步長(zhǎng)腦心通通過下調(diào)ASIC1a發(fā)揮對(duì)局灶性腦缺血再灌注的保護(hù)作用

張楠，褚鶴齡，唐宇平，董強(qiáng)，任惠

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，云南 昆明 650000；2.華山醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，上海200040）

近年來研究表明，步長(zhǎng)腦心通在實(shí)驗(yàn)研究及臨床治療上對(duì)缺血性腦血管疾病的療效明確[1-3]。腦缺血損傷機(jī)制中酸敏感離子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）[4]被激活導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+超載，促使腦細(xì)胞的大量死亡。大量研究提示ASICs中ASIC1a介導(dǎo)了腦缺血中神經(jīng)元的凋亡過程[5]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠短暫性大腦中動(dòng)脈阻塞模型，研究步長(zhǎng)腦心通對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用及該作用是否通過調(diào)節(jié)ASIC1a實(shí)現(xiàn)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 腦心通超微粉（陜西步長(zhǎng)制藥有限公司），紅四氮唑（TTC）染色液（美國(guó)Sigma公司），依文思藍(lán)（EB）染色液（美國(guó)Sigma公司），末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的duTP缺口標(biāo)記（TUNEL）試劑盒（Roche公司，Mannheim，Germany），兔抗大鼠ASIC1a抗體（Adi公司），HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（優(yōu)寧維公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及模型建立 本實(shí)驗(yàn)采用健康雄性SD大鼠90只（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），體質(zhì)量250～300 g。隨機(jī)分為假手術(shù)組、MCAO組、腦心通組，每組30只。根據(jù)Zea Longa[6]改良線栓法建立大鼠暫時(shí)性大腦中動(dòng)脈阻塞（tMCAO）模型，出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損視為造模成功。假手術(shù)組除不插線外，全過程等同對(duì)照組。90 min后拔線恢復(fù)再灌注，腦心通組給予步長(zhǎng)腦心通超微粉0.5 g/（kg·d）（4 mL 0.9%氯化鈉溶液溶解）灌胃（劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定），假手術(shù)組、MCAO組給予等體積0.9%氯化鈉溶液。術(shù)前3 d起給藥，術(shù)后每天1次，直至處死。

1.3 神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴(yán)重程度評(píng)分（NSS）每組大鼠于處死之前按照Chen等[7]的方法進(jìn)行NSS評(píng)分，該評(píng)分是一種運(yùn)動(dòng)、感覺、平衡和反射功能的綜合性評(píng)分指標(biāo)。最低0分，1～6為輕度，7～12為中度，13～18為重度損害，最高18分。

1.4 測(cè)量梗死體積 在相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)將各組大鼠斷頭取腦，迅速冰凍10 min，去除嗅球、小腦和低位腦干，連續(xù)切片成6片，每片厚度為2 mm，置于2% TTC液中染色30 min，4%多聚甲醛固定24 h后用數(shù)碼相機(jī)照相?？梢娂t色正常組織和白色梗死組織。用Image Tool 3.0軟件計(jì)算梗死體積。

1.5 測(cè)定腦含水量 在相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)將各組大鼠斷頭取腦組織，迅速除去嗅球、腦干、小腦，取梗死同側(cè)半球。準(zhǔn)確稱得濕重后置100 ℃烤箱中烘烤至恒重后稱取干重，根據(jù)以下公式計(jì)算腦組織含水量百分比：腦組織含水量=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.6 測(cè)定血腦屏障通透性 在相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)將各組大鼠經(jīng)尾靜脈注入2% EB液4 mL/kg，1 h后以10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，心內(nèi)灌注0.9%氯化鈉溶液200 mL，迅速斷頭取腦，取梗死同側(cè)半球稱濕重后置于甲酰胺（1 mL/100 mg腦組織）中，60 ℃孵育24 h。1000 r/min離心5 min，吸取上清液置于比色杯中，紫外分光光度計(jì)比色（λ=632 nm），蒸餾水為空白對(duì)照液，測(cè)定上清液吸光度A值。根據(jù)已知EB濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得EB含量（μg/g）。

1.7 TUNEL染色 將各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉、開胸，用0.9%氯化鈉溶液和4%多聚甲醛依次心內(nèi)灌注固定。斷頭取腦，梯度脫水后用OTC包埋劑包埋，冷凍后，用冰凍切片機(jī)作連續(xù)冠狀切片，片厚10μm。按照TUNEL試劑盒說明書操作。封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。在400倍高倍鏡下隨機(jī)觀察并計(jì)數(shù)梗死周圍6個(gè)不重疊視野的TUNEL陽性細(xì)胞，取其平均值作為計(jì)數(shù)值。

1.8 Westem blot法測(cè)ASIC1a表達(dá)水平 將各組大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死，取缺血核心區(qū)腦組織提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠不連續(xù)電泳分離，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，再分別加入兔抗大鼠ASIC1a一抗孵育。4 ℃孵育過夜。再分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育1.5 h后，放入ECL反應(yīng)液室溫孵育5 min，以X線膠片曝光。免疫印跡的圖譜經(jīng)Image proPlus 5.02圖像軟件分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示。多組間用單因素方差分析與Newman-Kueuls檢驗(yàn)，兩組間比較用兩樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 假手術(shù)組動(dòng)物無明顯神經(jīng)功能缺損，MCAO組、腦心通組均有不同程度的神經(jīng)功能缺損。與MCAO組相比，腦心通組大鼠各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組不同時(shí)間神經(jīng)功能評(píng)分比較（n=6）

2.2 梗死體積 假手術(shù)組無明顯梗死灶。與MCAO組比較，腦心通組各時(shí)間點(diǎn)梗死體積均有顯著減少（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組不同時(shí)間梗死體積比較（n=6）

2.3 腦含水量 與假手術(shù)組比較，MCAO組和腦心通組1、3和7 d腦含水量均有升高，與MCAO組比較，腦心通組各時(shí)間點(diǎn)腦含水量均有顯著減少（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組不同時(shí)間腦組織含水量比較（n=6）

2.4 EB含量 與MCAO組比較，腦心通組各時(shí)間點(diǎn)EB含量均有顯著降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組不同時(shí)間腦組織EB含量比較（n=6）

2.5 TUNEL染色 MCAO組和腦心通組均可見TUNEL陽性細(xì)胞。與MCAO組比較，腦心通組各時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量均有顯著減少（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組MCAO 3 d梗死周邊TUNEL染色熒光圖及比較

2.6 ASIC1a表達(dá)水平 Western bolt法檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，MCAO組ASIC1a表達(dá)量顯著增高（P＜O.05）。腦心通組的ASIC1a表達(dá)量3 d、7 d與MCAO組比顯著下降（P＜O.05）。見圖6-7。

圖6 各組不同時(shí)間ASIC1a蛋白Western blot法檢測(cè)圖像

圖7 各組不同時(shí)間Western blot法檢測(cè)ASIC1a半定量分析（n=6）

3 討論

步長(zhǎng)腦心通是由黃芪、川芎、全蝎、地龍、水蛭等十六味中藥根據(jù)中醫(yī)補(bǔ)陽還五湯理論研制而成的復(fù)方制劑，具有益血活血、化瘀通絡(luò)之功效，可以有效減少心腦缺血損傷[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示步長(zhǎng)腦心通可改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能，減少梗死體積，減輕腦水腫，保護(hù)血腦屏障完整性，減少梗死周邊凋亡細(xì)胞數(shù)量等作用，與以往研究結(jié)果一致。既往關(guān)于腦心通保護(hù)腦缺血的機(jī)制的研究包括，影響一氧化氮合酶[9]、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[10]表達(dá)，抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β[11]、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，mMP）MMP-2、MMP-9[12]、凋亡效應(yīng)子Caspase-3[13]的表達(dá)，從而發(fā)揮抵抗血小板聚集，保護(hù)神經(jīng)元，營(yíng)養(yǎng)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，減輕缺血區(qū)周圍炎癥反應(yīng)，減輕血管周圍的滲出和水腫的作用。而本實(shí)驗(yàn)首次探討步長(zhǎng)腦心通是否通過對(duì)ASIC1a的影響發(fā)揮作用。

發(fā)生腦缺血時(shí)，腦組織供氧不足導(dǎo)致糖酵解增加。嚴(yán)重情況下，其產(chǎn)物的積聚使局部缺血腦組織周圍的pH值快速下降至6.10，從而充分激活A(yù)SIC1a通道。Li等[14]在皮層培養(yǎng)物細(xì)胞上利用膜片鉗技術(shù)證明局部缺血通常會(huì)激活A(yù)SIC電流。腦內(nèi)ASIC1a高水平表達(dá)，介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流[15]，產(chǎn)生的酸性代謝產(chǎn)物和Ca2+超載破壞腦神經(jīng)元蛋白質(zhì)、脂類及核酸，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡[16]。研究證實(shí)，腦室內(nèi)注射ASIC1a阻斷劑或剔除ASIC1a基因能抑制酸誘導(dǎo)的腦損傷，腦梗死體積顯著減少[17]。上述實(shí)驗(yàn)均表明，ASIC1a可能參與了腦缺血后損傷作用。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到，腦缺血1 d后，ASIC1a的表達(dá)即開始上升，并在3 d達(dá)到高峰，說明損傷可誘導(dǎo)ASIC1a表達(dá)。而腦心通不影響MCAO 1 d后ASIC1a的表達(dá)，在3 d、7 d可顯著抑制ASIC1a表達(dá)。故推測(cè)，下調(diào)ASIC1a表達(dá)可能參與了步長(zhǎng)腦心通對(duì)亞急性期、而非急性期腦缺血的保護(hù)作用。Gao等[18]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在腦缺血過程中谷氨酸受體和ASIC1a發(fā)揮協(xié)同作用。另有研究顯示鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II依賴性ASIC1a的磷酸化在誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡中起主要作用[19]。而步長(zhǎng)腦心通是否通過以上等方面作用于ASIC1a尚有待進(jìn)一步研究。

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