(jié)果一致，即美拉德反應(yīng)的難易順序?yàn)槲逄既┨牵炯喝┨牵炯和牵倦p糖。蔗糖、乳糖為雙糖，還原性較弱，反應(yīng)活性小于單糖。吳惠玲等[18]的研究表明，蔗糖是非還原糖，不含游離的羰基，沒(méi)有顯示出與氨基酸的反應(yīng)活性。因此添加蔗糖不會(huì)導(dǎo)致乳粉熱處理甲醛含量的升高。葡萄糖為醛糖，果糖為酮糖，醛糖的末端基團(tuán)位阻效應(yīng)小，更易于氨基化合物反應(yīng)，因此葡萄糖的反應(yīng)活性大于果糖的反應(yīng)活性[16]。

2.5 乳粉內(nèi)源性甲醛生成主要因子的探究

圖 5 酪蛋白(乳清蛋白)-乳糖-甘油體系高溫甲醛的生成Fig.5 The generation of formaldehyde in casein (whey protein)-lactoseglycerin system treated at 120 ℃ for 60 min

美拉德反應(yīng)主要是羰基化合物和氨基化合物間的反應(yīng)。牛乳中90%以上的蛋白質(zhì)為酪蛋白和乳清蛋白，且這兩種蛋白的賴(lài)氨酸殘基都有很高的反應(yīng)活性，較易與還原糖乳糖反應(yīng)[10,19]。如圖5所示，酪蛋白高溫甲醛的生成量隨著乳糖的添加增加較明顯，至質(zhì)量比為1：5時(shí)甲醛的生成量最大。乳清蛋白高溫甲醛的生成不明顯。這是因?yàn)槔业鞍讓?duì)熱不敏感，而乳清蛋白熱處理時(shí)容易變性[20]。因此，乳清蛋白熱處理時(shí)賴(lài)氨酸殘基失活，影響美拉德反應(yīng)導(dǎo)致甲醛生成不明顯。

酪蛋白-乳糖-甘油體系在高溫條件下甲醛生成量的變化趨勢(shì)與乳粉-乳糖-甘油體系的趨勢(shì)一致，而且生成的甲醛量也相近，見(jiàn)圖4a，當(dāng)乳粉與乳糖1：1混合時(shí)，乳粉生成的甲醛量最高。因?qū)嶒?yàn)所用乳粉中酪蛋白含量為26.4%，乳糖含量為47.3%，乳粉與乳糖含量為1：1相當(dāng)于酪蛋白與乳糖的質(zhì)量比為1：5.6。這與圖5中酪蛋白與乳糖比為1：5時(shí)，生成的甲醛量最多相吻合。當(dāng)乳粉與乳糖質(zhì)量比為1：1混合時(shí)，乳粉甲醛的生成量為31.9mg/kg，酪蛋白在乳粉中的含量為26.4%，相當(dāng)于每千克酪蛋白產(chǎn)生的甲醛量為120.8mg。這與圖5中酪蛋白與乳糖質(zhì)量比為1：5時(shí)，酪蛋白產(chǎn)生甲醛的生成量為130.4mg/kg相近。因此，乳粉內(nèi)源性甲醛的生成主要是由酪蛋白和乳糖發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的。

2.6 酪蛋白-乳糖-甘油模擬體系高溫甲醛生成的特點(diǎn)

考察加熱溫度和時(shí)間對(duì)酪蛋白-乳糖-甘油體系(酪蛋白、乳糖添加質(zhì)量比為1：3)甲醛生成的影響，見(jiàn)圖6。該體系低于80℃處理時(shí)甲醛的生成不明顯，高于80℃處理時(shí)甲醛的生成開(kāi)始顯著增加，120℃時(shí)甲醛含量最高。這與圖3a乳粉-甘油體系高溫甲醛生成的趨勢(shì)相似。體系在加熱20～60min時(shí)，甲醛的生成隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，到60min時(shí)甲醛的生成最明顯，60min后甲醛的生成量基本不變。與圖3b乳粉-甘油體系高溫甲醛生成的趨勢(shì)相似。因此，酪蛋白-乳糖-甘油體系高溫甲醛的消長(zhǎng)趨勢(shì)與乳粉-甘油體系高溫甲醛的消長(zhǎng)趨勢(shì)相似。

圖 6 酪蛋白-乳糖-甘油體系甲醛生成的溫度曲線(a)和時(shí)間曲線(b)Fig.6 Temperature curve (a) and time curve (b) of the generation of formaldehyde in casein-lactose-glycerin system

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了甘油體系收集樣品經(jīng)高溫處理生成甲醛的方法及收集后甲醛的檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)奶糖主要成分乳粉和糖類(lèi)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)乳粉是奶糖中甲醛生成的主要物質(zhì)，在分析乳粉主要成分蛋白和糖類(lèi)時(shí)發(fā)現(xiàn)酪蛋白和乳糖的美拉德反應(yīng)是奶糖甲醛生成的根本原因。乳清蛋白對(duì)甲醛的生成基本無(wú)影響，不同糖類(lèi)的影響也不同，依次為葡萄糖＞果糖＞乳糖＞蔗糖。

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