CDKAL1基因rs7756992位點(diǎn)多態(tài)性與2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及臨床特征關(guān)聯(lián)分析

李偉，牛慶，李霞蓮，沈飛霞，施紅英，曹淑彥，張婷，李春梅，呂建新

（溫州醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035，1.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科；3.環(huán)境與公共衛(wèi)生學(xué)院；4.附屬第二醫(yī)院 科研中心）

據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)數(shù)據(jù)顯示，2011年全球約有3.66億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2030年將增長(zhǎng)到5.52億[1]，其中2型糖尿?。═2DM）占90%～95%。2007年6月至2008年5月，在中國(guó)成年人中進(jìn)行的一次大規(guī)模調(diào)研顯示，T2DM和糖耐量異常人數(shù)分別約為9240萬和1.48億，且以中青年人為主，居世界第一位[2]。因此，對(duì)T2DM防治已是刻不容緩。T2DM是由胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能失調(diào)引起的一種多基因遺傳性疾病，遺傳因素和生活環(huán)境因素相互作用被公認(rèn)為是該病形成的主要機(jī)制。因此，易感人群的篩查和早期生活方式的干預(yù)是預(yù)防T2DM發(fā)生發(fā)展的有效措施。

從2007年迄今，通過采用全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome wide association study，GWAS）技術(shù)，已報(bào)道約40個(gè)基因與T2DM密切相關(guān)[3]，其中包括CDKAL1（CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1）。該基因在不同種族和人群中得到反復(fù)驗(yàn)證，是公認(rèn)的易感基因之一[4]，位于人類染色體6p22.3，可以編碼一種tRNA修飾酶-甲硫基轉(zhuǎn)移酶，主要負(fù)責(zé)tRNALys（UUU）37位堿基的2-甲硫基-N6-蘇氨酸氨基甲酰腺苷酸（2-methylthio-N6-threonylcarbamoyladenosine，ms2t6A）合成[5]。在β細(xì)胞特異性CDKAL1基因敲除小鼠中，發(fā)現(xiàn)胰島β細(xì)胞線粒體ATP生成障礙和第一時(shí)相胰島素分泌受損[6]。2007年冰島人群的GWAS研究首次報(bào)道了rs7756992位點(diǎn)與T2DM關(guān)聯(lián)[7]，后來在多個(gè)研究中，特別是在亞洲人群中得到重復(fù)驗(yàn)證[8]。因此，該基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型分析在確定T2DM易感人群中具有重要意義。

由于T2DM遺傳的高度異質(zhì)性，在不同民族和不同人群中易感基因的檢測(cè)及其作用仍需要進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。本研究采用高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）和DNA測(cè)序技術(shù)，建立基因分型的技術(shù)平臺(tái)，對(duì)rs7756992位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群T2DM的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步分析不同基因型的臨床特征，為該病分子分型建立初步基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 病例組來自溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科住院部2009年3月至2010年10月期間被診斷為T2DM的患者，共534例；對(duì)照組人群由2009年12月至2010年1月期間于溫州市體檢中心進(jìn)行體檢的健康體檢者篩選所得，共453例，所有入選者均為浙江省溫州地區(qū)漢族人群。T2DM診斷根據(jù)1997年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，且排除：①其他內(nèi)分泌及代謝性疾病患者，如甲狀腺功能亢進(jìn)和減低、原發(fā)性醛固酮增多癥等；②惡性腫瘤和非高血壓引起的嚴(yán)重心、肝、腎等慢性疾病患者；③藥物等因素引起的糖、脂代謝異常者；④風(fēng)濕免疫性疾病患者；⑤不合作或資料不全者。對(duì)照組人群的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：空腹血糖（FBG）＜5.6 mmol/L的非糖尿病體檢者，且既往無糖尿病病史及家族史。該研究經(jīng)溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，調(diào)查和取樣均征得受試者本人同意并簽署知情同意書。

1.2 生化指標(biāo)測(cè)定與樣本DNA提取 所有研究對(duì)象采集空腹外周靜脈血2 mL，用于基因組DNA提取及各項(xiàng)生化指標(biāo)測(cè)定。使用DNA提取試劑盒（大連寶生物有限公司的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，D824A）及磁珠提取法（深圳易瑞生物技術(shù)有限公司的800μL全血基因組DNA磁珠提取試劑盒）對(duì)收集的病例組和對(duì)照組樣本進(jìn)行全基因組DNA提取，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度后，保存在-30 ℃冰箱中。

1.3 HRM基因型分類

1.3.1 引物：HRM對(duì)引物自身結(jié)構(gòu)和特異性要求較高，PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度以60～150 bp最佳，且擴(kuò)增片段越短，基因型分類越容易。本實(shí)驗(yàn)所采用的引物由Primer 5設(shè)計(jì)，并由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。引物上游序列為5’-CCATTAATATTC CCCCCTGT-3’，下游序列為5’-GAGCTTCATGCAACCAAG AG-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度124 bp。

1.3.2 PCR擴(kuò)增和HRM條件：使用Light Cycler 480 SystemII（德國(guó)羅氏公司）對(duì)所有樣本全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和HRM分析，實(shí)驗(yàn)所用試劑LightCycle480 High Resolution Melting Master購自羅氏公司。

首先使用設(shè)計(jì)好的HRM專用引物做普通PCR，獲得引物的最佳退火溫度。然后隨機(jī)選取5～10個(gè)樣本進(jìn)行HRM分析，得到最優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)化溫度（71～72 ℃和80～81 ℃），并根據(jù)熔解曲線形狀和顏色區(qū)分樣本基因型。

本實(shí)驗(yàn)在96孔板中進(jìn)行。HRM優(yōu)化后的擴(kuò)增體系為：HRM Master 5μL， MgCl21μL（2.5 mmol/L），上下游引物各0.5μL（0.5μmol/L），全基因組DNA 1μL（約10～25 ng）和一定量的去離子水（調(diào)節(jié)最終反應(yīng)體積至10μL）。HRM反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，最后72 ℃延伸15 s，共45個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增結(jié)束，產(chǎn)物于95 ℃加熱1 min后降至40 ℃，然后又以1℃/s的速度從65 ℃加熱至95 ℃，最后在40 ℃條件下冷卻10 s。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可視化熒光數(shù)據(jù)有標(biāo)準(zhǔn)圖、溫度變化圖和差異圖三種，使用LightCycle480 Gene scanning軟件自動(dòng)化分組功能進(jìn)行分析。

1.3.3 假陽性和假陰性結(jié)果排除：由于HRM技術(shù)會(huì)出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，我們?cè)O(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。另外對(duì)一些結(jié)果不可信的樣本進(jìn)行重復(fù)上機(jī)，并隨機(jī)抽取各20例病例組和對(duì)照組樣本用DNA直接測(cè)序技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 DNA直接測(cè)序 DNA測(cè)序技術(shù)可以對(duì)變異進(jìn)行定位和鑒定，是目前基因分型技術(shù)中檢測(cè)基因突變和單核苷酸多態(tài)性的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過該技術(shù)，測(cè)定HRM熔解曲線中不同顏色和形狀的曲線所代表的基因型，并對(duì)隨機(jī)抽取的少量樣本進(jìn)行驗(yàn)證。我們通過PCR技術(shù)擴(kuò)增CDKAL1基因中包含rs7756992位點(diǎn)的DNA片段，擴(kuò)增片段經(jīng)過純化后直接用于測(cè)序分析。PCR擴(kuò)增用引物，上游為5’-TCTGATTTTCTCA CCCTACAC-3’，下游為5’-CCTGGGAGAATTTACTTGG-3’，由Primer 5設(shè)計(jì)，北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系（25μL）包括：去離子水18μL，dNTP 2μL，Buffer 2μL，MgCl21.5μL，上下游引物各0.2μL（10μmol/L），Taq酶0.1μL（大連寶生物公司Takara PCR反應(yīng)體系）。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，其中變性、退火和延伸分別擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 臨床資料分析中呈正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布計(jì)量資料用中位數(shù)（四分位間距）表示，經(jīng)變量變換轉(zhuǎn)為正態(tài)后再做獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，而變量變換后未轉(zhuǎn)為正態(tài)的非正態(tài)分布資料用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料使用x2檢驗(yàn)。群體基因型和等位基因頻率均經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)樣本的群體代表性。rs7756992基因型和等位基因與T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和糖尿病并發(fā)癥關(guān)聯(lián)分析使用x2檢驗(yàn)。T2DM患者不同基因型與臨床特征比較，呈正態(tài)分布的計(jì)量資料用單因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA），非正態(tài)分布資料經(jīng)對(duì)數(shù)變量變換轉(zhuǎn)為正態(tài)后用ANOVA，計(jì)數(shù)資料用x2檢驗(yàn)，然后對(duì)于有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)，使用多元線性回歸進(jìn)行校正。所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件包統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組和對(duì)照組的臨床特征及生化指標(biāo)比較 病例組和對(duì)照組臨床資料及各項(xiàng)生化指標(biāo)統(tǒng)計(jì)情況見表1。病例組人群年齡、BMI、血壓、FBG和血清甘油三酯（TG）較對(duì)照組顯著增高（P＜0.05），尤其是BMI、血壓、FBG和TG差異更為明顯（P＜0.01）。對(duì)照組人群血清總膽固醇（TC）和高密度脂蛋白（HDL）顯著高于病例組（P＜0.01），而性別分布在兩組人群中無明顯差異（P＞0.05）。

表1 病例組和對(duì)照組人群臨床基本特征（±s）

表1 病例組和對(duì)照組人群臨床基本特征（±s）

注：*表示非正態(tài)分布資料，變量變換轉(zhuǎn)為正態(tài)后使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；#表示變量變換后未轉(zhuǎn)為正態(tài)資料，使用秩和檢驗(yàn)

臨床特征例數(shù)年齡（年）性別（男/女）BMI（kg/m2）血壓收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）TC（mmol/L）*TG（mmol/L）*HDL（mmol/L）*FBG（mmol/L）#534 61.03±12.65 280/254 24.25±3.38 453 58.82±11.39 229/222 22.31±2.19＜0.05＞0.05＜0.01 143.24±24.8 80.47±11.68 4.36（1.46）1.29（0.98）1.11（0.42）8.05（4.10）119.12±11.48 74.65±8.24 4.73（1.02）1.00（0.51）1.36（0.45）5.02（0.81）＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01 P病例組 對(duì)照組

2.2 基因型和等位基因檢測(cè)及分析

2.2.1 HRM分析：圖1A為rs7756992的標(biāo)準(zhǔn)熔解曲線，圖1B為標(biāo)準(zhǔn)化的溫度變化曲線，隨著溫度的改變，代表不同基因型的熔解曲線形狀和顏色發(fā)生改變。其中綠色表示突變型GG，紅色表示野生型AA，而藍(lán)色則表示雜合子AG。

圖1 高分辨率熔解曲線（HRM）

2.2.2 DNA直接測(cè)序結(jié)果分析：DNA測(cè)序結(jié)果使用Condon code Aligner軟件與NCBI中提供的人類CDKAL1基因標(biāo)準(zhǔn)序列（GenBank#：NC_000006.11）進(jìn)行比對(duì)分析，查找發(fā)生核苷酸變異的位點(diǎn)（見圖2）。經(jīng)驗(yàn)證，在隨機(jī)抽取的40例樣本中兩種實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)率達(dá)到100%。

圖2 rs7756992位點(diǎn)DNA測(cè)序結(jié)果

表2 rs7756992位點(diǎn)各基因型和等位基因頻率分布

2.3 等位基因及基因型分析 病例-對(duì)照組人群進(jìn)行Hardy Weinberg檢驗(yàn)，多態(tài)性位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中均達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。

我們將CDKAL1基因rs7756992位點(diǎn)基因型頻率分布按照G/A，GG/AA，（GG+AG）/AA，GG/（AG+AA）四種模型進(jìn)行分析（見表2），可以看出：在病例組和對(duì)照組間，基因型GG所占比重較AA型大，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.048，OR=1.43，95%CI＝1.00～2.03），而且等位基因G對(duì)T2DM也存在一定影響（P＝0.045，OR=1.12，95% CI＝1.00～1.43）。

2.4 基因型與臨床特征分析 按照不同基因型AA、AG和GG將T2DM患者分為三組，對(duì)每組的臨床特征及生化指標(biāo)進(jìn)行比較。從表3中可以看出：GG基因型患者發(fā)病年齡較AA型低，三種基因型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.02），但是經(jīng)過性別和年齡校正后，差異不再有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AA和AG基因型患者的FBG濃度較GG型增高，三者間有顯著差異（P＝0.03），經(jīng)過性別和年齡校正后，差異仍然顯著（P＜0.01），但是三組之間HbA1c未見顯著差異。另外，不同基因型患者之間血壓、BMI和血脂差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但通過對(duì)這3個(gè)參數(shù)按照臨床標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行等級(jí)劃分后發(fā)現(xiàn)，在肥胖和TC異?；颊咧蠫G基因型所占比重最大。

2.5 等位基因及基因型與T2DM并發(fā)癥關(guān)聯(lián)分析 將534例T2DM患者按照糖尿病并發(fā)癥類型進(jìn)行分組（劃分標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)臨床診斷和相關(guān)輔助檢查，如血管B超、視網(wǎng)膜檢查、神經(jīng)肌電圖檢查、肝腎功能檢查和血壓測(cè)量等），觀察基因型和等位基因頻率在各種慢性并發(fā)癥中的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者間無顯著關(guān)聯(lián)（見表4）。

3 討論

2007 年，在冰島人群的病例-對(duì)照研究中，首次發(fā)現(xiàn)rs7756992（G）與T2DM關(guān)聯(lián)，而且這一結(jié)果在丹麥、歐洲祖先人群以及中國(guó)香港漢族人群中得到驗(yàn)證[7]。隨后，在多項(xiàng)研究中也證實(shí)了這一位點(diǎn)與亞洲人群T2DM存在關(guān)聯(lián)，G為風(fēng)險(xiǎn)等位基因（OR＝1.19）[8]。在最近的中國(guó)大陸漢族人群研究中，也已得到驗(yàn)證（OR＝1.21）[13]。在本研究中，我們進(jìn)行了CDKAL1基因rs7756992位點(diǎn)與T2DM的關(guān)聯(lián)分析，驗(yàn)證了在浙江省溫州地區(qū)漢族人群中，rs7756992（G）為T2DM風(fēng)險(xiǎn)等位基因（P＝0.045），這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合，說明該位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群T2DM緊密關(guān)聯(lián)。同時(shí)，我們觀察到GG基因型與AA基因型相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.048），GG基因型在T2DM人群中頻率增高，這一頻率分布與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致。

表3 病例組不同基因型患者臨床特征比較（±s）

表3 病例組不同基因型患者臨床特征比較（±s）

注：*表示非正態(tài)分布資料；a表示用多元線性回歸，經(jīng)性別和年齡校正后；△BMI正常范圍：18.5≤BMI＜24，過重：24≤BMI＜27，肥胖≥27；▲TC＞6.0 mmol/L為異常

P 0.28 0.06 0.02（0.88a）0.76 0.59 0.03（＜0.01a）0.71 0.69 0.11 0.37 0.84 0.38基因型例數(shù)（%）年齡（年）性別（男/女）BMI（kg/m2）△正常[例數(shù)（%）]過重肥胖血壓收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）發(fā)病年齡（年）胰島素治療（有/無）家族史（有/無）FBG（mmol/L）*HbA1c（%）TC（mmol/L）*▲＞正常[例數(shù)（%）]TG（mmol/L）*HDL（mmol/L）*LDL（mmol/L）*AA 114（21.35）59.69±12.77 67/47 24.08±2.98 55（48.25）41（35.96）18（15.79）AG 260（47.88）62.28±13.00 131/129 24.02±3.48 127（49.22）84（32.56）47（18.22）143.76±24.71 81.31±11.64 51.26±13.01 60/54 47/67 8.00（4.03）9.46±2.68 4.29（1.37）10（8.77）1.21（0.94）1.11（0.37）2.71（1.12）GG 160（29.47）59.93±11.83 82/78 24.75±3.44 69（43.12）49（30.63）42（26.25）0.08 0.31 0.08 0.21 141.60±24.79 79.25±11.82 54.00±13.39 135/125 95/165 8.35（4.51）9.59±2.44 4.31（1.59）27（10.42）1.29（0.95）1.11（0.40）2.60（1.08）145.52±24.68 81.86±11.27 50.55±11.10 89/71 65/95 7.49（3.60）9.36±2.26 4.50（1.51）26（16.25）1.34（1.23）1.12（0.44）2.78（1.37）

表4 不同基因型T2DM患者糖尿病并發(fā)癥比較

有研究證實(shí)，CDKAL1基因變異可以影響T2DM患者的臨床特征，如HbA1c和胰島素分泌[9-10]。同時(shí)，也與糖尿病風(fēng)險(xiǎn)因素BMI關(guān)聯(lián)[11]。FBG、餐后血糖和HbA1c是我們常規(guī)監(jiān)測(cè)血糖控制情況的三項(xiàng)指標(biāo)，HbA1c反映的是2～3個(gè)月內(nèi)血糖控制的平均水平。本研究中，我們對(duì)不同基因型T2DM患者間的臨床特征進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)GG基因型患者FBG較低，經(jīng)過性別和年齡校正后差異更加顯著（P＜0.01），但是HbA1c在不同基因型患者間并無顯著差異，我們推測(cè)這種差異可能是受餐后血糖的影響。多項(xiàng)研究證實(shí)，CDKAL1風(fēng)險(xiǎn)等位基因可能會(huì)影響胰島β細(xì)胞功能，使得第一時(shí)相胰島素分泌受損[9]，這一點(diǎn)在基因敲除小鼠研究中也得到證實(shí)[6]。第一時(shí)相胰島素分泌對(duì)降低餐后血糖有重要作用，它能迅速抑制內(nèi)源性葡萄糖產(chǎn)生并抑制餐后血糖水平的升高，參與餐后高血糖的發(fā)生。因此，我們推測(cè)GG基因型患者的FBG偏低而HbA1c與其他基因型并無差異，可能是由餐后高血糖引起的，這還需要進(jìn)一步研究。雖然，其他臨床特征如血壓、BMI和血脂等在各組間差異未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是經(jīng)過對(duì)BMI和TC分級(jí)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，T2DM患者中肥胖和TC偏高者在GG基因型中所占比重最大。最近研究報(bào)道，在東亞人群中CDKAL1基因多態(tài)性位點(diǎn)（rs9956744和rs2206734）會(huì)影響B(tài)MI[11]，歐洲人群中也有類似的研究結(jié)果[15]。因此，不能排除rs7756992位點(diǎn)與BMI的關(guān)聯(lián)。

CDKAL1基因變異與T2DM并發(fā)癥的關(guān)系鮮見大規(guī)模的研究報(bào)道。由于CDKAL1基因與一個(gè)糖尿病微血管病變候選基因VEGF緊密連鎖[16]，最近國(guó)內(nèi)也有研究報(bào)道該基因可能與糖尿病視網(wǎng)膜病變有關(guān)[12]，所以CDKAL1基因多態(tài)性位點(diǎn)是否與T2DM并發(fā)癥關(guān)聯(lián)值得進(jìn)行探索性研究。但是在本研究中，通過我們的分析，未發(fā)現(xiàn)rs7756992位點(diǎn)與糖尿病的各種慢性并發(fā)癥存在相關(guān)性。

本研究中我們進(jìn)一步證實(shí)了在中國(guó)漢族人群中，CDKAL1基因rs7756992多態(tài)性可以增加T2DM的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，且不能排除其與血糖調(diào)節(jié)機(jī)制相關(guān)，另外，我們沒有發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與糖尿病慢性并發(fā)癥關(guān)聯(lián)。因此，CDKAL1基因與T2DM的關(guān)系進(jìn)一步得到驗(yàn)證，該位點(diǎn)等位基因和基因型的檢測(cè)可以為T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和分型提供參考，利于疾病的早期診斷，值得進(jìn)一步深入研究。

[1] The International Diabetes Federation(IDF). Diabetes Atlas.The Global Burden. 2011. http://www.idf.org/diabetesatlas/5e/the-global-burden.

[2] Yang W, Lu J, Weng J, et al. Prevalence of diabetes among men and women in China[J]. N Engl J Med, 2010, 362(12):1090-1101.

[3] Scott LJ, Mohlke KL, Bonnycastle LL, et al. A genomewide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants[J]. Science, 2007, 316(5829):1341-1345.

[4] Wei FY, Tomizawa K. Functional loss of Cdkal1, a novel tRNA modification enzyme, causes the development of type 2 diabetes. Functional loss of Cdkal1, a novel tRNA modification enzyme, causes the development of type 2 diabetes[J]. Endocr J, 2011, 58(10):819-825.

[5] Pierrel F, Douki T, Fontecave M, et al. MiaB protein is a bifunctional radical-S-adenosylmethionine enzyme involved in thiolation and methylation of tRNA[J]. J Biol Chem,2004, 279(46):47555-47563.

[6] Wei FY, Suzuki T, Watanabe S, et al. Deficit of tRNA(Lys)modification by Cdkal1 causes the development of type 2 diabetes in mice[J]. J Clin Invest, 2011, 121(9):3598-3608.

[7] Steinthorsdottir V, Thorleifsson G, Reynisdottir I, et al. A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes[J]. Nat Genet, 2007, 39(6):770-511.

[8] Tan JT, Ng DP, Nurbaya S, et al. Polymorphisms identified through genome-wide association studies and their associations with type 2 diabetes in Chinese, Malays, and Asian-Indians in Singapore[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2010, 95(1):390-397.

[9] Hart LM, Simonis-Bik AM, Nijpels G, et al. Combined risk allele score of eight type 2 diabetes genes is associated with reduced first-phase glucose-stimulated insulin secretion during hyperglycemic clamps[J]. Diabetes, 2010, 59(1):287-292.

[10]Ryu J, Lee C. Association of glycosylated hemoglobin with the gene encoding CDKAL1 in the Korean Association Resource(KARE) study[J]. Hum Mutat, 2012, 33(4):655-659.

[11]Okada Y, Kubo M, Ohmiya H, et al. Common variants at CDKAL1 and KLF9 are associated with body mass index in east Asian populations[J]. Nat Genet, 2012, 44(3):302-306.

[12] 付麗麗, 林嬰, 楊正林, 等. TCF7L2, CDKAL1, SLC30A8和HEEX 基因多態(tài)性與2 型糖尿病微血管并發(fā)癥的相關(guān)性[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志, 2012, 29(2):194-199.

[13]Xu M, Bi Y, Xu Y, et al. Combined effects of 19 common variations on type 2 diabetes in Chinese: results from two community-based studies[J]. PLoS One, 2010, 5(11):e14022.

[14] Liu Y, Yu L, Zhang D, et al. Positive association between variations in CDKAL1 and type 2 diabetes in Han Chinese individuals[J]. Diabetologia, 2008, 51(11):2134-2137.

[15]Manning AK, Hivert MF, Scott RA, et al. A genome-wide approach accounting for body mass index identifies genetic variants influencing fasting glycemic traits and insulin resistance[J]. Nat Genet, 2012, 44(6):659-669.

[16]Lu F, Qian Y, Li H, et al. Genetic variants on chromosome 6p21.1 and 6p22.3 are associated with type 2 diabetes risk:a case-control study in Han Chinese[J]. J Hum Genet, 2012,57(5):320-325.