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    寧夏回族自治區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因分型及與耐藥性關(guān)系的研究

    2013-07-26 08:30:10王曉平逄宇趙曉王曉林王玉峰肖慧霞王福銳劉曉妮趙雁林
    中國防癆雜志 2013年9期
    關(guān)鍵詞:結(jié)核分型寧夏

    王曉平 逄宇 趙曉 王曉林 王玉峰 肖慧霞 王福銳 劉曉妮 趙雁林

    ·論 著 ·

    寧夏回族自治區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因分型及與耐藥性關(guān)系的研究

    王曉平 逄宇 趙曉 王曉林 王玉峰 肖慧霞 王福銳 劉曉妮 趙雁林

    目的 利用間隔區(qū)寡核苷酸分型(Spoligotyping)方法對寧夏回族自治區(qū)(簡稱“寧夏”)結(jié)核分枝桿菌流行株進(jìn)行分型研究,并分析北京基因型與耐藥性的相互關(guān)系。方法 搜集寧夏結(jié)核分枝桿菌臨床分離株115株,應(yīng)用Spoligotyping方法進(jìn)行基因分型研究,采用BioNumerics軟件將分型結(jié)果進(jìn)行基因聚類分析。應(yīng)用比例法藥物敏感性試驗對115株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測,最后將藥敏結(jié)果結(jié)合基因型及流行病學(xué)資料進(jìn)行分析。采用卡方檢驗比較不同組間結(jié)果的差異。結(jié)果 在分離培養(yǎng)的115株菌株中,具有特異Spoligotyping指紋圖譜的北京基因型菌株90株,占78.3%(90/115),25株為非北京基因型,占21.7%(25/115)。90株北京基因型菌株中,41株為古代基因型(45.6%,41/90),任意耐藥株為16株(17.8%,16/90);49株為現(xiàn)代基因型(54.4%,49/90),任意耐藥株為33株(36.7%,33/90),兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.27,P>0.05)。結(jié)論 寧夏結(jié)核分枝桿菌以北京基因型流行為主,結(jié)核分枝桿菌北京基因型與耐藥性之間無明顯相關(guān)性。

    分枝桿菌,結(jié)核; 基因型; 抗藥性,細(xì)菌; 基因分型技術(shù); 寧夏[回族自治區(qū)]

    結(jié)核病疫情的不斷蔓延是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一,我國屬于全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[1]。目前結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學(xué)研究已廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的暴發(fā)和流行,結(jié)核分枝桿菌基因分型技術(shù)在結(jié)核病流行病學(xué)方面顯示了其獨(dú)特的作用,尤其是1995年Van Soolingen等[2]研究發(fā)現(xiàn)中國獨(dú)特的北京基因型家族后,引起了全世界的高度關(guān)注?,F(xiàn)階段用于結(jié)核分枝桿菌基因分型的方法主要有插入序列6110限制性片段多態(tài)性(RFLP)、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)、間隔區(qū)寡核苷酸分型(Spoligotyping)等,其中Spoligotyping方法能很快區(qū)分北京家族和非北京家族,操作簡單,可直接檢測臨床標(biāo)本[3-5]。本研究采用Spoligotyping方法對寧夏回族自治區(qū)(簡稱“寧夏”)115株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了基因分型研究,并進(jìn)行了藥物敏感性實(shí)驗,以初步了解寧夏地區(qū)基因分型情況及其與耐藥性的相互關(guān)系,分析結(jié)核分枝桿菌的耐藥性特點(diǎn)及其與分子流行病學(xué)的聯(lián)系。

    材料和方法

    一、材料

    1.菌株:115株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株均來自寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院就診患者,連續(xù)納入2012年11月至2013年6月具有寧夏戶籍,就診時標(biāo)本培養(yǎng)陽性的患者,背景資料情況見表1。由寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院參比室所分離培養(yǎng)并進(jìn)行菌種鑒定。H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株由中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心提供。

    表1 寧夏地區(qū)115株臨床分離結(jié)核分枝桿菌菌株的背景資料統(tǒng)計表

    2.主要試劑:2×PCR混合體系(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);所用引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成);DNA分子標(biāo)記(DNA Marker)(北京博邁德科技發(fā)展有限公司);帶有間隔寡核苷酸序列探針的膜(Biodyne C膜)(美國Pall Biosupport公司);鏈霉親和素過氧化物酶和顯影定影檢測液(CDP-star)(美國GE公司)。

    二、方法

    (一)Spoligotyping分型方法

    1.DNA提?。河蒙睇}水將結(jié)核分枝桿菌從羅氏培養(yǎng)基(L-J培養(yǎng)基)的斜面上洗脫,80℃孵育30 min滅活,再于沸水中煮沸30 min;離心半徑10 cm,12 000 r/min離心3 min,取上清即為DNA模板,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.PCR擴(kuò)增:用一對引物擴(kuò)增整個DR區(qū),上下游引物均為18個核苷酸,引物序列為DRa:5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′;DRb 5′-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3′。5′端進(jìn)行生物素標(biāo)記。PCR反應(yīng)條件:96℃3 min;96℃1 min,55℃1 min,72℃30 s,35個循環(huán);延伸5 min。IS6110擴(kuò)增引物:MDR-6,5′-CCAGATATCGGGTGTGTCGAC-3′;MDR-6r,5′-TGCCGTTGTCGAAATCTAAACCC-3′。

    3.Biodyne C膜的制備:Biodyne C膜標(biāo)記43個共價結(jié)合寡核苷酸探針,每一個寡核苷酸對應(yīng)DR位點(diǎn)間惟一的間隔區(qū)序列。其中6個間隔區(qū)序列源自M.bovis BCG的DR區(qū)域序列,其余的全部源自結(jié)核分枝桿菌H37Rv的DR區(qū)域序列。先用新鮮配置的16%碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)孵育膜15 min以使膜活化,放在迷你轉(zhuǎn)漬槽(miniblotter,美國Immunetics公司生產(chǎn))中,平行加入150μl用0.5 mol NaHCO3(p H值為8.4)稀釋的0.125μmol寡核苷酸溶液,室溫孵育1 h。將膜從miniblotter中取出,并用0.1 mol NaOH孵育10 min,再用0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)緩沖液于50℃孵育10 min,然后用20 mmol乙二胺四乙酸(EDTA)室溫孵育15 min,密封于塑料袋中置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    4.PCR產(chǎn)物的雜交與檢測:用0.1%SDS緩沖液于50℃洗膜5 min,將膜置于miniblotter凹槽中,方向與制備雜交膜垂直。將稀釋的PCR產(chǎn)物100℃加熱變性10 min,然后立即放到0℃冰上,加到凹槽中,55℃雜交60 min。取出膜,用2倍的氯化鈉-檸檬酸鈉/0.5%SDS洗液(2×SSPE/0.5% SDS)于55℃洗膜2次,每次10 min。然后將辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈球菌親和素2.5μl加到10 ml 2×SSPE/0.5%SDS中,于42℃孵育膜30 min。洗膜并將雜交的DNA用CDP-star檢測,X線片曝光5 min。

    (二)古代基因型和現(xiàn)代基因型PCR擴(kuò)增和電泳方法

    本實(shí)驗以北京家族為模板,以MDR-6、MDR-6r為正反向引物進(jìn)行擴(kuò)增,1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,凝膠成像儀進(jìn)行分析,PCR產(chǎn)物片段大小在1500 bp左右為現(xiàn)代基因型,300 bp為古代基因型。

    (三)藥物敏感性實(shí)驗和菌種鑒定

    藥物敏感性實(shí)驗和菌種鑒定按照文獻(xiàn)[6]操作。其中藥物敏感性實(shí)驗按照比例法進(jìn)行操作,培養(yǎng)基藥物終濃度為:異煙肼0.2μg/ml,利福平40μg/ml,鏈霉素4μg/ml,乙胺丁醇2μg/ml。

    (四)瓊脂糖凝膠電泳

    瓊脂糖加水配制成1.5%的凝膠,冷卻加10μl核酸染料Gold View,搖勻后倒板。待凝膠凝固后放入電泳槽,每孔加入5μl樣品和相應(yīng)DNA Marker,200 V電泳1 h。將電泳完的凝膠放入凝膠成像儀中成像,保存照片并分析。

    (五)相關(guān)定義

    結(jié)核分枝桿菌北京基因型的定義,具有相同的Spoligotyping結(jié)果,表現(xiàn)為僅與35~43位點(diǎn)之間的9個間隔區(qū)雜交呈不同程度的信號。

    (六)數(shù)據(jù)分析

    基因分型的數(shù)據(jù)在Microsoft Excel電子表格中表述為二進(jìn)制格式,藥敏實(shí)驗數(shù)據(jù)用二進(jìn)制格式進(jìn)行描述。所有Spoligotyping數(shù)據(jù)提交至國際數(shù)據(jù)庫MIRU-VNTRplus和SpolDB 4.0[7-8]。用BioNumerics(version 5.0)數(shù)據(jù)軟件對雜交模式進(jìn)行基因聚類分析,統(tǒng)計學(xué)分析采用卡方檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1.寧夏地區(qū)不同基因型菌株的組成:本研究共納入寧夏地區(qū)各個市、縣115株結(jié)核分枝桿菌,其中北京基因型90株,占78.3%,非北京基因型25株,占21.7%,67.8%(78/115)的菌株成簇,北京基因型是目前寧夏主要流行株。北京基因型菌株中,92.2%(83/90)為典型北京基因型,7.8%(7/90)為非典型北京基因型。其中非北京基因型包括T1基因型9株,占7.8%,MANU2基因型3株,占2.6%,U型基因型1株,占0.9%,新發(fā)現(xiàn)的基因型12株,占10.4%(圖1)。

    圖1 結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping基因分型聚類分析圖

    表2 不同基因型結(jié)核分枝桿菌對一線抗結(jié)核藥物的耐藥情況

    表3 古代基因型和現(xiàn)代基因型對一線抗結(jié)核藥物的耐藥情況

    表4 115株結(jié)核分枝桿菌的基因型與年齡之間的關(guān)系(例)

    2.基因型與耐藥表型的關(guān)系:本研究有115株獲得基因分型研究,全部獲得完整的藥敏實(shí)驗結(jié)果。北京基因型中耐異煙肼16株,占總分離株的13.9%;耐利福平10株,占總分離株的8.7%;耐鏈霉素17株,占總分離株的14.8%;耐乙胺丁醇6株,占總分離株的5.2%。非北京基因型中耐異煙肼3株,占總分離株的2.6%;耐利福平2株,占總分離株的1.7%;耐鏈霉素5株,占總分離株的4.3%;沒有耐乙胺丁醇株。本實(shí)驗結(jié)果表明,北京基因型與4種一線抗結(jié)核藥物耐藥情況并無直接關(guān)系,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

    3.古代基因型和現(xiàn)代基因型與耐藥表型的關(guān)系:本次實(shí)驗以90株北京基因型為模板。古代基因型有41株(35.7%),其中耐異煙肼5株,占總分離株的4.3%;耐利福平3株,占總分離株的2.6%;耐鏈霉素7株,占總分離株的6.1%;耐乙胺丁醇1株,占總分離株的0.9%?,F(xiàn)代基因型有49株(42.6%),其中耐異煙肼11株,占總分離株的9.6%;耐利福平7株,占總分離株的6.1%;耐鏈霉素10株,占總分離株的8.7%;耐乙胺丁醇5株,占總分離株的4.3%,古代基因型與現(xiàn)代基因型對異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

    4.北京基因型與年齡、性別的關(guān)系:北京基因型的菌株與非北京基因型的菌株在各個年齡分布上的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.91,P>0.05);北京基因型菌株中,男性患者占61.1%(55/90),女性患者占38.9%(35/90),兩者間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 0.34,P>0.05)(表4、5)。

    表5 115株結(jié)核分枝桿菌的基因型與性別之間的關(guān)系(例)

    討 論

    一、寧夏地區(qū)基因型分布情況

    寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院是寧夏惟一一所能進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌藥敏實(shí)驗的醫(yī)院,且本研究采用連續(xù)不間斷方式連續(xù)納入標(biāo)本,因此樣本具有一定的代表性。所獲得的結(jié)核分枝桿菌兩種基因分型結(jié)果提示,北京基因型(含非典型北京家族)所占比例達(dá)78.3%(90/115),表現(xiàn)為僅與35~43位點(diǎn)之間的9個間隔區(qū)呈陽性雜交反應(yīng)[其中包括7株菌株在35~43之間有出現(xiàn)1個或2個位點(diǎn)呈陰性反應(yīng),稱為非典型北京家族或北京樣基因型(Beijinglike)],與其他地區(qū),如天津(91.7%)、西藏(90.63%)、吉林(89.9%)、黑龍江(89.5%)和上海(89%)等結(jié)果相近[9]。非北京基因型比率為21.7%(25/115),可見北京基因型結(jié)核分枝桿菌在寧夏地區(qū)臨床結(jié)核病患者中呈較高水平的流行。115株菌株中,67.8%的菌株成簇,成簇率較高,且大部分成簇于北京基因型。北京基因型菌株中,92.2%(83/90)為典型北京基因型,7.8%(7/90)為非典型北京基因型。而非北京基因型菌株表現(xiàn)為明顯的基因多態(tài)性[10-12]。

    二、寧夏地區(qū)古代基因型和現(xiàn)代基因型分布情況

    北京基因型可分為古代北京基因型和現(xiàn)代北京基因型,在本研究中,古代基因型有41株(35.7%),現(xiàn)代基因型有49株(42.6%),現(xiàn)代基因型略高于古代基因型,兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義,此次研究與文獻(xiàn)報道的現(xiàn)代型北京基因型菌株為我國主要流行的菌株,而古代型北京基因型菌株主要盛行在東南亞、印度及東非地區(qū)有一些出入[13-14],可能與本研究采用的樣本量較少有關(guān),在以后的研究中還要擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步研究。

    三、基因型與耐藥情況分析

    由于耐多藥北京基因型菌株多次引起暴發(fā)性流行,使得北京基因型菌株與耐藥之間的關(guān)系成為了研究的熱點(diǎn)[13],但研究結(jié)果有差異。有些文獻(xiàn)報道,北京基因型菌株耐藥率高于非北京基因型菌株[15],也有文獻(xiàn)報道,北京基因型菌株與非北京基因型菌株耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義[16],與其他地區(qū),如四川、新疆、河南等地報道的差異無統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果相近[17-19]。本研究結(jié)果顯示,寧夏地區(qū)北京基因型菌株的任意耐一線抗結(jié)核藥耐藥率與非北京基因型菌株的耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義,不支持北京基因型菌株更易產(chǎn)生耐藥的推斷。本研究還發(fā)現(xiàn),寧夏地區(qū)北京基因型菌株的傳播力在各年齡段、性別上的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,不能證明在寧夏地區(qū)北京基因型菌株的流行在年齡、性別上有所差異。

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    Genotyping and drug resistance analysis of Mycobacterium tuberculosis in Ningxia


    WANG Xiao-ping*,PANG Yu,ZHAO Xiao,WANG Xiao-lin,WANG Yu-feng,XIAO Hui-xia,WANG Fu-rui,LIU Xiao-ni,ZHAO Yan-lin.*Tuberculosis Reference Department,the Fourth Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region,Yinchuan 750021,China Corresponding author:ZHAO Yan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

    Objective To study the relationship between genotype and drug resistance of M.tuberculosis representative strains in Ningxia,and to investigate their molecular epidemiological characteristics.Methods One hundred and fifteen M.tuberculosis clinical isolates were collected in Ningxia,and analyzed their genotypes by spoligotyping and drug susceptibility by the proportional method.The chi-square test was used to compare the differences among the results of different groups.Results Of 115 M.tuberculosis isolates,90(78.3%)isolates belonged to Beijing genotype,25(21.7%)isolates belonged to non-Beijing genotype.Of 90 Beijing genotype isolates,41 (45.6%)isolates belonged to the ancient genotype,in which drug-resistant rate was 17.8%(16/90);49(54.4%)isolates belonged to the modern genotype,in which drug-resistant rate was 36.7%(33/90).There were no significant difference of drug resistances between different genotypes(χ2=1.27,P>0.05).Conclusion M.tuberculosis Beijing genotype was the predominant in Ningxia.There was no significant relationship between Beijing genotype and drug resistance.

    Mycobacterium tuberculosis; Genotype; Drug resistance,bacterial; Genotyping techniques;Ningxia

    2013-07-22)

    (本文編輯:郭萌)

    寧夏自然科學(xué)基金(NZ1299)

    750021銀川,寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院結(jié)核病參比室(王曉平、趙曉、王曉林、肖慧霞、王福銳、劉曉妮);中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實(shí)驗室(逄宇、王玉峰、趙雁林)

    趙雁林,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

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