紫蛇尾膠原蛋白提取工藝的研究

姜斌,汪秋寬,何云海,任丹丹

(大連海洋大學(xué)遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

紫蛇尾膠原蛋白提取工藝的研究

姜斌,汪秋寬,何云海,任丹丹

(大連海洋大學(xué)遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116023)

以紫蛇尾Ophiopholismirabilis為原料檢測(cè)其基本成分,并用鹽酸對(duì)紫蛇尾進(jìn)行脫鈣處理,通過L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)其膠原蛋白的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:紫蛇尾含水分51.80%,灰分42.91%,蛋白質(zhì)1.68%,脂肪0.29%,總糖0.03%;酶促溶性膠原蛋白 (PSC)提取工藝的優(yōu)化條件為脫鈣后的紫蛇尾干粉 (g)與提取液 (mL)的固液比為1∶15,胃蛋白酶加酶量3%,17℃下提取4 d,PSC得率為52.65%。對(duì)純化后的酸促溶性膠原蛋白 (ASC)和PSC進(jìn)行紫外掃描分析,結(jié)果顯示,ASC、PSC的最大吸收波長均在235 nm左右。對(duì)PSC的氨基酸組成分析表明,脯氨酸和羥脯氨酸的含量分別為10.1%和2.13%,是較典型的Ⅰ型膠原蛋白。

紫蛇尾;酸處理時(shí)間;酶促溶性膠原蛋白;紫外分析

紫蛇尾Ophiopholismirabilis屬于棘皮動(dòng)物、蛇尾綱、鄂蛇尾亞目、輻蛇尾科[1]。目前對(duì)紫蛇尾的研究主要集中在生態(tài)學(xué)分類和再生機(jī)制方面,而對(duì)其活性物質(zhì)的研究比較少[2]。國內(nèi)外對(duì)膠原蛋白的研究報(bào)道較多,且已取得了一定的進(jìn)展,尤其是魚類膠原蛋白, 包括從鯽[3]、 鯉[4]、 鰈[5]、 海參[6-7]、 魷魚[8]、 海蜇[9-10]等提取膠原蛋白, 大部分是從魚皮[11-14]、 魚骨[15-16]、 魚鱗[17]等水產(chǎn)品加工廢棄物中提取膠原蛋白。膠原蛋白的提取方法有多種, 主要有酸提法[18]、 熱水提法[19]、 酶提法[20]。近年來,海星[21-22]也因其含有膠原蛋白和皂苷等生物活性物質(zhì)而被國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注,但尚未見對(duì)紫蛇尾膠原蛋白的研究報(bào)道。為此,本研究中對(duì)紫蛇尾的營養(yǎng)成分及其膠原蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,旨在開拓高附加值紫蛇尾膠原蛋白加工產(chǎn)品的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用紫蛇尾由大連獐子島漁業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供。胃蛋白酶購于Solarbio公司。

主要儀器與設(shè)備有FD-4冷凍干燥機(jī)、UV-754分光光度計(jì)和GL-21M冷凍離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 紫蛇尾原料的預(yù)處理 將紫蛇尾原料浸泡于濃度為0.4 mol/L的鹽酸溶液中[22],進(jìn)行攪拌,每日更換溶液一次,共浸泡3 d。然后用清水漂洗至中性,將漂洗后的紫蛇尾體壁浸泡于濃度為0.3 mol/L的NaOH溶液中進(jìn)行攪拌,共處理6 h,且每隔2 h更換一次堿液,結(jié)束后漂洗至中性。以上操作均在4℃以下進(jìn)行,以防止膠原蛋白在提取過程中變性[23]。用真空冷凍干燥樣品,并用粉碎機(jī)粉碎成粉末備用。

1.2.2 膠原蛋白的提取及純化 稱取紫蛇尾預(yù)處理樣品60 g,按照固液比為1∶20的比例加入濃度為0.5 mol/L的乙酸-乙酸鈉溶液中。在10℃下提取2 d后進(jìn)行離心,取上清并向上清液中緩慢加入NaCl,使其終濃度達(dá)到0.5 mol/L,在4℃下靜置24 h,使蛋白析出。然后在4℃下以10 000 r/min離心30 min,將沉淀溶于0.5 mol/L的乙酸溶液中透析脫鹽,再次進(jìn)行離心。最后將沉淀冷凍干燥,即得純度較高的酸溶性膠原蛋白 (ASC)。

等量稱取9份紫蛇尾粉,用ASC提取工藝進(jìn)行酶促溶性膠原蛋白(PSC)的提取。將上述第一步所得溶液離心后,向沉淀中加入濃度為0.5 mol/L的乙酸提取液。以提取時(shí)間、溫度、胃蛋白酶加酶量和樣品 (g)與提取液 (mL)的比 (簡稱固液比)為試驗(yàn)因素,設(shè)計(jì)4因素3水平 (表1)的酶解正交試驗(yàn)L9(34),其操作方法與ASC提取步驟相同,即得純度較高的PSC。

表1 PSC正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 The factor and level table in the orthogonalexperiment of PSC

1.2.3 紫外光譜分析 將純化后的樣品溶于0.5 mol/L乙酸溶液中,在200～400 nm波長處對(duì)其紫外吸收進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 氨基酸組成分析 取一定量的膠原蛋白樣品,在減壓充氮條件下,用6 mol/L HCl于110℃下水解24 h。采用日立835-50型氨基酸分析儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蛇尾的基本組成成分

從表2可見,紫蛇尾中灰質(zhì)成分含量很高,其干基中含量為89.04%,其他含量相對(duì)較少。海燕中灰分為 42.04%[21],海盤車中灰分含量為66.39%[24],紫蛇尾中的灰質(zhì)含量遠(yuǎn)高于海盤車與海燕。這使紫蛇尾的脫鈣預(yù)處理與其他兩種原料有很大差異。

表2 紫蛇尾的基本組成成分Tab.2 The approximate composition in brittle-starw/%

2.2 酸溶性膠原蛋白的提取率

在酸溶性膠原蛋白提取過程中,以0.5 mol/L乙酸-乙酸鈉為提取液,紫蛇尾樣品與提取液的固液比為1∶20,在10℃下提取2 d,ASC得率為0.025%。

2.3 酶促溶性膠原蛋白提取工藝的優(yōu)化

從表3可見,不同的正交試驗(yàn)參數(shù)組合所得的PSC的差異很大,9個(gè)試驗(yàn)組中,9號(hào)試驗(yàn)組的PSC提取率最高,為52.65%。極差分析結(jié)果表明,各個(gè)因素對(duì)PSC提取率影響的主次順序?yàn)锳＞C＞B＞D,最佳提取條件為A3B3C2D1,正好與正交試驗(yàn)中的最佳試驗(yàn)組合9號(hào)一致,即最佳提取組合條件為提取時(shí)間4 d、加酶量3%、溫度17℃、固液比1∶15,在此條件下PSC的提取率為52.65%。

表3 提取PSC的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The results of the orthogonal experiment of PSC

2.4 ASC和PSC的紫外光譜掃描

在波長為200～400 nm時(shí),對(duì)所提取的ASC、PSC進(jìn)行紫外光譜掃描,結(jié)果見圖1。由圖1可見,ASC、PSC的最大吸收波長均為235 nm,這符合I型膠原蛋白的紫外吸收特征,這表明本試驗(yàn)中提取到的膠原蛋白為純度較高的 I型膠原蛋白[21-22]。

圖1 ASC、PSC紫外吸收光譜Fig.1 The UV spectra of ASC and PSC

2.5 膠原蛋白氨基酸的組成

按照本試驗(yàn)所得最佳提取工藝條件制備獲得PSC的氨基酸組成如表4所示,氨基酸總量為95.03%,其中甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量比較高,分別為 24.90%、12.40%、9.59%、10.10%。羥脯氨酸和脯氨酸是膠原蛋白特有的氨基酸[25-26],從以上數(shù)據(jù)顯示來看,脯氨酸的含量占膠原蛋白總量的10.10%,這符合膠原蛋白的氨基酸組成特點(diǎn)[27-30];羥脯氨酸的含量占氨基酸總量的2.13%,羥脯氨酸的含量與膠原蛋白的變性溫度有關(guān),含量越高變性溫度越高,膠原蛋白維持三股螺旋結(jié)果的能力越強(qiáng),羥脯氨酸是脯氨酸在轉(zhuǎn)譯后由脯氨酸羥基化作用產(chǎn)生的[18]。蘇氨酸占3.56%,絲氨酸占5.15%,蘇氨酸和絲氨酸可逐漸轉(zhuǎn)化成羥脯氨酸,以適應(yīng)較高溫度的生活環(huán)境。本試驗(yàn)結(jié)果表明,PSC膠原蛋白的氨基酸種類豐富,其中包括7種人體必需氨基酸 (賴氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸),2種人體半必需氨基酸 (精氨酸和組氨酸),以及8種其他氨基酸 (谷氨酸、丙氨酸、羥脯氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸),這與劉石生等[19]的研究結(jié)果一致。

3 討論

本研究中對(duì)紫蛇尾膠原蛋白提取進(jìn)行了初步研究。從紫蛇尾中提取出ASC和PSC,確定了PSC的最佳反應(yīng)條件。紫蛇尾含水量為51.80%,其干基中灰分含量為89.04%,粗脂肪含量為0.60%,粗蛋白質(zhì)含量為3.48%,總糖含量為0.06%。紫蛇尾中的灰質(zhì)含量遠(yuǎn)高于海盤車與海燕[21,24]。這使紫蛇尾的脫鈣預(yù)處理與其他兩種原料有很大差異。潘洪民等[17]報(bào)道的提取魚鱗膠原蛋白的最佳工藝務(wù)件為:固液比1∶25,脫鈣時(shí)間3 h,提取時(shí)間1.5 d,脫鈣酸濃度為0.4 mol/L,在此條件下,膠原蛋白提取率為1.142%。這與紫蛇尾的脫鈣條件也有很大差異,本試驗(yàn)中,ASC提取率為0.025%,說明紫蛇尾中酸溶性膠原蛋白含量很少。提取酶溶性膠原蛋白的正交試驗(yàn)結(jié)果顯示,影響PSC提取率的因素主次順序?yàn)樘崛r(shí)間＞加酶量＞溫度＞固液比。極差分析得到,制備PSC的最佳反應(yīng)條件為:提取4 d、加酶量為3%、提取溫度為17℃、固液比為1∶15。最佳反應(yīng)條件下PSC提取率為52.65%,較郝林華等[24]報(bào)道的多棘海盤車體壁膠原蛋白的提取率略低,這與紫蛇尾的蛋白含量低于多棘海盤車的蛋白含量有關(guān)。對(duì) ASC和PSC紫外光譜分析顯示,所提取的海蛇尾ASC和PSC的最大吸收波長均為235 nm,符合Ⅰ型膠原蛋白的紫外特征吸收,表明ASC和PSC均為典型的Ⅰ型膠原蛋白。劉遠(yuǎn)平等[21]報(bào)道的海燕體壁膠原蛋白的ASC和PSC的最大吸收波長也為235 nm,與本研究結(jié)論一致;辛菲等[31]報(bào)道的關(guān)于鲅魚皮酸溶性膠原蛋白的紫外吸收波長為230 nm,與本研究的結(jié)果稍有差異。本研究中,PSC的氨基酸組成顯示,甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸和脯氨酸的含量較高,分 別 為 24.90%、12.40%、9.59% 和10.10%,脯氨酸的含量占膠原蛋白總量的10.10%,這與牛皮、豬皮、鯉魚鱗、羅非魚皮等膠原蛋白中的脯氨酸含量[25]相近,符合膠原蛋白的氨基酸組成特點(diǎn)。

[1] 黃宗國.中國海洋生物種類與分布[M].北京:海洋出版社, 2008:713-717.

[2] 楊柳青.戴太陽鏡的海蛇尾[J].科學(xué)之友,2006(12):53.

[3] 聶小寶,潘洪民,程麗林,等.鯽魚魚鱗膠原蛋白提取工藝的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,44(1):109-111.

[4] 潘冰青,劉光明,曹敏杰,等.鯉魚膠原蛋白的過敏原性研究[J].集美大學(xué)學(xué)報(bào),2011,16(5):341-345.

[5] 王群,鄭海濤,葛堯,等.酶法制備鰈魚魚皮膠原蛋白肽及其清除超氧陰離子自由基的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27 (14):87-93.

[6] 肖楓,曾名勇,董士遠(yuǎn),等.海參膠原蛋白的研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)科學(xué),2005,24(6):39-41.

[7] 葉繼鋒,陳秀美,戴偉偉,等.海參膠原蛋白的提取及其基本成分的分析[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2011,28(6):3196-3199.

[8] 許慶陵,郭恒斌,曾慶祝.魷魚皮膠原蛋白制備技術(shù)研究[J].科學(xué)研究,2008,29(9):59-63.

[9] Morishige A,Sughara T,Nishimoto S.Immunostimulatory effects of collagen from jellyfish in vivo[J].Cytotechnology,2011,63(5): 481-492.

[10] 丁進(jìn)鋒,蘇秀榕,張春丹,等.海蜇膠原蛋白提取工藝及促愈合作用研究[J].食品科學(xué),2010,31:19-23.

[11] Boonprab K,Satiankomsorakrai J,Khamthong N.Optimum fish for fish glue processing for fish skin value added and the glue character[J].Journal of Agricultural Science and Technology,2011 (B1):1211-1215.

[12] Muralidharan N,Shakila R J,Sukumar D,et al.Skin,bone and muscle collagen extraction from the trash fish,leather jacket (Odonus niger)and their characterization[J/OL].Journal of Food Science and Technology,2011,DOI10.1007/s13197-011-0440-y.

[13] 艾超,黃燦燦,李致瑜,等.魚皮膠原蛋白提取工藝的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊,2012(5):93-94.

[14] 劉朝霞,陳海光,黃東雨.魚皮膠原蛋白的提取及其應(yīng)用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,20:100-102.

[15] Suárez M D,Abad M,Ruiz-Cara T,etal.Changes inmuscle collagen content during postmortem storage of farmed sea bream (Sparus aurata):influence on textural properties[J].Aquaculture International,2005,13(4):315-325.

[16] 吳緹,陳舜勝.斑點(diǎn)叉尾鮰魚骨膠原蛋白的提取與特性研究[J].食品工業(yè)科技,2009(3):263-266.

[17] 潘洪民,聶小寶,程麗林,等.武昌魚魚鱗膠原蛋白提取工藝的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(1):111-115.

[18] 陳麗麗,趙利,劉華.有機(jī)酸提取鮰魚皮膠原蛋白的工藝研究[J].食品與機(jī)械,2010,26(5):118-121.

[19] 劉石生,易美華,黃文艷.熱水提取羅非魚魚鱗膠原蛋白的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2006,22(4):139-141.

[20] 程波,吳潔,張玉蓉.酶法提取人工養(yǎng)殖鱘魚皮中膠原蛋白的工藝研究[J].食品研究與開發(fā),2009,30(3):1-4.

[21] 劉遠(yuǎn)平,張琳琳,張慧怡,等.海燕體壁膠原蛋白提取工藝的初步研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2011,26(1):54-57.

[22] 張琳琳,汪秋寬.海燕酸脫除液中各元素含量的分析[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2012,27(1):86-88.

[23] 劉慶慧,王彩理.魚鱗膠原蛋白研究[J].海洋水產(chǎn)研究, 2000,12(3):57-61.

[24] 郝林華,李八方.多棘海盤車體壁膠原蛋白的研究[J].中國水產(chǎn)科學(xué),1999,6(2):18-21..

[25] 宋芹,董小萍,郁小兵.部分哺乳動(dòng)物和魚類膠原蛋白中氨基酸的組成和含量的比較[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24:1239-1242.

[26] 李鵬,李瑞偉,王浩,等.尼羅羅非魚魚皮膠原蛋白及其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物成分分析[J].江西水產(chǎn)科技,2008(3):12-16.

[27] 楊樹奇,曾少葵,周春霞,等.3種魚皮的基本成分及氨基酸組成分析[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30+:97-100.

[28] Liu Zunying,Su Yicheng,Zeng Mingyong.Amino acid composition and functional properties of giant red sea cucumber(Parastichopus califomicus)collagen hydrolysates[J].China Oceanic and Coastal Sea Research,2011,10(1):80-84.

[29] 林煒,穆暢道,朱梅湘.利用皮邊角料提取食品級(jí)膠原蛋白/多肽(Ⅰ)——氨基酸組成分析和分子量測(cè)定[J].中國皮革, 2003,32:5-8.

[30] Williams JR,Gong H.Biological activities and syntheses of steroidal saponins:the shark-repelling pavoninins[J].Lipids,2007, 42(1):77-86.

[31] 辛菲,李華.鲅魚皮酸溶性膠原蛋白提取及分子特性的初步研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,49(1):122-126.

Extraction of collagen from brittle star Ophiopholis mirabilis

JIANG Bin,WANG Qiu-kuan,HE Yun-hai,REN Dan-dan
(Key Laboratory of Fishery Product Processing and Utilization of Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

The approximate composition of brittle star Ophiopholis mirabilis was analyzed and the extraction technology of pepsin-soluble collagen(PSC)was optimized from the brittle star powder decalcified by HCL in an orthogonal experiment.The results showed that the brittle star powder contained moisture of 51.80%,ash of 42.91%, crude protein of 1.68%,crude fat of 0.29% and sugar of 0.03%.The orthogonal experiment indicated that the optimal extraction of pepsin soluble collagen(PSC)was carried out under the conditions of addition of pepsin at a rate of 3%,and hydrolyzing temperature of 17℃ for 4 days.The ratio of the powder and extracting solution was found to be 1∶15 with PSC yield of 52.65%.The UV spectrotography of the extracted acid soluble collagen (ASC)and PSC revealed that the maximal absorbance of both collagens was at 235 nm,indicating that both ASC and PSC were typical I type collagen.

Ophiopholis mirabilis;acid treatment time;pepsin-soluble collagen(PSC);UV analysis

S986

A

2095-1388(2013)05-0498-04

2013-01-30

國家科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目 (2008GB2B000061)

姜斌 (1987-),男,碩士研究生。E-mail:390219748@qq.com

汪秋寬 (1962-),女,教授。E-mail:wqk320@dlou.edu.cn