40例肺結(jié)核患者病情進(jìn)展中白細(xì)胞介素-8表達(dá)變化的初步研究

車南穎 李雪蓮 張旭霞 高孟秋 李傳友

·論 著 ·

40例肺結(jié)核患者病情進(jìn)展中白細(xì)胞介素-8表達(dá)變化的初步研究

車南穎 李雪蓮 張旭霞 高孟秋 李傳友

目的 初步探索40例結(jié)核病患者外周血IL-8表達(dá)變化及其在肺結(jié)核病情進(jìn)展中的表達(dá)變化。方法納入對象為2011年5月至2013年2月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院的40例初治肺結(jié)核患者，以同期本院15名健康體檢者作為健康對照，并根據(jù)臨床診斷信息對肺結(jié)核患者進(jìn)行分組，將其中從診斷、治療及治愈后復(fù)查階段都拿到血液樣品的8例肺結(jié)核患者，作治療前后比較分析，納入為跟蹤調(diào)查組；按照細(xì)菌學(xué)及影像學(xué)檢查結(jié)果，將另外32例分為病情緩和組（痰菌陰性、肺部無空洞，17例）與病情嚴(yán)重組（痰菌陽性、肺部有空洞，15例）。采集8例跟蹤調(diào)查組患者治療前、治療中（治療開始后2～3個月之間）和治療結(jié)束后（停藥后1～3個月之間）抗凝外周血；另外32例病情緩和組與病情嚴(yán)重組患者只收集治療前抗凝外周血。加入結(jié)核分枝桿菌總蛋白刺激培養(yǎng)，再用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿中的IL-8表達(dá)量。用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗以分析健康對照組、病情緩和組及病情嚴(yán)重組患者之間IL-8表達(dá)是否存在差異，另外用Wilcoxon檢驗分析肺結(jié)核患者治療前、治療中及治療后IL-8表達(dá)是否存在差異。IL-8檢測數(shù)值用±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果 經(jīng)刺激誘導(dǎo)過的外周血IL-8表達(dá)量在病情嚴(yán)重組［（176.7±133.2）ng/ml］及病情緩和組［（39.6±52.2）ng/ml］均顯著高于健康對照組［（7.1±6.3）ng/ml］（U=5，P=0.000 008；U=62，P=0.013）。并且病情嚴(yán)重組IL-8表達(dá)水平也顯著高于病情緩和組（U=37，P=0.001）。另外，肺結(jié)核患者治愈后IL-8表達(dá)水平［（5.9±3.6）ng/ml］與治療前［（34.9±33.7）ng/ml］和治療中［（51.7±34.2）ng/ml］相比有顯著的降低（Z=-2.240，P=0.025；Z= -2.521，P=0.012）。結(jié)論 IL-8表達(dá)水平與肺結(jié)核患者病情轉(zhuǎn)歸相關(guān)。

結(jié)核，肺/血液； 白細(xì)胞介素8； 疾病嚴(yán)重程度指數(shù)

肺結(jié)核是嚴(yán)重危害人類健康的重要傳染性疾病，在中國的疫情非常嚴(yán)重［1-2］。肺結(jié)核治療周期長，藥物常出現(xiàn)不良反應(yīng)，快速準(zhǔn)確判斷化療效果是治療肺結(jié)核的重要環(huán)節(jié)。目前評估肺結(jié)核轉(zhuǎn)歸情況

主要靠以下3個方面的信息：（1）影像學(xué)檢查結(jié)果；（2）細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果；（3）臨床癥狀觀察結(jié)果。但這些指標(biāo)存在主觀影響大、陽性率低、耗時長或者癥狀不典型等缺點，不能滿足臨床判斷肺結(jié)核轉(zhuǎn)歸的客觀、快速、準(zhǔn)確的要求。白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）作為重要的炎癥因子在感染控制及病理損傷形成中均起著非常重要的作用。研究表明，IL-8很可能與結(jié)核病發(fā)病和病理現(xiàn)象相關(guān)。肺結(jié)核患者和潛伏感染者外周血單核細(xì)胞（peripheral blood monouclear cells，PBMC）在結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）特異性蛋白的刺激下，IL-8轉(zhuǎn)錄水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義［3］。動物模型中，IL-8與肉芽腫形成密切相關(guān)［4］。本研究通過比較健康人與不同臨床背景的肺結(jié)核患者之間的IL-8表達(dá)差異，以及肺結(jié)核患者不同病程中IL-8表達(dá)特點，探索了IL-8作為肺結(jié)核轉(zhuǎn)歸評估指標(biāo)的可行性。

材料和方法

一、臨床資料

1.基本情況：搜集從2011年5月至2013年2月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院就診的初治肺結(jié)核患者。根據(jù)《肺結(jié)核診斷和治療指南》制定了肺結(jié)核患者納入條件［5］。滿足（1）、（2）中任意一項，并同時滿足（3）、（4）兩項即可納入：（1）痰檢（涂片或培養(yǎng)）呈陽性；（2）痰檢陰性，但是影像學(xué)檢測及經(jīng)化學(xué)治療好轉(zhuǎn)證實為肺結(jié)核；（3）初治肺結(jié)核患者；（4）無糖尿病。對于痰菌陽性的確診患者直接納入。對于痰菌陰性的疑似患者，先按照疑似患者納入，采集和處理好血液樣品之后，待后續(xù)化學(xué)治療有效，能確診為肺結(jié)核后再進(jìn)行正式納入。如果臨床上無法提供確診信息，則進(jìn)行排除。最終符合納入標(biāo)準(zhǔn)的初治肺結(jié)核患者共40例，其中32例按照細(xì)菌學(xué)及影像學(xué)檢查結(jié)果大致分為病情嚴(yán)重（痰菌陽性、肺部有空洞，15例）和病情緩和（痰菌陰性、肺部無空洞，17例）兩組進(jìn)行比較（表1）；8例肺結(jié)核患者從診斷、治療及治愈后復(fù)查階段都拿到血液樣品，進(jìn)行治療前后比較分析，8例肺結(jié)核患者中男6例，女2例；年齡范圍（22～49）歲，平均年齡（32.6±10.4）歲；細(xì)菌學(xué)檢測陽性3例，陰性5例；3例有空洞，治療時間6～12個月。

同期選擇本院健康體檢者作為健康對照。健康對照納入標(biāo)準(zhǔn)為：影像學(xué)檢測正常，并且無任何結(jié)核病相關(guān)臨床癥狀。根據(jù)納入肺結(jié)核患者按病情程度分組后的數(shù)量，一次性納入15名健康對照者?；颊呒敖】祵φ照叩募{入均通過了首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會審核及批準(zhǔn)，并取得了本人或家屬的知情同意。

2.治愈標(biāo)準(zhǔn)：本研究治愈標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為滿足以下3條：（1）連續(xù)2次痰涂片結(jié)果陰性，其中1次是治療末；（2）完成規(guī)定的療程；（3）肺部病灶吸收、穩(wěn)定或者消失。作治療前后比較的8例患者均治愈。

二、試劑、耗材和儀器

人IL-8 ELISA試劑盒購自RayBiotech公司（Norcross，USA）；0.1 mm silica FastPrep beads及FastPrep-24組織破碎儀購自MP Biochemicals（Eschwege，Germany）；0.22μm一次性無菌濾器購自Millipore公司（Billerica，USA）；BCA蛋白定量試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司。24孔細(xì)胞板購自上?？祵幧锕荆渌牟木鶠閲a(chǎn)普通耗材。高速冷凍離心機購自Sigma公司，型號為3-30K；CO2培養(yǎng)箱購自湖北湘儀公司，型號為YCP-200A；酶標(biāo)儀購自北京普朗醫(yī)療器械公司，型號為9602。

三、方法

1.Mtb總蛋白制備：將H37Rv菌接種到7H9液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至吸光度A值達(dá)到1.0以上，離心收集菌體。p H值為7.4、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）洗2次，再用PBS重懸菌體，轉(zhuǎn)移至裝有FastPrep beads的管中，并通過FastPrep-24組織破碎儀振蕩破碎細(xì)菌。4℃，10 000×g離心10 min，取上清。用0.22μm一次性無菌濾器過濾除菌。用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測蛋白質(zhì)濃度，稀釋到1 mg/ml后分裝，-80℃保存。

表1 納入對象各組基本信息

2.外周血采集及Mtb總蛋白刺激培養(yǎng)：治療前血液樣品在化療前采集，治療中血液樣品在治療開始后2～3個月之間采集，治療結(jié)束后血液樣品在停藥后1～3個月之間采集。全部在肺結(jié)核患者進(jìn)行化學(xué)治療前進(jìn)行?？崭?fàn)顟B(tài)下，每位納入者用真空EDTA抗凝采血管一次性抽取2 ml外周血。將抗凝血轉(zhuǎn)移至24孔板，每孔1 ml外周血，加2孔。第一孔加入10μl PBS（p H=7.4），第二孔加入10μl Mtb總蛋白。在37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。4℃，3500×g離心10 min，取上清，-80℃保存。

3.IL-8表達(dá)水平檢測：用雙抗夾心ELISA方法測定血漿IL-8濃度，試劑盒采用RayBiotech公司人IL-8檢測ELISA試劑盒，并按照說明書進(jìn)行實驗。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的讀取數(shù)值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣品中IL-8濃度。

4.統(tǒng)計學(xué)方法：用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗以分析健康對照組、病情緩和組及病情嚴(yán)重組之間IL-8表達(dá)是否存在差異，另外用Wilcoxon檢驗分析肺結(jié)核患者治療前、治療中以及治療后IL-8表達(dá)是否存在差異。IL-8檢測數(shù)值用（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.不同臨床背景肺結(jié)核患者IL-8表達(dá)分析：檢測結(jié)果顯示，PBS作為對照處理后，健康對照組、病情緩和組及病情嚴(yán)重組血液中IL-8表達(dá)量分別為（0.7±0.5）ng/ml、（1.3±1.1）ng/ml和（9.9± 17.5）ng/ml，而用Mtb總蛋白刺激后，健康對照組、病情緩和組及病情嚴(yán)重組血液中IL-8表達(dá)量分別為（7.1±6.3）ng/ml、（39.6±52.2）ng/ml和（176.7±133.2）ng/ml。Mann-Whitney U檢驗分析顯示，用PBS處理時健康對照組與病情緩和組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（U=89，P=0.146），而病情緩和組與病情嚴(yán)重組患者之間，健康對照組與病情嚴(yán)重組患者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（U=67， P=0.022，U=40，P=0.003）（圖1A）。Mtb總蛋白刺激樣品中，兩組肺結(jié)核患者的IL-8表達(dá)均比健康對照組有顯著提高（U=5，P=0.000 008；U= 62，P=0.013）。另外，病情嚴(yán)重組比病情緩和組的表達(dá)顯著提高（U=37，P=0.001）（圖1B）。這些結(jié)果表明，IL-8本底表達(dá)與肺結(jié)核病情嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性，而經(jīng)過Mtb抗原誘導(dǎo)后的IL-8表達(dá)水平的差異更加顯著，與結(jié)核病病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

圖1 健康人與不同臨床背景肺結(jié)核患者外周血IL-8表達(dá)量的比較

2.不同時期肺結(jié)核患者血液樣品中的IL-8表達(dá)分析：為進(jìn)一步探索IL-8表達(dá)與肺結(jié)核轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，比較從診斷、治療以及治愈后復(fù)查階段都拿到血液樣品的8例肺結(jié)核患者治療前、治療中及治療結(jié)束后的IL-8表達(dá)量分別為（34.9±33.7）ng/ml、（51.7±34.2）ng/ml和（5.9±3.6）ng/ml。經(jīng)Wilcoxon檢驗，治療結(jié)束后IL-8表達(dá)水平顯著低于治療前及治療中的IL-8表達(dá)水平，患者在肺結(jié)核活動期IL-8表達(dá)與治愈后IL-8表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.240，P=0.025；Z=-2.521，P=0.012）（圖2）。治療中IL-8表達(dá)高于治療前（Z=-1.260，P=0.208）。這些結(jié)果提示IL-8的誘導(dǎo)表達(dá)水平可能成為評估肺結(jié)核轉(zhuǎn)歸的一個指標(biāo)。

圖2 8例肺結(jié)核患者不同時期外周血IL-8表達(dá)量分析

討 論

IL-8是CXC細(xì)胞因子家族成員，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子。IL-8主要功能是趨化多種免疫細(xì)胞至感染部位吞噬并殺傷病原菌。同時，在感染部位也會進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞脫粒，通過活化NADPH氧化酶促進(jìn)超氧化物和H2O2的形成，并引發(fā)呼吸爆發(fā)。肺結(jié)核是一種由 Mtb引起的傳染性疾病，因此發(fā)病期間病原菌感染及組織病理損傷都會引起感染部位IL-8的高表達(dá)。在體外培養(yǎng)實驗中，多種免疫細(xì)胞只有在Mtb刺激時才會產(chǎn)生大量的IL-8，而沒有刺激時IL-8表達(dá)量很低［6-8］。免疫組化結(jié)果表明，肺結(jié)核患者淋巴結(jié)及肉芽腫組織中均有IL-8表達(dá)［6］。在臨床樣本檢測中，結(jié)核病患者支氣管灌洗液、外周血B細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞等樣品中IL-8表達(dá)量均高于正常人的樣品［3，9-10］。此外，因結(jié)核病死亡的患者血漿中IL-8比存活的患者有顯著提高［10］。這些結(jié)果提示，IL-8表達(dá)與Mtb感染、結(jié)核病發(fā)病以及結(jié)核病嚴(yán)重程度相關(guān)。但是，IL-8表達(dá)與肺結(jié)核轉(zhuǎn)歸及治愈之間是否存在相關(guān)性，能否成為評估指標(biāo)還需要進(jìn)一步研究。因此，本研究納入了不同臨床背景肺結(jié)核患者、健康人、不同病程肺結(jié)核患者，探討了IL-8表達(dá)變化與肺結(jié)核轉(zhuǎn)歸及治愈之間的相關(guān)性。

在比較健康人、病情緩和的肺結(jié)核患者以及病情嚴(yán)重的肺結(jié)核患者外周血IL-8表達(dá)水平時，筆者發(fā)現(xiàn)用PBS處理的血液樣品中IL-8表達(dá)在三組中沒有顯著變化（P＞0.05），而用Mtb總蛋白刺激后的血液樣品三組之間呈現(xiàn)顯著的不同（P＜0.05），且IL-8表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度正相關(guān)（圖1）。這個結(jié)果表明，結(jié)核病患者外周血IL-8本底表達(dá)與病情嚴(yán)重程度沒有相關(guān)性，但是針對 Mtb抗原刺激后的IL-8表達(dá)水平是有相關(guān)性的。一般認(rèn)為，外周血細(xì)胞中對IL-8表達(dá)起主要貢獻(xiàn)作用的是單核細(xì)胞。筆者在前期工作中分析了769名健康人及547例結(jié)核病患者的外周血細(xì)胞中的單核細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者平均值為（4.5±1.7）×105個/ml，健康人平均值為（3.8±1.1）×105個/ml。在本研究中兩組肺結(jié)核患者IL-8表達(dá)量平均值為（39.6± 52.2）ng/ml和（176.7±133.2）ng/ml，而健康人IL-8表達(dá)量平均值為（7.1±6.3）ng/ml。雖然肺結(jié)核患者相比健康人單核細(xì)胞數(shù)量提高1.2倍，但是IL-8表達(dá)量卻升高5倍以上。因此，筆者認(rèn)為肺結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞對于Mtb抗原刺激更敏感，IL-8誘導(dǎo)表達(dá)量更高。

筆者還對8個肺結(jié)核患者就治療前、治療中以及治愈后外周血IL-8表達(dá)水平變化進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者在發(fā)病期IL-8表達(dá)量均處于高位，而治愈后IL-8表達(dá)顯著降低，回到健康人的表達(dá)水平（圖2）。其中，值得注意的是治療開始后2～3個月的IL-8的表達(dá)與治療前相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-1.260，P=0.208），治療中IL-8表達(dá)量均值為（51.7±34.2）ng/ml，高于治療前的（34.9± 33.7）ng/ml。但是3例痰菌陽性的患者經(jīng)過2～3個月治療后痰菌已轉(zhuǎn)陰，同時大部分患者肺部病灶都出現(xiàn)不同程度的好轉(zhuǎn)跡象。筆者分析出現(xiàn)這種情況可能是由于免疫應(yīng)答的變化需要時間。機體啟動免疫應(yīng)答需要一定時間，同樣病情好轉(zhuǎn)后消除相應(yīng)的免疫應(yīng)答也需要時間。因此，IL-8誘導(dǎo)表達(dá)水平的變化相比臨床指標(biāo)的改善有一定時間的滯后。因此，筆者認(rèn)為IL-8表達(dá)與肺結(jié)核轉(zhuǎn)歸相關(guān)，但其表達(dá)變化相比臨床癥狀的改善可能出現(xiàn)一定的延遲。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Mtb抗原刺激后的外周血IL-8表達(dá)水平與肺結(jié)核轉(zhuǎn)歸相關(guān)，但是由于本研究納入研究對象數(shù)量有限，IL-8表達(dá)水平能否成為評估肺結(jié)核轉(zhuǎn)歸新指標(biāo)還需要用更大量的臨床樣本做進(jìn)一步的驗證。同時IL-8表達(dá)與各臨床指標(biāo)之間相互影響的分子機制以及它們之間是否存在時間差也需要更深入的研究。

［1］全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告.中國防癆雜志，2012，34（8）：485-508.

［2］陳偉，夏愔愔，成詩明.結(jié)核病疫情及對策.中國防癆雜志，2012，34（9）：611-613.

［3］Wu B，Huang C，Kato-Maeda M，et al.Messenger RNA expression of IL-8，F(xiàn)OXP3，and IL-12beta differentiates latent tuberculosis infection from disease.J Immunol，2007，178 （6）：3688-3694.

［4］Larsen CG，Thomsen MK，Gesser B，et al.The delayed-type hypersensitivity reaction is dependent on IL-8.Inhibition of a tuberculin skin reaction by an anti-IL-8 monoclonal antibody.J Immunol，1995，155（4）：2151-2157.

［5］中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會.肺結(jié)核診斷和治療指南.中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24（2）：70-74.

［6］Ferrero E，Biswas P，Vettoretto K，et al.Macrophages exposed to Mycobacterium tuberculosis release chemokines able to recruit selected leucocyte subpopulations：focus on gammadelta cells.Immunology，2003，108（3）：365-374.

［7］Sawant KV，Mc Murray DN.Guinea pig neutrophils infected with Mycobacterium tuberculosis produce cytokines which activate alveolar macrophages in noncontact cultures.Infect Immun，2007，75（4）：1870-1877.

［8］Sadik CD，Hunfeld KP，Bachmann M，et al.Systematic analysis highlights the key role of TLR2/NF-kappaB/MAP kinase signaling for IL-8 induction by macrophage-like THP-1 cells under influence of Borrelia burgdorferi lysates.Int J Biochem Cell Biol，2008，40（11）：2508-2521.

［9］Algood HM，Chan J，F(xiàn)lynn JL.Chemokines and tuberculosis. Cytokine Growth Factor Rev，2003，14（6）：467-477.

［10］Vani J，Shaila MS，Rao MK，et al.B lymphocytes from patients with tuberculosis exhibit hampered antigen-specific responses with concomitant overexpression of interleukin-8.J Infect Dis，2009，200（3）：481-482.

Expression patterns of interleukin-8 during the progress of disease in 40 pulmonary tuberculosis patients

CHE Nanying，LI Xue-lian，ZHANG Xu-xia，GAO Meng-qiu，LI Chuan-you. Department of Bacteriology and Immunology，Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute，Beijing Chest Hospital，Capital Medical University，Beijing 101149，China

LI Chuan-you，Email：lichuanyou6688@hotmail.com

Objective To study the expression patterns of interleukin-8（IL-8）in peripheral blood samples from 40 pulmonary tuberculosis（PTB）patients during progress of PTB.Methods Fifteen healthy donors and 40 newly diagnosed PTB patients were recruited from May 2011 to February 2013 in Beijing Chest Hospital.The PTB patients were divided into 3 groups：8 patients for tracking studies；17 patiens with mild symptoms（negative sputum bacteria，the lung without cavity）；15 patients with severe symptoms（positive sputum bacteria，the lung with cavity）.Anticoagulant peripheral blood samples from 8 patients for tracking studies were collected before treatment，during treatment（2 to 3 months after treatment started），and after treatment（1 to 3 months after treatment ended），while that from the other 32 patients were collected only before treatment.Then the blood samples were incubated with Mycobacterium tuberculosis whole cell proteins.Plasma IL-8 expression levels were detected by enzyme linked immunosorbent assay.Statistical analysis was performed using SPSS 17.0 software.Mann-Whitney U test was used for analyzing IL-8 expression differences among healthy donors，mild PTB patients，and severe PTB patients.Wilcoxon test was used for comparing IL-8 expression levels before，during，and after treatment.IL-8 value was shown as±s），P value＜0.05 was considered as statistically significant.Results Induced expression level of IL-8 in severe PTB patients was（176.7±133.2）ng/ml，while that in mild PTB patients was（39.6±52.2）ng/ml. Both expression levels were significantly higher than that in healthy donors［（7.1±6.3）ng/ml］（U=5，P=0.000 008；U=62，P=0.013）.Also，expression level of IL-8 in severe PTB patients was significantly higher than that in mild PTB patients（U=37，P=0.001）.Additionally，IL-8 expression level in patients after treatment［（5.9±3.6）ng/ml］was significantly decreased than those before treatment［（34.9±33.7）ng/ml］and during treatment［（51.7±34.2）ng/ml］（Z=-2.240，P=0.025；Z=-2.521，P=0.012）.Conclusion IL-8 expression level is associated with progress of PTB.

Tuberculosis，pulmonary/blood； Interleukin-8； Severity of illness index

2013-04-26）

（本文編輯：張曉進(jìn)）

國家自然科學(xué)基金（81101332）；北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助項目（2010D003034000002）

101149北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院 細(xì)菌免疫學(xué)研究室（車南穎、張旭霞、李傳友），結(jié)核內(nèi)科（李雪蓮、高孟秋）

李傳友，Email：lichuanyou6688@hotmail.com