直腸癌凋亡相關(guān)蛋白與腫瘤細(xì)胞體外化療藥物敏感性的關(guān)系

張海峰，李金海，戴華衛(wèi)，周瑞耀

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院 普通外科，浙江 溫州 325200）

多重耐藥性的存在，常導(dǎo)致直腸癌術(shù)后化療失敗[1]。通過研究不同細(xì)胞株已經(jīng)證實(shí)，多藥耐藥（MDR）的重要機(jī)制之一就是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生凋亡抵抗[2-3]。因此，克服腫瘤細(xì)胞耐藥性，提高抗癌藥物療效已成為腫瘤治療中亟待解決的關(guān)鍵性問題。本研究旨在檢測(cè)直腸癌組織Survivin、bcl-2及bax的表達(dá)，并探討其與體外腫瘤細(xì)胞化療藥物敏感性的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2008年1月至2012年1月間在溫州醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院手術(shù)且經(jīng)病理證實(shí)的48例直腸癌患者新鮮腫瘤組織標(biāo)本。其中男27例，女21例，年齡（63.12±13.11）歲。術(shù)前均未接受任何治療。術(shù)中分別取新鮮腫瘤組織1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm置入雙抗培養(yǎng)液行噻唑藍(lán)（MTT）法體外腫瘤細(xì)胞化療藥物敏感實(shí)驗(yàn)。另每例腫瘤標(biāo)本經(jīng)中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，行免疫組織化學(xué)染色。

1.2 免疫組織化學(xué)染色測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白Survivin、bcl-2、bax蛋白表達(dá) 鼠抗人Survivin、bcl-2、bax多克隆抗體、免疫組織化學(xué)試劑盒購自美國eBioscience公司，鏈霉卵白素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物（SP）法對(duì)腫瘤組織進(jìn)行上述指標(biāo)染色，并嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗做陰性對(duì)照，已知陽性切片作陽性對(duì)照。由兩位高年資病理醫(yī)師分別雙盲閱片進(jìn)行結(jié)果判讀。每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍（×400）視野，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，Survivin、bcl-2、bax以細(xì)胞膜及（或）細(xì)胞質(zhì)呈黃色為染色陽性，按著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率分別進(jìn)行記分。著色強(qiáng)度記分：無著色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分。陽性細(xì)胞率記分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；兩種記分標(biāo)準(zhǔn)所得分值的乘積為0～1分陰性（-），2～3分弱陽性（+），4～7分陽性（++），≥8分強(qiáng)陽性（+++）。表達(dá)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)：記分≤3分為弱表達(dá)，≥4分為強(qiáng)表達(dá)。

1.3 體外藥物敏感實(shí)驗(yàn) MTT（Bio Vision公司），DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶（Pepro Tech公司）。酶標(biāo)儀DNM-9602A（北京普朗公司），直腸癌組織研磨分散，用細(xì)胞分離器調(diào)整濃度為5×108/L。使用前將腫瘤藥敏檢測(cè)板和培養(yǎng)基預(yù)溫至37.0 ℃。9種受試藥物分別為：氟尿嘧啶（5-Fu）、長春新堿（VCR）、足葉乙甙（VP-16）、紫杉醇（PTX）、表阿霉素（eADM）、羥基喜樹堿（HCPT）、奧沙利鉑（L-OHP）、順鉑（DDP）、甲氨蝶呤（MTX），藥物終治療濃度為血漿峰值藥物濃度。接種細(xì)胞懸液200μL/孔，微量振蕩器振蕩混勻，置于37.0 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，加MTT（5 g/L）20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，當(dāng)顯微鏡下觀察到MTT還原形成藍(lán)色針狀結(jié)晶時(shí)終止培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)板以1000 r/min離心10 min，棄上清，加入二甲基亞砜（DMSO）100μL/孔，振蕩混勻，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)各孔吸光度（A）值。腫瘤細(xì)胞平均抑制率（IR，%）=（1-給藥孔平均A值/對(duì)照孔平均A值）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPPS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。凋亡相關(guān)蛋白之間的相關(guān)分析采用秩相關(guān)檢驗(yàn)，并計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)，藥物抑制率以±s表示，采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌Survivin、bcl-2、bax表達(dá) 48例直腸癌Survivin、bcl-2、bax強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為72.9%（35/48）、35.4%（17/48）、47.9%（23/48），詳見表1。3種蛋白表達(dá)之間的關(guān)系：Survivin與bax間表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.37112，P＜0.01），bcl-2與bax間表達(dá)強(qiáng)度亦呈負(fù)相關(guān)（r=-0.37112，P＜0.01）。

2.2 直腸癌Survivin、bcl-2、bax表達(dá)與化療藥物敏感性之間的關(guān)系 Survivin強(qiáng)表達(dá)時(shí)，eADM、DDP對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率分別明顯降低（t=2.464，P＜0.05；t=2.118，P＜0.05），但L-OHP對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率則明顯增加（t=-2.079，P＜0.05）；bcl-2強(qiáng)表達(dá)組的5-Fu、PTX、eADM對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯低于弱表達(dá)組（t=2.588，P＜0.05；t=2.316，P＜0.05；t=2.139，P＜0.05）；bax強(qiáng)表達(dá)組中，5-Fu、eADM、L-OHP和MTX對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯高于弱表達(dá)組（t=-3.289，P＜0.01；t=-2.365，P＜0.05；t=-2.112，P＜0.05），見表1。

3 討論

早期直腸癌治療效果好，但晚期直腸癌缺乏特別有效的治療方法，目前主要以全身化療為主[4]。由于對(duì)化療藥物MDR的存在，直腸癌在施行根治性手術(shù)和輔助化療后，發(fā)生轉(zhuǎn)移率仍較高[5]。研究[6-8]證實(shí)，5-Fu、VCR、VP-16等多種臨床常用化療藥物均可通過干擾核酸的合成或（和）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。最近研究表明，凋亡是化療藥物發(fā)揮化療藥物毒性的最初作用形式，而抑制凋亡信號(hào)途徑是化療藥物發(fā)生耐藥的機(jī)制之一[9]。在當(dāng)今研究的凋亡蛋白中，Survivin與bcl-2與直腸癌細(xì)胞凋亡關(guān)系較為密切，通過對(duì)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）的抑制，Survivin可阻止細(xì)胞的凋亡，致使MDR發(fā)生[6]。另外，bcl-2蛋白家族可以調(diào)節(jié)線粒體外膜的穩(wěn)定性，抑制線粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致MDR。本研究所選的9種受試化療藥物中，直腸癌細(xì)胞對(duì)5-Fu、PTX、eADM、L-OHP及DDP的耐藥與Survivin、bcl-2過表達(dá)相關(guān)：Survivin高表達(dá)時(shí)腫瘤與eADM、L-OHP、DDP耐藥相關(guān)；bcl-2高表達(dá)時(shí)與5-FU、PTX、eADM耐藥相關(guān)。本研究證實(shí)了Survivin、bcl-2表達(dá)與部分化療藥物敏感性相關(guān)，也證實(shí)Survivin、bcl-2可能通過作用于凋亡通路的不同靶點(diǎn)，從而抑制藥物引起的細(xì)胞凋亡。

表1 直腸癌組織Survivin、bcl-2、bax表達(dá)與化療藥物抑制率之間的關(guān)系（±s，%）

表1 直腸癌組織Survivin、bcl-2、bax表達(dá)與化療藥物抑制率之間的關(guān)系（±s，%）

與各自的弱表達(dá)組比：aP＜0.05，bP＜0.01

蛋白表達(dá)例數(shù)化療藥物抑制率HCPT L-OHP DDP MTX 5-Fu VCR VP-16 PTX eADM Survivin弱表達(dá) 13 22.43±4.6518.65±10.3428.39±8.9425.78±9.4825.12±9.20強(qiáng)表達(dá) 35 23.48±7.4717.98±11.2229.68±9.0723.65±8.2216.09±7.78a bcl-2弱表達(dá) 31 29.66±5.7826.56±8.8722.76±5.9431.54±7.3229.43±5.20強(qiáng)表達(dá) 17 22.43±4.65a18.65±10.3428.39±8.9623.78±9.48a22.12±1.29a bax弱表達(dá) 25 22.53±7.9916.74±7.6720.32±10.2233.98±7.1821.74±5.22強(qiáng)表達(dá) 23 28.85±6.37b17.98±8.6224.19±7.3834.65±8.7327.92±7.91a 25.73±6.6920.63±9.8827.49±10.4321.72±9.38 27.49±10.9128.82±8.75a22.62±8.43a20.55±8.82 28.62±11.3131.42±7.4820.48±8.7125.61±10.41 29.44±6.9528.65±7.4619.83±9.4924.22±5.59 26.40±10.8322.68±10.6322.73±13.1220.92±12.16 24.88±7.2328.19±4.98a20.63±8.8426.72±13.18a

bcl-2和bax基因是與細(xì)胞凋亡關(guān)系最為密切的凋亡基因，二者具有同源性，bcl-2是凋亡抑制基因，bax是促凋亡基因[10]。本研究結(jié)果顯示，直腸癌組織中bax與Survivin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，可能與二者有著共同的作用通路，有拮抗作用有關(guān)[11]。本研究還證實(shí)了，bax強(qiáng)表達(dá)時(shí)5-Fu、eADM、L-OHP、MTX 4種藥物對(duì)直腸癌的抑制率增強(qiáng)，其中eADM對(duì)腫瘤的抑制與Survivin、bcl-2、bax這3種蛋白均無關(guān)，說明這3種蛋白可能通過共同的作用機(jī)制致使腫瘤對(duì)eADM耐藥。本研究通過檢測(cè)直腸癌組織中Survivin、bcl-2、bax表達(dá)情況并分析與化療藥物抑制率之間的關(guān)系，闡明了某些化療藥物的耐藥性可能與相關(guān)凋亡蛋白的過表達(dá)有關(guān)，這為以后闡明抗癌藥物的耐藥具體機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為以后提高抗癌藥物的療效并制定合理的抗癌對(duì)策提供了新的方向與思路。

[1] Tomita M, Kuboi K, Kameyama N, et al. Effective cetuximab monotherapy for a case of recurrence rectal cancer after multiple previous chemotherapy treatment(FOLFOX,FOLFIRI)[J]. Gan To Kagaku Ryoho, 2011, 38(1):121-124.

[2] Sun Y, Dai M, Hao H, et al. The role of RamA on the development of ciprofloxacin resistance in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J]. PLoS One, 2011, 6(8):e23471.

[3] Narchi H, Al-Hamdani M. Uropathogen resistance to antibiotic prophylaxis in urinary tract infections[J]. Microb Drug Resist, 2010, 16(2):151-154.

[4] 周璇, 盧敏, 吳瀛達(dá). 奧沙利鉑聯(lián)合希羅達(dá)治療晚期結(jié)直腸癌的臨床觀察[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 40(3):282-283.

[5] Comerford KM, Wallaee TJ, Karhausen J, et al. Hypoxiainducible factor 1 dependent regulation of the multidrug resistance(MDRI)gene[J]. Cancer Res, 2002, 62(5):3387-3394.

[6] Hayashi R, Ishii Y, Ochiai H, et al. Suppression of heat shock protein 27 expression promotes 5-fluorouracil sensitivity in colon cancer cells in a xenograft model[J]. Oncol Rep, 2012, 25(10):1935-1941.

[7] Alimoradi H, Pourmohammadi N, Mehr SE, et al. Effects of lithium on peripheral neuropathy induced by vincristine in rats[J]. Acta Med Iran, 2012, 50(6):373-379.

[8] Martin ST, Heneghan HM, et al. Systematic review and meta-analysis of outcomes following pathological complete response to neoadjuvant chemoradiotherapy for rectal cancer[J]. Br J Surg, 2012, 99(7):918-928.

[9] Nair RG, Bensadoun RJ, Oberholzer T, et al. An unusual case of foreskin phimosis after radiotherapy for rectal carcinoma[J]. Cancer Radiother, 2012, 19(7):474-452.

[10]Ye QF, Zhang YC, Peng XQ, et al. Silencing Notch-1 induces apoptosis and increases the chemosensitivity of prostate cancer cells to docetaxel through Bcl-2 and Bax[J].Oncol Lett, 2012, 3(4):879-884.

[11]Huerta S, Hrom J, Gao X, et al. Tissue microarray constructs to predict a response to chemoradiation in rectal cancer[J].Dig Liver Dis, 2010, 42(10):679-684.