結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白（TB-SA）抗體檢測(cè)試劑在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用研究

李強(qiáng) 趙冰 夏輝 歐喜超 傅衍勇 王擷秀 王海英 彭琳 李輝 趙雁林

·論 著 ·

結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白（TB-SA）抗體檢測(cè)試劑在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用研究

李強(qiáng) 趙冰 夏輝 歐喜超 傅衍勇 王擷秀 王海英 彭琳 李輝 趙雁林

目的 評(píng)價(jià)結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白（tuberculosis specific antigen，TB-SA）抗體檢測(cè)試劑在結(jié)核病中的應(yīng)用價(jià)值。方法 以天津市和平區(qū)結(jié)核病控制中心、山東省煙臺(tái)芝罘區(qū)肺科醫(yī)院和河南省南陽(yáng)市臥龍區(qū)結(jié)核病防治中心為研究現(xiàn)場(chǎng)，連續(xù)納入2012年4月至10月門(mén)診就診的所有肺結(jié)核疑似患者944例，同時(shí)納入110名健康志愿者作為對(duì)照。對(duì)所有納入患者及健康志愿者進(jìn)行痰涂片、培養(yǎng)、結(jié)核菌素試驗(yàn)（PPD）和胸部X線(xiàn)檢查，簽署知情同意書(shū)后留取血清進(jìn)行TB-SA抗體檢測(cè)。痰涂片采用萋-尼（Ziehl-Neelsen）染色法，培養(yǎng)采用接種酸性羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)?，F(xiàn)場(chǎng)數(shù)據(jù)由雙人錄入，在國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一整理分析。結(jié)果 755例確診的活動(dòng)性結(jié)核病患者，TB-SA抗體檢測(cè)法陽(yáng)性率為74.8%（565/755，95%CI=71.7%～77.9%），遠(yuǎn)高于涂片陽(yáng)性率25.6% （193/755）（χ2=366.59，P＜0.0001）和培養(yǎng)陽(yáng)性率39.6%（299/755）（χ2=190.12，P＜0.0001）。在培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)核病患者中，TB-SA抗體檢查敏感度為88.5%（255/288，95%CI=84.8%～92.2%）。在菌陰活動(dòng)性結(jié)核病患者中，TB-SA抗體檢查敏感度為68.0%（310/456，95%CI=63.7%～72.3%）。TB-SA抗體檢測(cè)法在活動(dòng)性結(jié)核病患者中的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.3%（565/612，95%CI=90.2%～94.4%），在健康人群中檢測(cè)特異度為97.3%（95%CI= 94.3%～100.3%）。結(jié)論 TB-SA抗體檢測(cè)法在結(jié)核病患者中陽(yáng)性檢出率顯著高于涂片和培養(yǎng)，適用于結(jié)核病，特別是菌陰結(jié)核病的診斷；TB-SA抗體檢測(cè)法診斷結(jié)核病的特異度高，可用于人群健康體檢。

結(jié)核，肺/診斷； 細(xì)菌蛋白質(zhì)類(lèi)； 抗體，細(xì)菌； 試劑盒，診斷

結(jié)核病是影響當(dāng)前全球公共衛(wèi)生的嚴(yán)重問(wèn)題，我國(guó)是全球第二大結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家。如何及早、準(zhǔn)確地診斷痰菌陰性肺結(jié)核患者，以及鑒別潛伏感染者是目前結(jié)核病診斷面臨的重大挑戰(zhàn)之一。

抗體檢測(cè)免疫學(xué)方法是診斷許多感染性疾病的經(jīng)典方法，具有技術(shù)成熟、操作簡(jiǎn)單安全、時(shí)間短、可以對(duì)大規(guī)模樣本進(jìn)行快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)際和國(guó)內(nèi)也不乏使用該方法檢測(cè)結(jié)核病的報(bào)道。但由于缺乏特異性抗原，抗體檢測(cè)法特異度和敏感度低，未被世界衛(wèi)生組織推薦用于結(jié)核病診斷。干擾素釋放試驗(yàn)通過(guò)特異性抗原刺激血液淋巴細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞因子，診斷結(jié)核病的敏感度和特異度高達(dá)90%以上［1］，可以診斷潛伏感染結(jié)核病，但價(jià)格昂貴，難以實(shí)現(xiàn)在基層應(yīng)用。結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白（tuberculosis specific antigen，TB-SA）僅存在于致病的結(jié)核分枝桿菌中［2］。TB-SA抗體檢測(cè)法采用體外表達(dá)純化的結(jié)核分枝桿菌TB-SA蛋白抗原，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清標(biāo)本中特異性的TB-SA抗體。該方法操作簡(jiǎn)單、安全性好、特異度高，已獲得國(guó)際、國(guó)內(nèi)多項(xiàng)專(zhuān)利及技術(shù)保護(hù)。為評(píng)價(jià)其在我國(guó)基層醫(yī)療單位中結(jié)核病診斷及健康篩查中的應(yīng)用價(jià)值，筆者在3個(gè)省的3個(gè)區(qū)（縣）對(duì)該方法進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)評(píng)估研究。

材料和方法

一、材料

TB-SA抗體檢測(cè)試劑及PPD試劑由賽普克公司提供。

二、方法

1.研究現(xiàn)場(chǎng)：選擇天津市和平區(qū)結(jié)核病控制中心、山東省煙臺(tái)芝罘區(qū)肺科醫(yī)院和河南省南陽(yáng)市臥龍區(qū)結(jié)核病防治中心為研究現(xiàn)場(chǎng)。

2.樣本量估算：初診疑似肺結(jié)核患者樣本量計(jì)

健康志愿者樣本量計(jì)算公式： （ ）（Uα）2。n=p 1-pδ假設(shè)在健康人中采用結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體檢測(cè)的特異度不低于90%（P=0.9），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05，雙側(cè)U0.05=1.96，容許誤差δ=0.06。樣本含量n=96。

3.研究對(duì)象：2012年4月到10月在3個(gè)研究現(xiàn)場(chǎng)門(mén)診就診的所有初診疑似肺結(jié)核患者，本次研究共納入疑似結(jié)核病患者944例，確診的結(jié)核病患者755例。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡為18～75歲，男女不限，本地常住人口，無(wú)免疫系統(tǒng)疾病，近3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)免疫抑制劑。（2）咳嗽、咯痰＞2周就診的初診結(jié)核病疑似患者。（3）所有入選患者在簽署知情同意書(shū)后留取血清進(jìn)行抗體檢測(cè)。健康體檢志愿者入選標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)肺部疾患，獲得知情同意，胸部X線(xiàn)檢查陰性的健康者（PPD皮試強(qiáng)陽(yáng)性者除外），排除結(jié)核分枝桿菌高風(fēng)險(xiǎn)感染者。健康對(duì)照納入110名。

4.檢查方法：所有納入的疑似患者及健康志愿者要求進(jìn)行痰涂片、培養(yǎng)、PPD和胸部X線(xiàn)檢查，并留取血清進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體檢測(cè)。涂片鏡檢采用Ziehl-Neelsen染色檢查，培養(yǎng)采用簡(jiǎn)單法接種酸性羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，陽(yáng)性菌株運(yùn)輸?shù)绞〖?jí)結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室采用PNB法進(jìn)行菌種鑒定試驗(yàn)。具體操作按照文獻(xiàn)［3］的要求進(jìn)行。TB-SA抗體檢測(cè)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的操作流程進(jìn)行。

5.數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)由專(zhuān)人現(xiàn)場(chǎng)錄入，并由第2個(gè)人復(fù)核。數(shù)據(jù)錄入結(jié)束后，所有原始數(shù)據(jù)統(tǒng)一上報(bào)國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同檢測(cè)方法之間比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、研究對(duì)象基本情況

本次研究共納入疑似結(jié)核病患者944例，確診的結(jié)核病患者為755例，滿(mǎn)足本次研究預(yù)設(shè)的結(jié)核病患者樣本量要求（n=150）（表1）。健康對(duì)照組納入110名，107名TB-SA抗體檢測(cè)為陰性，特異度為97.3%（95%CI=94.3%～100.3%）。

二、培養(yǎng)的質(zhì)量控制

總的涂陽(yáng)培陰率為4.7%（9/193），河南的評(píng)估現(xiàn)場(chǎng)涂陽(yáng)培陰率為9.6%（5/52），總的污染率及各實(shí)驗(yàn)室的污染率均低于5%（表2）。

三、TB-SA抗體檢測(cè)法在臨床診斷結(jié)核病患者中的敏感度和特異度

在755例確診結(jié)核病患者中，TB-SA抗體檢測(cè)法陽(yáng)性率為74.8%（565/755，95%CI=71.7%～77.9%），遠(yuǎn)高于涂片陽(yáng)性率25.6%（193/755，95%CI= 22.5%～28.7%）和培養(yǎng)陽(yáng)性率39.6%（299/755，95%CI=36.1%～43.1%）（χ2=190.12，P＜0.0001）。TB-SA抗體檢測(cè)法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.3%（95%CI= 90.2%～94.4%），在所有非結(jié)核病患者群（包括健康人和非結(jié)核其他肺部疾病患者）中的特異度為84.2%（95%CI=80.1%～88.3%）（表3）。

表1 各項(xiàng)目點(diǎn)研究對(duì)象分類(lèi)統(tǒng)計(jì)

表2 各項(xiàng)目點(diǎn)培養(yǎng)操作的質(zhì)量控制情況

表3 各項(xiàng)目點(diǎn)采用TB-SA抗體檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)核病的敏感度和特異度

四、TB-SA抗體檢測(cè)法檢測(cè)培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)核病患者的敏感度

TB-SA抗體檢測(cè)法在培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)核病患者中的陽(yáng)性檢出率為88.5%（95%CI=84.8%～92.2%），3個(gè)研究現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果的敏感度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.533，P=0.766＞0.05），見(jiàn)表4。

五、TB-SA抗體檢測(cè)法檢測(cè)菌陰結(jié)核病患者的敏感度

TB-SA抗體檢測(cè)法對(duì)菌陰活動(dòng)性結(jié)核病患者的敏感度為68.0%（95%CI=63.7%～72.3%），和平區(qū)結(jié)核病控制中心和臥龍區(qū)結(jié)核病防治中心的檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.21，P＜0.05），見(jiàn)表5。

討 論

我國(guó)結(jié)核病疫情顯示“菌陰”肺結(jié)核患者占大多數(shù)，無(wú)癥狀患者比例明顯增加［4］，臨床診斷的難度逐步增大。TB-SA抗體檢測(cè)法采用體外表達(dá)純化的結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗原，通過(guò)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中特異性抗體用于結(jié)核病診斷。國(guó)內(nèi)早期研究結(jié)果顯示，TB-SA抗體檢測(cè)法陽(yáng)性率高于細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法，敏感度高于70%，特異度高于85%［5-6］。

本研究在國(guó)內(nèi)3個(gè)區(qū)（縣）結(jié)核病診療單位開(kāi)展，6個(gè)月內(nèi)連續(xù)納入944例肺結(jié)核可疑癥狀者，同時(shí)進(jìn)行結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查、影像學(xué)檢查及TB-SA抗體檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者755例。發(fā)現(xiàn)患者比例較高主要是由于山東和河南研究現(xiàn)場(chǎng)納入患者中確診結(jié)核病的患者比例過(guò)高引起，與當(dāng)?shù)鼗颊呓?jīng)過(guò)綜合醫(yī)院篩查后轉(zhuǎn)入結(jié)核病診療單位就診有關(guān)。755例患者中，TB-SA抗體檢測(cè)陽(yáng)性565例，陽(yáng)性率為74.8%，明顯高于涂片檢查（25.6%）和培養(yǎng)檢查（39.6%）。在所有非結(jié)核患者中，檢測(cè)特異度為84.2%。在培養(yǎng)陽(yáng)性患者中，TB-SA抗體檢測(cè)的敏感度可達(dá)88.5%，即使是在菌陰活動(dòng)性結(jié)核病患者中，TB-SA抗體檢測(cè)的陽(yáng)性率仍接近70%（68.0%）。

表4 各項(xiàng)目點(diǎn)采用TB-SA抗體檢測(cè)法檢測(cè)培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)核病患者的敏感度

表5 各項(xiàng)目點(diǎn)采用TB-SA抗體檢測(cè)法檢測(cè)菌陰結(jié)核病患者的敏感度

陽(yáng)性預(yù)測(cè)值可以反映一個(gè)檢測(cè)方法結(jié)果為陽(yáng)性的可信度。本研究中，TB-SA抗體檢測(cè)總的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.3%，河南研究現(xiàn)場(chǎng)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值最高（97.8%），山東研究現(xiàn)場(chǎng)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為89.6%，天津研究現(xiàn)場(chǎng)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為88.7%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值不同的原因是由于不同研究現(xiàn)場(chǎng)門(mén)診患者中結(jié)核病患者的比例不同所致。即使是在門(mén)診患者中結(jié)核病患者比率為60%的診療機(jī)構(gòu)，TB-SA抗體檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值仍然可以達(dá)到85%以上，對(duì)不易取得標(biāo)本的結(jié)核病及菌陰肺結(jié)核的診斷具有較高的價(jià)值。

PPD作為人群中篩查疑似結(jié)核病患者的方法，在我國(guó)廣泛用于健康體檢，并作為結(jié)核病診斷的輔助指標(biāo)［7］。由于卡介苗在我國(guó)列入兒童計(jì)劃免疫程序，人群中PPD陽(yáng)性率普遍較高，特異度不高，且患者需要在2 d后返回觀察結(jié)果。本研究納入的110名健康人群中，TB-SA抗體檢測(cè)陽(yáng)性?xún)H為3例，特異度高達(dá)97.3%，且方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、可直接出檢測(cè)結(jié)果，適用于健康體檢。

本研究中，25.2%的結(jié)核病患者TB-SA檢測(cè)陰性，考慮與不同個(gè)體免疫水平有關(guān)；或患者正處于臨床感染的初期，結(jié)核分枝桿菌抗體的產(chǎn)生處在“窗口期”，可表現(xiàn)為抗體檢測(cè)陰性［8］。在189例非結(jié)核病的可疑患者中 （可能患有其他肺部疾病），TB-SA陽(yáng)性44例，可能與我國(guó)是結(jié)核病高疫情國(guó)家有關(guān)，不排除受試者感染結(jié)核分枝桿菌引起血液中相關(guān)抗體存在的可能（即潛伏感染者），也可能由于非結(jié)核呼吸系統(tǒng)疾患導(dǎo)致機(jī)體免疫應(yīng)答紊亂。對(duì)于這部分患者，筆者將繼續(xù)跟蹤觀察。

［1］Streeton JA，Desem N，Jones SL.Sensitivity and specificity of a gamma intercferon blood test for tuberculosis infection.Int J Tuberc Lung Dis，1998，2（6）：443-450.

［2］Mazen TS，John TB.Secretion of an acid phosphatase（Sap M）by Mycobacterium tuberculosis that is similar to eukaryotic acid phosphatses.Bacteriol，2000，182（23）：6850-6853.

［3］中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專(zhuān)業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程.北京：中國(guó)教育文化出版社，2006.

［4］全國(guó)第五次結(jié)核病流行學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告.中國(guó)防癆雜志，2012，34（8）：495-505.

［5］王海英，于春寶，王燕，等.TB-SA抗體檢測(cè)對(duì)結(jié)核病臨床診斷價(jià)值的研究.中國(guó)防癆雜志，2008，30（1）：33-36.

［6］高孟秋，初乃惠，王海英，等.結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白抗體檢測(cè)在結(jié)核病診斷中的價(jià)值.中華結(jié)核和呼吸雜志，2007，30 （12）：918-920.

［7］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部疾病控制司.初治涂陰活動(dòng)性肺結(jié)核患者免費(fèi)治療管理指南（試行）.中華結(jié)核病和呼吸雜志，2005，28（10）：667-669.

［8］趙慶蓉，羅濤，朱帆，等.血清結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體在結(jié)核病診斷中的臨床價(jià)值.華西藥學(xué)雜志，2007，22（5）：591-593.

The application research of tuberculosis specific antigen（TB-SA）antibody detection kit in the diagnosis of tuberculosis

LI Qiang，ZHAO Bing，XIA Hui，OU Xi-chao，F(xiàn)U Yan-yong，WANG Xie-xiu，WANG Hai-ying，PENG Lin，LI Hui，ZHAO Yan-lin. National Reference Tuberculosis Laboratory，National Center for Tuberculosis Control and Prevention，National Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China

WANG Xie-xiu，Email：wjsttigo@126.com；ZHAO Yan-lin，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To evaluate the value of tuberculosis specific antigen（TB-SA）antibody detection kit in the diagnosis of tuberculosis.Methods Nine hundred and forty-four pulmonary tuberculosis suspects were continually recruited from April 2012 to October 2012 in 3 district's TB centers from Tianjin city，Shandong province and Henan province，respectively，110 healthy people were enrolled at the same time.Sputum and serum specimen from all cases were collected for Ziehl-Neelsen staining smear，traditional mycobacterium culture and TB-SA antibody test.PPD skin test and chest X-ray were also examined to all cases.The data were entered separately by 2 people in sites and analyzed by national TB reference laboratory.Results Among 755 active TB patients，the positive rate of TB-SA antibody test were 74.8%（565/755，95%CI：71.7%-77.9%），significantly higher than smear（25.6%，193/755，χ2=366.59，P＜0.0001）and culture（39.6%，299/755，χ2=190.12，P＜0.0001）；its specificity and positive predictive value were 97.3%（95%CI：94.3%-100.3%）and 92.3%（95%CI：90.2%-94.4%），respectively.Among culture-positive TB patients，the sensitivity of TB-SA antibody test was 88.5%（95%CI：84.8%-92.2%）.However，the sensitivity of TB-SA antibody test was 68.0%（95%CI：63.7%-72.3%）among smear-and culture-negative TB patients.Conclusion TB-SA antibody test has significantly higher positive rate than smear and conventional culture，and can be used for the diagnosis of TB patient especially smear-and culturenegative TB patients.In addition，it can be used for healthy screening examination.

Tuberculosis，pulmonary/diagnosis； Bacterial proteins； Antibodies，bacterial； Reagent kits，diagnostic

2013-07-14）

（本文編輯：范永德）

中國(guó)防癆協(xié)會(huì)結(jié)核病診斷技術(shù)評(píng)估項(xiàng)目（20120401）

102206北京，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室（李強(qiáng)、趙冰、夏輝、歐喜超、趙雁林）；天津市結(jié)核病控制中心（傅衍勇、王擷秀）；山東省結(jié)核病防治所漢光實(shí)驗(yàn)室（王海英）；山東省煙臺(tái)市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科（彭琳）；河南省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病控制科（李輝）

王擷秀，Email：wjsttigo@126.com；趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org