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    箭齒鰈肌肉分離蛋白功能特性的研究

    2013-08-07 14:05:02閆瑞霞劉俊榮馬永生梁姍姍李芳
    大連海洋大學(xué)學(xué)報 2013年5期
    關(guān)鍵詞:溶解性魚肉乳化

    閆瑞霞,劉俊榮,馬永生,梁姍姍,李芳

    (大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連116023)

    箭齒鰈肌肉分離蛋白功能特性的研究

    閆瑞霞,劉俊榮,馬永生,梁姍姍,李芳

    (大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連116023)

    以箭齒鰈Atheresthes stomias為原料,對其肌肉蛋白進行分離提取,并研究了蛋白質(zhì)的功能特性。采用pH調(diào)節(jié)方法,分別提取得到酸分離蛋白和堿分離蛋白,同時以原料肌肉蛋白和傳統(tǒng)漂洗魚糜為對照。利用SDS-PAGE法對分離蛋白的分子量分布進行分析,結(jié)果表明,堿分離蛋白中肌原纖維蛋白分子保持完整,而酸分離蛋白有明顯的肌球蛋白重鏈和肌動蛋白降解現(xiàn)象產(chǎn)生。對分離蛋白的功能特性包括溶解性、持水性、持油性、乳化性、起泡性、凝膠特性進行分析,結(jié)果表明,與原料魚肉和漂洗魚糜相比,酸分離蛋白和堿分離蛋白均表現(xiàn)出明顯的乳化性能,堿分離蛋白具有最佳的凝膠強度,而在其他功能特性方面,分離蛋白則沒有明顯的優(yōu)勢。對分離蛋白的基本理化特性進行分析,結(jié)果表明,分離蛋白的脫脂效果比漂洗魚糜更加明顯,且與原料魚肉 (13.00%)相比,堿分離蛋白脂肪含量最少 (1.23%),其次是酸分離蛋白 (1.96%)和漂洗魚糜 (3.30%)。從分離前后的色度變化可以看出,分離蛋白的白度明顯優(yōu)于漂洗魚糜和原料魚肉。研究表明,箭齒鰈分離蛋白在食品加工中作為一種蛋白配料具有一定潛力。

    箭齒鰈;分離魚蛋白;蛋白質(zhì)功能特性

    箭齒鰈Atheresthes stomias是一種典型的低值白肉魚,主要分布于阿拉斯加灣和白令海,其可利用生物量約為57.6萬t,資源量十分豐富[1]。箭齒鰈在加熱過程中常有肌肉軟化成糊狀的現(xiàn)象,因此,其商業(yè)價值一直未能被充分挖掘利用。關(guān)于箭齒鰈肌肉加熱過程中軟化的機理有很多研究報道,大致可歸納為兩方面的原因:其一,源于魚體內(nèi)的組織蛋白酶L,它是一種半胱氨酸蛋白酶,其最適溫度約為60℃,因此,在加熱過程中很容易被激活致使肌肉蛋白自溶降解,從而失去食用價值[2];其二,箭齒鰈、太平洋牙鱈Merluccius productus、秘魯無須鱈Merluccius gayi peruanus等肌肉中均含有黏孢子蟲Kudoa thyrstis,這種寄生蟲能夠分泌致使肌肉降解的蛋白酶,從而使這些魚類發(fā)生肌肉加熱軟化現(xiàn)象[3-6]。關(guān)于如何通過抑制蛋白酶活性使箭齒鰈肌肉加熱固化有不少研究[7-8]。本研究中,作者以箭齒鰈肌肉為原料,利用pH調(diào)節(jié)法從箭齒鰈肌肉中提取分離蛋白,并對該分離蛋白的功能特性進行了系統(tǒng)研究,旨在開發(fā)新型功能性分離蛋白,以嘗試開發(fā)高附加值箭齒鰈加工產(chǎn)品的新途徑。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    進口冷凍箭齒鰈原料由大連融達海產(chǎn)公司提供;金龍魚大豆油由嘉里糧油 (營口)有限公司生產(chǎn);牛血清蛋白為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。所有化學(xué)試劑均為分析純。

    Sartorius普及型pH計 (PB-10)為賽多利斯科學(xué)儀器 (北京)有限公司產(chǎn)品;GL-21M高速冷凍離心機為湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品;721型分光光度計為上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品;BYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀為北京市六一儀器廠產(chǎn)品;色彩色差儀CR-410為柯尼卡美能達投資有限公司產(chǎn)品;TMS-Pro質(zhì)構(gòu)分析儀為美國Food Technology Corporation公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 分離蛋白的制備 取出冷凍保存的箭齒鰈魚片,于室溫下解凍,至半解凍時切碎,稱取200 g碎魚肉與去離子水按質(zhì)量比為1∶10混合后均質(zhì)2 min得到肌肉勻漿,整個處理過程中溫度控制在4℃以下。將肌肉勻漿分成兩份,一份用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為1.5,另一份用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值為12.0,然后在4℃下以9 000 r/min離心20 min,并采用4層紗布過濾上清液,以去除上層脂肪層,即得到酸溶解蛋白和堿溶解蛋白。最后用2 mol/L NaOH或2 mol/L HCl調(diào)節(jié)上述溶解蛋白的pH值到等電點 (pH 5.5),并在4℃下以9 000 r/min離心20 min,分別得到酸分離蛋白(Acid protein isolate,AcPI)和堿分離蛋白 (Alkali protein isolate,AlPI)。

    采用傳統(tǒng)冷凍魚糜技術(shù),制備漂洗魚糜,作為對照。取冷凍保存的箭齒鰈魚片,于室溫下解凍,至半解凍時切碎,稱取碎魚肉100 g,與去離子水按質(zhì)量比為1∶4混合,攪拌3 min后放置15 min,然后使用4層紗布過濾,重復(fù)上述步驟兩次,第3次用2 g/L的氯化鈉溶液清洗脫水,整個處理過程中溫度控制在4℃以下,即得到漂洗魚糜。

    1.2.2 分析測試 1)蛋白質(zhì)的電泳分析。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),定性分析箭齒鰈肌肉分離蛋白的蛋白質(zhì)組成。分析樣品包括箭齒鰈肌肉蛋白、酸分離蛋白和堿分離蛋白。樣品與4×SDS緩沖液按體積比為3∶1混合后加入占總體積5%的β-巰基乙醇,在95℃下水浴10 min,用12%的分離膠、5%的濃縮膠配制膠板,用考馬斯亮藍R250染色,脫色。

    2)蛋白質(zhì)功能特性的檢測。箭齒鰈分離蛋白的功能特性主要包括溶解性、持水性、持油性、乳化性、起泡性和凝膠性。

    ①蛋白質(zhì)的溶解性。準(zhǔn)確稱取10 mg蛋白質(zhì)樣品于10 mL離心管中,加入5 mL離子強度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的氯化鈉溶液,使樣品的蛋白質(zhì)濃度為2 mg/mL。將溶液在常溫下使用振蕩器緩慢振蕩1 h,然后以3 000 r/min離心15 min。使用雙縮脲法測定上清液中蛋白質(zhì)的濃度[9-10]。

    ②蛋白質(zhì)的持水性。根據(jù)Liu等[11]的方法進行測定,稱取一定量的樣品 (記為w,g)放入10 mL離心管 (離心管質(zhì)量記為w1,g)中,分多次加入一定體積的蒸餾水,在室溫下振蕩均勻后放置20 min,使其充分吸收,以3 000 r/min離心15 min,去除分離水,再次稱量離心管質(zhì)量 (w2, g),根據(jù)下式計算持水性:

    ③蛋白質(zhì)的持油性[11]。稱取一定量的樣品(記為w,g),置于10 mL離心管 (離心管質(zhì)量記為w1,g)中,加入5 mL大豆油,混勻1 min后,在室溫下靜置30 min,以3 000 r/min離心15 min,棄去上清液,再次稱量離心管質(zhì)量 (w2,g),根據(jù)下式計算吸油能力:

    ④蛋白質(zhì)的乳化性和乳化穩(wěn)定性[12]。采用濁度法進行測定,配制0.01 g/mL的蛋白液,取5 mL大豆油與15 mL蛋白液于均質(zhì)機中均質(zhì)2 min,分別于0、10min時從底部取50μL,用0.1%SDS溶液稀釋100倍后測定500 nm下的吸光值A(chǔ)0,根據(jù)下式計算乳化性 (EA):其中:EA為每克蛋白質(zhì)所形成的乳化微粒的表面積 (m2/g);dil為稀釋倍數(shù);A0為均質(zhì)后的乳化液在500 nm處的吸光值;φ為油相所占的比例,本試驗中油相占1/4;C為0.01 g/mL,即蛋白質(zhì)濃度。

    乳化穩(wěn)定性 (ES)的計算公式如下:式中:t為時間 (本試驗中為10 min);A10為乳化液在靜止10 min后的吸光值。

    ⑤蛋白質(zhì)的起泡性和起泡穩(wěn)定性[13]。取5 g蛋白質(zhì)溶于50 mL蒸餾水 (蒸餾水在容器中的高度記為H)中,使蛋白終濃度為0.1 g/mL,于均質(zhì)機中均質(zhì)2 min,迅速將泡沫和液體轉(zhuǎn)移至250 mL量筒中,記下0 min和30 min時的初始泡沫高度H0和終止高度H30,按下式計算起泡性和起泡穩(wěn)定性:

    ⑥蛋白的凝膠特性。分別稱取120~130 g酸分離蛋白、堿分離蛋白和漂洗魚糜,添加2.4~2.6 g的NaCl混合均勻,將糊狀物填充到直徑為43~45 mm的塑料腸衣中,置于90℃水浴中加熱30 min,然后用流水冷卻15 min,得到的凝膠置于冰箱 (4℃)中過夜。測定前,將樣品置于室溫下2 h,用質(zhì)構(gòu)儀 (直徑為6 mm的平底柱形探頭P/ 6)測定所得樣品的凝膠強度,每組平行測定3個樣品,樣品高度約為12 mm。

    3)一般化學(xué)組成的分析。原料魚肉、漂洗魚糜、酸分離蛋白和堿分離蛋白的一般化學(xué)成分采用GB/T5009.3~6-2003進行測定,即采用直接干燥法測定水分含量;采用灼燒稱重法測定灰分含量;采用凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量;采用索氏抽提法測定粗脂肪含量。

    4)色度分析[14]。使用CR-410色彩色差儀測定肌肉蛋白及凝膠的色度,每個樣品測量3次,得出L*、a*和b*值,其中L*值表示產(chǎn)品的亮度,即從黑 (0)到白 (100)的顏色,a*值表示紅度(+)或綠度 (-),b*值表示黃度 (+)或藍度(-),并根據(jù)下式計算白度:

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用 SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析 (ANOVA),采用Student-Newman-Keuls法進行組間多重比較,顯著性水平設(shè)為0.05。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 分離蛋白的SDS-PAGE分析

    利用SDS-PAGE對酸法和堿法得到的兩種箭齒鰈肌肉分離蛋白進行分析比較,以箭齒鰈原料肌肉蛋白 (泳道1)作為對照 (圖1)。由圖1可見:酸法分離過程中 (泳道2),肌球蛋白重鏈 (相對分子量200 000附近)和肌動蛋白 (相對分子量42 000附近)均發(fā)生了明顯的降解現(xiàn)象,并出現(xiàn)了相對分子量分別為110 000~140 000和34 000~36 000兩條新條帶;而堿法分離過程中 (泳道3),肌原纖維蛋白分子保持完整,其原因可能與箭齒鰈內(nèi)源蛋白酶的性質(zhì)有關(guān)。已有研究證實,箭齒鰈肌肉中存在的半胱氨酸蛋白酶最適 pH為5.5左右[3],在偏酸環(huán)境中易被激活。因此,在酸法提取過程中,由于內(nèi)源蛋白酶活性較高,導(dǎo)致肌原纖維蛋白被降解。由此可以推斷,堿法可以減少分離過程中蛋白質(zhì)的自溶降解。

    Marmon等[15]研究發(fā)現(xiàn),從鯡Clupea harengus肌肉中提取的酸分離蛋白也發(fā)生了明顯的肌原纖維蛋白降解現(xiàn)象,并出現(xiàn)了相對分子量分別為130 000~150 000和35 000~37 000的兩條新條帶。Kristinsson[16]也發(fā)現(xiàn),大西洋鱈Gadusmorhua的肌原纖維蛋白在提取過程中發(fā)生了明顯降解,同樣也有這兩條帶出現(xiàn),這與本研究結(jié)論一致。

    2.2 分離蛋白的功能特性

    2.2.1 溶解性 溶解性是所有功能特性的基礎(chǔ)。溶解性的變化反映了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化,一般而言,蛋白質(zhì)變性會造成溶解度降低。所以,溶解度也是衡量蛋白質(zhì)變性程度的重要指標(biāo)[17]。

    圖1 箭齒鰈肌肉分離蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the protein isolates extracted from arrow tooth flounder muscle

    從圖2可見:隨著NaCl溶液中離子強度的升高,4種樣品均表現(xiàn)出溶解性增強的趨勢,這是因為魚肉蛋白質(zhì)的主要成分是鹽溶性的肌原纖維蛋白;其中經(jīng)漂洗、酸和堿等分離處理后,與原料魚肉相比其肌肉蛋白的溶解性均下降,這是因為在漂洗、酸和堿分離回收過程中,水溶性蛋白發(fā)生了不同程度的流失。漂洗魚糜的溶解性明顯低于堿分離蛋白,而高于酸分離蛋白,這可能是由于酸處理過程使蛋白質(zhì)變性的程度更明顯所致。

    圖2 不同離子強度對分離蛋白溶解性的影響Fig.2 Effects of different ionic strength on the solubility of protein isolates

    2.2.2 持水性和持油性 從圖3可見:漂洗魚糜的持水性最高,且顯著高于其他樣品的持水性(P<0.05),其次是原料碎肉,而分離蛋白的持水性均不高,且酸分離蛋白和堿分離蛋白的差異不大(P>0.05),這并不排除是由酸堿處理過程中使蛋白質(zhì)變性所致;持油性是蛋白質(zhì)與油結(jié)合吸附油的能力,本研究中漂洗魚糜的持油性顯著高于其他樣品的持油性 (P<0.05),原料碎肉和堿分離蛋白的持油性次之,酸分離蛋白的持油性最差,這可能是由于酸處理過程使蛋白質(zhì)變性,削弱了蛋白質(zhì)與油的相互作用,使其持油性降低。

    圖3 分離蛋白的持水性和持油性分析Fig.3 The water/oil-holding capacity of the protein isolates obtained by different extraction methods

    2.2.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性 從圖4可見:堿分離蛋白的乳化性最高,且顯著高于其他樣品的乳化性 (P<0.05),其次是酸分離蛋白,而原料碎肉和漂洗魚糜的乳化性差異不大 (P>0.05),它們的乳化性都小于分離蛋白。由此可以看出,蛋白質(zhì)的溶解性與其乳化性無明顯相關(guān)性。從圖4還可以看出,4種樣品肌肉蛋白的乳化穩(wěn)定性都很好,其中原料碎肉和漂洗魚糜的乳化穩(wěn)定性顯著高于分離蛋白 (P<0.05)。

    影響蛋白質(zhì)乳化性的因素有很多,如蛋白質(zhì)的變性程度、蛋白質(zhì)種類、pH值、離子強度、溫度、糖的存在等[18]。而影響箭齒鰈分離蛋白乳化性的具體因素還需要進一步研究探討。

    2.2.4 起泡性和起泡穩(wěn)定性 從圖5可見,漂洗魚糜和酸分離蛋白的起泡性最好,其次是原料魚肉,堿分離蛋白的起泡性最差,且顯著低于其他樣品肌肉蛋白(P<0.05)。這可能是由于箭齒鰈肌肉中存在組織蛋白酶L,其活性在pH 5.5時最強,酸處理過程中會激活蛋白酶活性使蛋白質(zhì)降解[2],從而影響酸分離蛋白的起泡性。4個樣品肌肉蛋白的起泡穩(wěn)定性,同樣也是酸分離蛋白的起泡穩(wěn)定性高于堿分離蛋白,且存在顯著性差異 (P<0.05)。

    圖4 分離蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性分析Fig.4 The emulsifying activity and emulsion stability of the protein isolates extracted by different methods

    圖5 分離蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性分析Fig.5 The foam ing capacity and foam ing stability of the protein isolates extracted by different methods

    2.2.5 凝膠性 凝膠強度是食品蛋白質(zhì)配料的一個很重要的功能特性。從表1可見:堿分離蛋白凝膠的強度最高,且顯著高于漂洗魚糜凝膠和酸分離蛋白凝膠 (P<0.05);而酸分離蛋白的凝膠強度最差。這是由于箭齒鰈肌肉中存在組織蛋白酶L,而組織蛋白酶L的最適pH為5.5~6.0,所以,不排除在酸性處理過程中激活了蛋白酶活性,使蛋白質(zhì)發(fā)生自溶降解而變性[2]。其他關(guān)于分離蛋白凝膠特性的研究還有很多,根據(jù)Marmon等[15]的分析結(jié)果可知,酸分離蛋白和堿分離蛋白凝膠的強度差異不大。根據(jù)Pérez-Mateos等[19]的分析結(jié)果,堿分離蛋白凝膠強度最好,其次是漂洗魚糜凝膠,酸分離蛋白最差。以箭齒鰈作為原料,關(guān)于其酸堿分離蛋白凝膠的凝膠強度差異較大的研究,還沒有相關(guān)報道。這也驗證了箭齒鰈被利用的局限性。由表1還可知,酸分離蛋白凝膠的白度較高,這可能是由于其凝膠中水分含量較高所致。

    表1 漂洗魚糜和分離蛋白凝膠產(chǎn)品的特性分析Tab.1 Characteristics of gels produced from surim i and protein isolates

    2.3 分離蛋白的一般化學(xué)組成和色度分析

    2.3.1 一般化學(xué)組成 從表2可見:堿分離蛋白的粗脂肪含量為1.23%,酸分離蛋白的粗脂肪含量為1.96%,漂洗魚糜的粗脂肪含量最高3.30%,與原料魚肉的粗脂肪含量 (13.00%)相比,脫脂效果最好的是堿處理過程,其次是酸處理過程,最差的是傳統(tǒng)漂洗過程,且它們之間都存在顯著性差異 (P<0.05)。綜合考慮,酸堿處理過程提取到的分離蛋白在一般化學(xué)組成上要優(yōu)于漂洗魚糜。

    2.3.2 色度 作為食用性功能蛋白配料,除了必要的功能性以外,其白度往往也是重要的質(zhì)量評價指標(biāo)之一。從表3可見:原料蛋白和漂洗魚糜的L*值都較低,相應(yīng)的其白度也較低;而酸分離蛋白和堿分離蛋白表現(xiàn)出較高的L*值,分別為77.71和77.42,a*值反映的是紅度 (+)或綠度(-),其中原料魚肉顯示了更多的紅色,顯然是由天然血紅素蛋白所引起的,而漂洗魚糜、酸分離蛋白和堿分離蛋白的a*值都低于原料魚肉,且為負值,即顯示綠度,這可能是由于漂洗或酸堿處理過程使大部分的天然血紅素蛋白被分離出去。酸分離蛋白和堿分離蛋白相比,其b*值更低,且存在顯著性差異 (P<0.05),它們與原料魚肉和漂洗魚糜相比有相對較低的黃度。根據(jù)Kristinsson等[20]的分析,紅度值可能與血紅素蛋白的共同沉淀有一定的關(guān)聯(lián),黃度應(yīng)該與脂質(zhì)的存在有一定的關(guān)聯(lián)。

    表2 箭齒鰈原料魚肉和分離蛋白的一般化學(xué)組成(干基)Tab.2 Proxim ate com position of ground muscle and p rotein isolates of arrow tooth flounder(dry basis) w/%

    表3 箭齒鰈原料魚肉和分離蛋白的色度分析Tab.3 Color analysis of ground muscle and protein isolates of arrow tooth flounder

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    Functional properties of protein isolates extracted from muscle of arrow tooth flounder Atheresthes stomias

    YAN Rui-xia,LIU Jun-rong,MA Yong-sheng,LIANG Shan-shan,LI Fang
    (College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

    The functional fish protein isolates were extracted by pH-shift process,characterized and compared with surimi extracted by traditional process in arrowtooth flounderAtheresthes stomias.Molecular weight profiles of the fish protein isolates were analyzed with SDS-PAGE.The results showed that the alkali-aided protein isolates were composed of had intactmyofibril protein molecules,but the acid-aided isolate had a protein band possibly representing partial hydrolysis ofmyosin and actin.The analysis of solubility,water-holding capacity,oil-holding capacity,emulsifying activity,foaming capacity and gel properties of the fish protein isolates indicated that there was higher emulsifying properties in the acid protein isolate and alkaline protein isolate than that in the ground muscle and washed surimi.The protein isolates produced from alkali-aided process were found to have better gel-forming ability compared to the acid-aided and the surimi processes.There was no significant improvement in the water/ oil-holding capability and the other properties.The protein isolates were shown to have de-fatted effect,with the minimal lipid content in the alkali-aided protein isolate(1.23%),followed in acid-aided protein isolate (1.96%),and 3.30% in the conventional surimi.The colorimetric analysis revealed that protein isolates produced from pH-shift process had higher whiteness than surimi and ground muscle did.The findings suggest that the functional fish protein isolates extracted from arrowtooth flounder have the potential to be used as protein ingredients for food processing.

    Atheresthes stomias;fish protein isolate;protein functional property

    TS254.9

    A

    2095-1388(2013)05-0492-06

    2013-01-21

    國家自然科學(xué)基金資助項目 (31271980)

    閆瑞霞 (1987-),女,碩士研究生。E-mail:yruixia@163.com

    劉俊榮 (1963-),女,博士,教授。E-mail:ljunrong@dlou.edu.cn

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