細胞凋亡清除障礙及瓣狀內切核酸酶1基因變異在狼瘡性腎炎發(fā)病機制中的作用

曹 平 趙 玉 張麗麗 沈 婕 鄧蓉蓉 宋志霞 趙俊麗 王 靜

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種多系統(tǒng)損傷的自身免疫性疾病，狼瘡性腎炎(LN)是其最嚴重的并發(fā)癥之一，累積發(fā)病率亞洲人群最高(55%)，其中23%約10年后進展至終末期腎病［1-3］。LN發(fā)病可能與遺傳、激素、感染、環(huán)境等因素有關。近年研究表明，機體的遺傳因素在SLE的易感性發(fā)病方面處于主導地位，且是多基因協(xié)調控制［4，5］，但有關 SLE并發(fā)LN的機制仍不明確。Kalaaji等［6］研究顯示，SLE患者細胞凋亡異常介導的核小體與抗核小體抗體間的作用是LN發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。但是，目前對LN凋亡清除機制障礙的始動原因仍不明確。由于細胞凋亡是多基因嚴格調控的過程，而LN又是多基因表達異常所致的自身免疫性疾病，因此，對LN發(fā)病過程中與細胞凋亡有關基因的研究，可望成為闡明LN發(fā)病機制的突破口。還有研究顯示瓣狀內切核酸酶1(Fen1)基因的單核苷酸多態(tài)性與SLE有關［7］，Fen1 基因位于人類染色體 11q12，長 1144 bp，含有一個外顯子，編碼380個氨基酸，構成Fen1核酸酶的一級結構，是一種結構特異性多功能核酸酶，在DNA的多條代謝途徑、維護染色體的穩(wěn)定及細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用［8］。該基因的變異與腫瘤及自身免疫性疾病有關［9，10］。Zheng 等［10］通過對Fen1基因E160D點突變模型小鼠研究發(fā)現，該模型小鼠細胞凋亡的清除機制發(fā)生障礙，導致凋亡產物在腎臟及肺組織中堆積增多，誘發(fā)自身免疫反應，造成腎臟免疫性損傷。我們推測在以細胞凋亡異常為主導作用的LN發(fā)病機制中，Fen1基因異?？赡馨l(fā)揮了很重要的作用，為此，我們檢測LN患者腎臟組織細胞凋亡情況和Fen1基因61563142～61563342目的片段，確定其突變及與LN的相關性。

對象和方法

對象 為2009年10月至2012年5月期間蘭州大學第二醫(yī)院腎內科住院確診LN患者50例，(其中女性45例，男性5例，均為漢族，年齡13～50歲，平均年齡33.48歲)，診斷標準符合1997年美國風濕病學會修訂的SLE分類診斷標準的基礎上出現以下四條中的任意一條且排除其他導致腎炎因素：(1)24h尿蛋白定量＞0.5 g/d；(2)尿中紅細胞或白細胞＞5個/HP；(3)血清肌酐(SCr)＞133 μmol/L；(4)腎活檢明確診斷。

健康組選自2009年7月在本院體檢中心進行健康檢查的漢族健康者25例(女性14例，男性11例)，年齡21～43歲(平均29.6歲)；胃癌組為2010年10月至2012年5月期間蘭州大學第二醫(yī)院普外科住院漢族患者20例(女性11例，男性9例)，年齡45～70歲(平均52歲)，所有患者均經胃鏡及病理檢查確診而入院接受手術治療。30例LN患者腎穿刺組織來自于蘭州大學基礎醫(yī)學院病理研究所標本庫。

主要儀器及試劑 Bio-Rad S1000 PCR儀，JY200 電泳儀，ImageQuant-300，DNA Marker B，柱式全血基因組抽提試劑盒，PCR試劑盒(美國Promega)，凱基TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒。

研究方法

細胞凋亡檢測 按凱基TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作：(1)石蠟切片按常規(guī)方法進行脫蠟及水合；(2)切片浸入1×PBS漂洗三次，5 min/次；(3)配制1%Triton X～100通透液；(4)切片浸入通透液中，室溫促滲3～5 min；(5)切片浸入1 ×PBS漂洗三次，5 min/次；(6)配制3%H2O2封閉液；(7)切片浸入封閉液，室溫(15℃～25℃)封閉10 min；(8)切片浸入1×PBS漂洗三次，5 min/次；(9)配制Proteinase K工作液；(10)每個樣本上滴加100 μl Proteinase K 工作液，37℃反應 30 min；(11)切片浸入1×PBS漂洗三次，每次5 min/次；(12)配制100 μl含3000 U 的DNaseⅠ反應液；(13)在一張樣本切片上滴加100 μl上述 DNaseⅠ反應液，室溫～37℃處理10～30 min；(14)制好的陽性片浸入1×PBS漂洗三次，每次5 min/次；(15)配制 TdT酶反應液；(16)樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴加50 μl TdT酶反應液，加蓋玻片放入溫盒中，37℃避光反應60 min(陰性對照樣本不加TdT酶反應液)；(17)反應后的樣本片浸入1×PBS漂洗三次，5 min/次；(18)配制Streptavidin～HRP工作液；(19)樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴50 μl Streptavidin～HRP工作液，加蓋玻片放入溫盒中，37℃避光反應30 min；(20)反應后的樣本片浸入1×PBS漂洗三次，5 min/次；(21)配制DAB工作液；(22)樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴加50 μl DAB工作液，室溫顯色反應30s～5 min；(23)顯色后的樣本片浸入1×PBS漂洗三次，5 min/次，光鏡下觀察、拍照；(24)蘇木素、甲基綠等常規(guī)染液復染。

計算細胞凋亡指數 切片隨機選5個視野，每個視野視察100個細胞，計算凋亡指數?；仡櫺苑治瞿I活檢患者的病例資料，根據ISN/RPS 2003狼瘡性腎炎分型標準進行病理分型，應用SLE活動度評分(SLEDAI)2000判斷其疾病活動度，并進行相關性分析。

標本采集 取受檢者清晨空腹外周靜脈血2 ml至EDTA抗凝管，輕輕混勻，-80℃保存，待統(tǒng)一提取基因組DNA。

基因組DNA的制備 標本解凍，提取基因組DNA，步驟如下：(1)在500 μl血液中加入800 μl的TBP Buffer用1 ml的 Tip頭輕輕吹打使其混勻，4000 r/min離心3min，棄上清；(2)重復上述步驟一次，若血樣仍顯紅色則需再次重復上述步驟，當沉淀為無色或淡紅色后用200 μl TE懸浮即可；(3)在準備好的200 μl樣品中加入500 μl TBM Buffer，混勻；再加入4 μl Proteinase K，混勻，55.0℃保溫 10～20 min；(4)加入260 μl無水乙醇，混勻，用 1 ml Tip 頭將樣品全部轉移到套放于2 ml Collection Tube的UNIQ-10柱中；(5)臺式離心機8000 r/min，室溫離心1 min；(6)取下UNIQ-10柱，棄去Collection Tube中的廢液。將柱子放回同一根Collection Tube中，加入500 μl Wash Solution，10 000 r/min，室溫離心2 min；(7)重復步驟(6)一次；(8)取下柱，棄去的全部廢液。將柱子放回同一根 Collection Tube中，10 000 r/min，室溫離心15s，以除去殘留的 Wash Solutions；(9)將UNIQ-10柱放入新無菌的1.5 ml離心管中，在柱膜中央加入40 μl Elution Buffer，室溫放置2 min；(10)10 000 r/min室溫離心1 min。離心管中的液體即為基因組DNA，-20℃保存。

引物設計 Fen1基因序列來自GenBank(gi|224589802)。引物采用olige 7.0軟件設計，引物序列：(1)上游引物-TCAGGCGAGCTGGCCAAACG，下游引物-GTCGCCGCACGATCTCCTCG；(2)上游引物-GCGGGCTGAGGCAGAGAAGC，下游引物-CCAGCCTTCACCAGGGCAGC，設計后由北京華大基因公司合成。

PCR反應 Fen1基因PCR擴增產物為201 bp，PCR試劑盒購于Promega公司，50 μl PCR反應體系及條件見表1。

表1 50 μl PCR反應體系及條件

PCR產物瓊脂糖凝膠電泳鑒定 (1)制備膠，稱取0.3g瓊脂糖凝膠倒入燒瓶，加入30 ml 0.5×TBE緩沖液，配制成濃度為1.0%的凝膠，加熱約3 min；(2)灌膠，將凝膠冷卻至60℃左右，加入0.2 μg/ml EB 1 μl，搖勻后緩慢倒入制膠模具，凝膠厚度為3～5 mm，迅速插入梳子，避免產生氣泡，置常溫下凝固；(3)待凝膠完全凝固后，移去梳子，將凝膠置于電泳槽；(4)加入0.5×TBE緩沖液至電泳槽，液面高出凝膠表面約1 mm；(5)加樣孔中加入5 μl PCR擴增產物及50 bp DNA Ladder Marker對照；(6)凝膠電泳，電壓80V，電泳30 min；(7)ImageQuant-300凝膠成像系統(tǒng)觀察DNA條帶，拍照。

序列測定 取目的條帶亮、無雜帶的PCR產物和上下游引物送至北京華大基因公司進行純化測序。

在測序結果中尋找突變位點 通過Chromas軟件讀出測序結果，在基因數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中與 gi|224589802：61563142～61563342進行比較，搜索突變位點。

統(tǒng)計學分析 用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，SLE活動指數2000(SLEDAI 2000)與腎臟組織細胞凋亡指數(AI)進行相關分析，基因突變頻率及基因型分布在LN患者、胃癌患者、健康者間的比較采用χ2檢驗。

結 果

30例LN患者中，細胞凋亡檢測全部陽性，凋亡細胞呈散在分布(圖1)，LN病理分型與AI、SLEDAI 2000的關系見表2。相關性分析顯示，SLEDAI 2000與 AI正相關，r=0.39，P=0.032(圖 2)。

圖1 LN患者腎臟組織細胞凋亡檢測圖；A圖箭頭所示凋亡細胞核為棕褐色；B圖為陰性對照；C圖為陽性對照(TUNEL，×200)

表2 狼瘡性腎炎病理類型與AI、SLEDAI關系

圖2 細胞凋亡指數(AI)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動指數2000 度評分(SLEDAI，2000)呈正相關

目的基因經PCR后瓊脂糖凝膠電泳凝膠成像見1～3條帶為LN患者，4、5條帶為胃癌患者，6、7健康(圖3)。擴增后的目的基因進行測序，并對測序結果與基因數據庫中人Fen1基因進行比較后，LN患者、胃癌、健康者 Fen1基因存在 C/—(+61563189)、A/T(+61563198)、A/—(+61563-204)，G/T(+61563303)、T/C(+61563304)位點突變(基因測序結果見圖 4～6(A)，Blast結果見圖4～6(B)，上述各突變位點統(tǒng)計分析(P＞0.05)，未發(fā)現有統(tǒng)計學意義的堿基變異(表3，4)。

圖3 瓣狀內切核酸酶1目的基因61563142～61563342片段電泳凝脈成像

圖4 A：狼瘡性腎炎(LN)患者目的基因測序圖譜，B：LN患者目的基因Blast結果

圖5 A：胃癌患者目的基因測序圖譜；B：胃癌患者目的基因Blast結果

圖6 A：健康人群目的基因測序圖譜；B：健康人群目的基因Blast結果

表3 狼瘡性腎炎(LN)組與胃癌組堿基變異統(tǒng)計分析結果

表4 狼瘡性腎炎(LN)組與健康組堿基變異統(tǒng)計分析結果

討 論

目前應用糖皮質激素和免疫抑制劑聯合治療可緩解多數LN患者病情，但仍有部分患者對傳統(tǒng)的免疫抑制劑治療無效或效果差。隨著對LN發(fā)病機制的深入研究，針對發(fā)病機制中某一環(huán)節(jié)或影響發(fā)病及疾病進展的關鍵分子進行選擇性靶向治療，已成為LN治療的新方向。細胞凋亡清除異常，形成自身抗原，誘發(fā)機體產生抗體，導致免疫系統(tǒng)紊亂是LN 發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［6，11，12］，我們對 30 例 LN患者的腎組織標本進行凋亡檢測，所有患者腎組織凋亡檢測均陽性，凋亡細胞散在分布腎小球及腎小管，根據ISN/RPS 2003制定的病理分型標準，30例LN患者中以Ⅳ型最多(40.00%)，其次Ⅱ型(26.67%)，Ⅲ型 16.67%，Ⅴ型 13.33%，Ⅵ 型3.33%，無Ⅰ型病變患者?；仡櫡治雠R床資料進行SLEDAI 2000評分發(fā)現，SLEDAI與 AI呈正相關。上述結果表明LN患者存在細胞凋亡清除障礙，當大量的凋亡小體在腎組織中滯留時，導致凋亡物質“進出”平衡失調，造成凋亡物質的累積，未及時清除的凋亡細胞質膜破裂后釋放出大量的自身內容物，包括核小體碎片、DNA、組蛋白成分等凋亡物質，引發(fā)炎癥反應和自身免疫，成為維持自身免疫應答的反復性的刺激源，不斷攻擊已經致敏的免疫系統(tǒng)，破壞其對自身抗原的中樞和外周耐受，出現組織器官受損，進而引發(fā)炎癥和免疫應答，促使LN的發(fā)生、發(fā)展［13，14］。本研究發(fā)現，凋亡細胞的數量越多，SLE病情越活躍，說明在LN進程中，凋亡產物累積越多，造成的腎臟損害越嚴重，進一步證明細胞凋亡障礙在其疾病進展及惡化中的作用。

探尋LN患者細胞凋亡障礙的機制，有效地對其進行扳正和修復，才能獲得LN根本的治療效果，而對LN凋亡障礙機制的探討，更多應著眼于其分子病因學的研究。基因組穩(wěn)定性的維持，及DNA的復制和修復，都需要一系列的核酸內切酶和外切酶的參與，Fen1就是其中之一［8］，Fen1基因E160D點突變影響Fen1核酸酶功能，致使細胞凋亡過程中核小體DNA鏈不能有效分解，當大量的凋亡小體在機體組織中滯留時，作為具有免疫原性的靶抗原，構成危險信號對免疫系統(tǒng)造成威脅，誘發(fā)腫瘤、自身免疫性疾病等［7，10］。

目前Fen1基因和人類疾病的研究多見于腫瘤領域［9，10］，在SLE中鮮見報道。我們曾對43例 LN患者和26例健康者的外周血標本，采用全血基因組DNA柱式試劑盒提取DNA，直接PCR方法擴增Fen1基因外顯子包含E160D位點的目的片段，擴增后PCR產物應用基因測序方法檢測Fenl基因序列，并對測序結果與基因數據庫中Fenl基因進行比較結果發(fā)現，LN患者正向測序中存在946位堿基C缺失突變(未發(fā)表資料)。

本研究進一步收集50例LN患者，25例健康者，20例胃癌患者的外周血標本，對Fen1基因外顯子包含E160D位點的61563142～61563342目的片段進行擴增，擴增后的目的基因進行測序，比較LN患者、胃癌、健康者Fen1基因突變情況。結果顯示，三組Fen1基因外顯子61563142～61563342目的片段未發(fā)現有統(tǒng)計學意義的堿基變異，E160D位點未變異，可能原因為樣本量小，人群分布存在差異等，但由于試驗樣本量有限，而且未對Fen1基因全序列進行測序，Fen1基因在LN發(fā)病及進展中的意義還需要擴大樣本量進行進一步研究。

對Fen1基因進行全序列研究可能對其在LN發(fā)病機制中的作用更有價值，Fen1基因異常在LN動物模型中的研究也為該基因在LN發(fā)病機制中的作用提供很大的價值，我們的進一步研究將圍繞LN細胞凋亡異常，對大樣本的LN人群進行Fen1基因全基因組關聯研究，同時在LN動物模型中對Fen1基因的異常在LN細胞凋亡過程及疾病發(fā)生發(fā)展進程中的作用做進一步探索。

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