• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    寧夏回族自治區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因分型及與耐藥性關(guān)系的研究

    2013-07-26 08:30:10王曉平逄宇趙曉王曉林王玉峰肖慧霞王福銳劉曉妮趙雁林
    中國防癆雜志 2013年9期
    關(guān)鍵詞:結(jié)核分型寧夏

    王曉平 逄宇 趙曉 王曉林 王玉峰 肖慧霞 王福銳 劉曉妮 趙雁林

    ·論 著 ·

    寧夏回族自治區(qū)結(jié)核分枝桿菌基因分型及與耐藥性關(guān)系的研究

    王曉平 逄宇 趙曉 王曉林 王玉峰 肖慧霞 王福銳 劉曉妮 趙雁林

    目的 利用間隔區(qū)寡核苷酸分型(Spoligotyping)方法對寧夏回族自治區(qū)(簡稱“寧夏”)結(jié)核分枝桿菌流行株進(jìn)行分型研究,并分析北京基因型與耐藥性的相互關(guān)系。方法 搜集寧夏結(jié)核分枝桿菌臨床分離株115株,應(yīng)用Spoligotyping方法進(jìn)行基因分型研究,采用BioNumerics軟件將分型結(jié)果進(jìn)行基因聚類分析。應(yīng)用比例法藥物敏感性試驗對115株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測,最后將藥敏結(jié)果結(jié)合基因型及流行病學(xué)資料進(jìn)行分析。采用卡方檢驗比較不同組間結(jié)果的差異。結(jié)果 在分離培養(yǎng)的115株菌株中,具有特異Spoligotyping指紋圖譜的北京基因型菌株90株,占78.3%(90/115),25株為非北京基因型,占21.7%(25/115)。90株北京基因型菌株中,41株為古代基因型(45.6%,41/90),任意耐藥株為16株(17.8%,16/90);49株為現(xiàn)代基因型(54.4%,49/90),任意耐藥株為33株(36.7%,33/90),兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.27,P>0.05)。結(jié)論 寧夏結(jié)核分枝桿菌以北京基因型流行為主,結(jié)核分枝桿菌北京基因型與耐藥性之間無明顯相關(guān)性。

    分枝桿菌,結(jié)核; 基因型; 抗藥性,細(xì)菌; 基因分型技術(shù); 寧夏[回族自治區(qū)]

    結(jié)核病疫情的不斷蔓延是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一,我國屬于全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[1]。目前結(jié)核分枝桿菌的分子流行病學(xué)研究已廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的暴發(fā)和流行,結(jié)核分枝桿菌基因分型技術(shù)在結(jié)核病流行病學(xué)方面顯示了其獨(dú)特的作用,尤其是1995年Van Soolingen等[2]研究發(fā)現(xiàn)中國獨(dú)特的北京基因型家族后,引起了全世界的高度關(guān)注?,F(xiàn)階段用于結(jié)核分枝桿菌基因分型的方法主要有插入序列6110限制性片段多態(tài)性(RFLP)、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)、間隔區(qū)寡核苷酸分型(Spoligotyping)等,其中Spoligotyping方法能很快區(qū)分北京家族和非北京家族,操作簡單,可直接檢測臨床標(biāo)本[3-5]。本研究采用Spoligotyping方法對寧夏回族自治區(qū)(簡稱“寧夏”)115株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了基因分型研究,并進(jìn)行了藥物敏感性實(shí)驗,以初步了解寧夏地區(qū)基因分型情況及其與耐藥性的相互關(guān)系,分析結(jié)核分枝桿菌的耐藥性特點(diǎn)及其與分子流行病學(xué)的聯(lián)系。

    材料和方法

    一、材料

    1.菌株:115株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株均來自寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院就診患者,連續(xù)納入2012年11月至2013年6月具有寧夏戶籍,就診時標(biāo)本培養(yǎng)陽性的患者,背景資料情況見表1。由寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院參比室所分離培養(yǎng)并進(jìn)行菌種鑒定。H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株由中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心提供。

    表1 寧夏地區(qū)115株臨床分離結(jié)核分枝桿菌菌株的背景資料統(tǒng)計表

    2.主要試劑:2×PCR混合體系(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司);所用引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成);DNA分子標(biāo)記(DNA Marker)(北京博邁德科技發(fā)展有限公司);帶有間隔寡核苷酸序列探針的膜(Biodyne C膜)(美國Pall Biosupport公司);鏈霉親和素過氧化物酶和顯影定影檢測液(CDP-star)(美國GE公司)。

    二、方法

    (一)Spoligotyping分型方法

    1.DNA提?。河蒙睇}水將結(jié)核分枝桿菌從羅氏培養(yǎng)基(L-J培養(yǎng)基)的斜面上洗脫,80℃孵育30 min滅活,再于沸水中煮沸30 min;離心半徑10 cm,12 000 r/min離心3 min,取上清即為DNA模板,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.PCR擴(kuò)增:用一對引物擴(kuò)增整個DR區(qū),上下游引物均為18個核苷酸,引物序列為DRa:5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′;DRb 5′-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3′。5′端進(jìn)行生物素標(biāo)記。PCR反應(yīng)條件:96℃3 min;96℃1 min,55℃1 min,72℃30 s,35個循環(huán);延伸5 min。IS6110擴(kuò)增引物:MDR-6,5′-CCAGATATCGGGTGTGTCGAC-3′;MDR-6r,5′-TGCCGTTGTCGAAATCTAAACCC-3′。

    3.Biodyne C膜的制備:Biodyne C膜標(biāo)記43個共價結(jié)合寡核苷酸探針,每一個寡核苷酸對應(yīng)DR位點(diǎn)間惟一的間隔區(qū)序列。其中6個間隔區(qū)序列源自M.bovis BCG的DR區(qū)域序列,其余的全部源自結(jié)核分枝桿菌H37Rv的DR區(qū)域序列。先用新鮮配置的16%碳二亞胺鹽酸鹽(EDAC)孵育膜15 min以使膜活化,放在迷你轉(zhuǎn)漬槽(miniblotter,美國Immunetics公司生產(chǎn))中,平行加入150μl用0.5 mol NaHCO3(p H值為8.4)稀釋的0.125μmol寡核苷酸溶液,室溫孵育1 h。將膜從miniblotter中取出,并用0.1 mol NaOH孵育10 min,再用0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)緩沖液于50℃孵育10 min,然后用20 mmol乙二胺四乙酸(EDTA)室溫孵育15 min,密封于塑料袋中置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    4.PCR產(chǎn)物的雜交與檢測:用0.1%SDS緩沖液于50℃洗膜5 min,將膜置于miniblotter凹槽中,方向與制備雜交膜垂直。將稀釋的PCR產(chǎn)物100℃加熱變性10 min,然后立即放到0℃冰上,加到凹槽中,55℃雜交60 min。取出膜,用2倍的氯化鈉-檸檬酸鈉/0.5%SDS洗液(2×SSPE/0.5% SDS)于55℃洗膜2次,每次10 min。然后將辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈球菌親和素2.5μl加到10 ml 2×SSPE/0.5%SDS中,于42℃孵育膜30 min。洗膜并將雜交的DNA用CDP-star檢測,X線片曝光5 min。

    (二)古代基因型和現(xiàn)代基因型PCR擴(kuò)增和電泳方法

    本實(shí)驗以北京家族為模板,以MDR-6、MDR-6r為正反向引物進(jìn)行擴(kuò)增,1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,凝膠成像儀進(jìn)行分析,PCR產(chǎn)物片段大小在1500 bp左右為現(xiàn)代基因型,300 bp為古代基因型。

    (三)藥物敏感性實(shí)驗和菌種鑒定

    藥物敏感性實(shí)驗和菌種鑒定按照文獻(xiàn)[6]操作。其中藥物敏感性實(shí)驗按照比例法進(jìn)行操作,培養(yǎng)基藥物終濃度為:異煙肼0.2μg/ml,利福平40μg/ml,鏈霉素4μg/ml,乙胺丁醇2μg/ml。

    (四)瓊脂糖凝膠電泳

    瓊脂糖加水配制成1.5%的凝膠,冷卻加10μl核酸染料Gold View,搖勻后倒板。待凝膠凝固后放入電泳槽,每孔加入5μl樣品和相應(yīng)DNA Marker,200 V電泳1 h。將電泳完的凝膠放入凝膠成像儀中成像,保存照片并分析。

    (五)相關(guān)定義

    結(jié)核分枝桿菌北京基因型的定義,具有相同的Spoligotyping結(jié)果,表現(xiàn)為僅與35~43位點(diǎn)之間的9個間隔區(qū)雜交呈不同程度的信號。

    (六)數(shù)據(jù)分析

    基因分型的數(shù)據(jù)在Microsoft Excel電子表格中表述為二進(jìn)制格式,藥敏實(shí)驗數(shù)據(jù)用二進(jìn)制格式進(jìn)行描述。所有Spoligotyping數(shù)據(jù)提交至國際數(shù)據(jù)庫MIRU-VNTRplus和SpolDB 4.0[7-8]。用BioNumerics(version 5.0)數(shù)據(jù)軟件對雜交模式進(jìn)行基因聚類分析,統(tǒng)計學(xué)分析采用卡方檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1.寧夏地區(qū)不同基因型菌株的組成:本研究共納入寧夏地區(qū)各個市、縣115株結(jié)核分枝桿菌,其中北京基因型90株,占78.3%,非北京基因型25株,占21.7%,67.8%(78/115)的菌株成簇,北京基因型是目前寧夏主要流行株。北京基因型菌株中,92.2%(83/90)為典型北京基因型,7.8%(7/90)為非典型北京基因型。其中非北京基因型包括T1基因型9株,占7.8%,MANU2基因型3株,占2.6%,U型基因型1株,占0.9%,新發(fā)現(xiàn)的基因型12株,占10.4%(圖1)。

    圖1 結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping基因分型聚類分析圖

    表2 不同基因型結(jié)核分枝桿菌對一線抗結(jié)核藥物的耐藥情況

    表3 古代基因型和現(xiàn)代基因型對一線抗結(jié)核藥物的耐藥情況

    表4 115株結(jié)核分枝桿菌的基因型與年齡之間的關(guān)系(例)

    2.基因型與耐藥表型的關(guān)系:本研究有115株獲得基因分型研究,全部獲得完整的藥敏實(shí)驗結(jié)果。北京基因型中耐異煙肼16株,占總分離株的13.9%;耐利福平10株,占總分離株的8.7%;耐鏈霉素17株,占總分離株的14.8%;耐乙胺丁醇6株,占總分離株的5.2%。非北京基因型中耐異煙肼3株,占總分離株的2.6%;耐利福平2株,占總分離株的1.7%;耐鏈霉素5株,占總分離株的4.3%;沒有耐乙胺丁醇株。本實(shí)驗結(jié)果表明,北京基因型與4種一線抗結(jié)核藥物耐藥情況并無直接關(guān)系,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

    3.古代基因型和現(xiàn)代基因型與耐藥表型的關(guān)系:本次實(shí)驗以90株北京基因型為模板。古代基因型有41株(35.7%),其中耐異煙肼5株,占總分離株的4.3%;耐利福平3株,占總分離株的2.6%;耐鏈霉素7株,占總分離株的6.1%;耐乙胺丁醇1株,占總分離株的0.9%?,F(xiàn)代基因型有49株(42.6%),其中耐異煙肼11株,占總分離株的9.6%;耐利福平7株,占總分離株的6.1%;耐鏈霉素10株,占總分離株的8.7%;耐乙胺丁醇5株,占總分離株的4.3%,古代基因型與現(xiàn)代基因型對異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇耐藥情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

    4.北京基因型與年齡、性別的關(guān)系:北京基因型的菌株與非北京基因型的菌株在各個年齡分布上的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.91,P>0.05);北京基因型菌株中,男性患者占61.1%(55/90),女性患者占38.9%(35/90),兩者間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 0.34,P>0.05)(表4、5)。

    表5 115株結(jié)核分枝桿菌的基因型與性別之間的關(guān)系(例)

    討 論

    一、寧夏地區(qū)基因型分布情況

    寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院是寧夏惟一一所能進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌藥敏實(shí)驗的醫(yī)院,且本研究采用連續(xù)不間斷方式連續(xù)納入標(biāo)本,因此樣本具有一定的代表性。所獲得的結(jié)核分枝桿菌兩種基因分型結(jié)果提示,北京基因型(含非典型北京家族)所占比例達(dá)78.3%(90/115),表現(xiàn)為僅與35~43位點(diǎn)之間的9個間隔區(qū)呈陽性雜交反應(yīng)[其中包括7株菌株在35~43之間有出現(xiàn)1個或2個位點(diǎn)呈陰性反應(yīng),稱為非典型北京家族或北京樣基因型(Beijinglike)],與其他地區(qū),如天津(91.7%)、西藏(90.63%)、吉林(89.9%)、黑龍江(89.5%)和上海(89%)等結(jié)果相近[9]。非北京基因型比率為21.7%(25/115),可見北京基因型結(jié)核分枝桿菌在寧夏地區(qū)臨床結(jié)核病患者中呈較高水平的流行。115株菌株中,67.8%的菌株成簇,成簇率較高,且大部分成簇于北京基因型。北京基因型菌株中,92.2%(83/90)為典型北京基因型,7.8%(7/90)為非典型北京基因型。而非北京基因型菌株表現(xiàn)為明顯的基因多態(tài)性[10-12]。

    二、寧夏地區(qū)古代基因型和現(xiàn)代基因型分布情況

    北京基因型可分為古代北京基因型和現(xiàn)代北京基因型,在本研究中,古代基因型有41株(35.7%),現(xiàn)代基因型有49株(42.6%),現(xiàn)代基因型略高于古代基因型,兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義,此次研究與文獻(xiàn)報道的現(xiàn)代型北京基因型菌株為我國主要流行的菌株,而古代型北京基因型菌株主要盛行在東南亞、印度及東非地區(qū)有一些出入[13-14],可能與本研究采用的樣本量較少有關(guān),在以后的研究中還要擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步研究。

    三、基因型與耐藥情況分析

    由于耐多藥北京基因型菌株多次引起暴發(fā)性流行,使得北京基因型菌株與耐藥之間的關(guān)系成為了研究的熱點(diǎn)[13],但研究結(jié)果有差異。有些文獻(xiàn)報道,北京基因型菌株耐藥率高于非北京基因型菌株[15],也有文獻(xiàn)報道,北京基因型菌株與非北京基因型菌株耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義[16],與其他地區(qū),如四川、新疆、河南等地報道的差異無統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果相近[17-19]。本研究結(jié)果顯示,寧夏地區(qū)北京基因型菌株的任意耐一線抗結(jié)核藥耐藥率與非北京基因型菌株的耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義,不支持北京基因型菌株更易產(chǎn)生耐藥的推斷。本研究還發(fā)現(xiàn),寧夏地區(qū)北京基因型菌株的傳播力在各年齡段、性別上的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,不能證明在寧夏地區(qū)北京基因型菌株的流行在年齡、性別上有所差異。

    [1]KhuêPM,Truffot-Pernot C,Texier-Maugein J,et al.A 10-year prospective surveillance of Mycobacterium tuberculosis drug resistance in France 1995—2004.Eur Respir J,2007,30(5):937-944.

    [2]Van Soolingen D,Qian L,de Haas PE,et al.Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of East Asia.J Clin Microbiol,1995,33(12):3234-3238.

    [3]梁莉,肖和平.分子分型技術(shù)在結(jié)核病流行病學(xué)研究中的應(yīng)用價值.中國防癆雜志,2003,25(4):270-273.

    [4]王慶,董海燕,包訓(xùn)迪,等.安徽省391株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株MLVA基因分型研究.中國防癆雜志,2013,35(1):17-21.

    [5]郭艷玲,劉洋,王甦民,等.分枝桿菌散在重復(fù)單位對結(jié)核分枝桿菌分型的研究.中國防癆雜志,2009,31(2):80-84.

    [6]Liu JJ,Yao HY,Liu EY.Analysis of factors affecting theepidemiology of tuberculosis in China.Int J Tuberc Lung Dis,2005,9(4):450-454.

    [7]王勝芬,趙雁林,黃海榮,等.結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株與耐藥表型的關(guān)系.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報,2009,31(4):427-431.

    [8]Weniger T,Krawczyk J,Supply P,et al.MIRU-VNTRplus:a web tool for polyphasic genotyping of Mycobacterium tuberculosis complex bacteria.Nucleic Acids Res,2010,38(Web Server issue):W326-331.

    [9]余琴,蘇云開,呂冰,等.內(nèi)蒙古自治區(qū)結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping分型及北京家族分析.中國防癆雜志,2013,35(4):276-281.

    [10]Dong H,Liu Z,Lv B,et al.Spoligotypes of Mycobacterium tuberculosis from different Provinces of China.J Clin Microbiol,2010,48(11):4102-4106.

    [11]曹曉慧,劉志廣,趙秀芹,等.220株結(jié)核分枝桿菌北京臨床分離株的基因分型研究.中國人獸共患病學(xué)報,2008,24(5):412-417.

    [12]Wada T,Iwamoto T,Maeda S.Genetic diversity of the Mycobacterium tuberculosis Beijing family in East Asia revealed through refined population structure analysis.FEMS Microbiol Lett,2009,291(1):35-43.

    [13]Lu B,Zhao P,Liu B,et al.Genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis isolates from Beijing,China assessed by Spoligotyping,LSPs and VNTR profiles.BMC Infect Dis,2012,12:372.

    [14]Gutiérrez MC,Vincent V,Aubert D,et al.Molecular fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis and risk factors for tuberculosis transmission in Paris,F(xiàn)rance,and surrounding area.J Clin Microbiol,1998,36(2):486-492.

    [15]Krüüner A,Hoffner SE,Sillastu H,et al.Spread of drug-resistant pulmonary tuberculosis in Estonia.J Clin Microbiol,2001,39(9):3339-3345.

    [16]van Crevel R,Nelwan RH,de Lenne W,et al.Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype strains associated with febrile response to treatment.Emerg Infect Dis,2001,7(5):880-883.

    [17]陳建,萬康林,楊筠,等.結(jié)核分枝桿菌基因分型及耐藥性分析.成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2008,3(1):10-15.

    [18]綦迎成,劉潔,魚栓民,等.新疆結(jié)核分枝桿菌臨床分離株Spoligotyping基因型的初步研究.疾病監(jiān)測,2010,25(12):951-954.

    [19]趙玉玲,趙東陽,李輝,等.河南省結(jié)核分枝桿菌基因分型與耐藥性分析.臨床檢驗雜志,2011,29(3):231-232.

    Genotyping and drug resistance analysis of Mycobacterium tuberculosis in Ningxia


    WANG Xiao-ping*,PANG Yu,ZHAO Xiao,WANG Xiao-lin,WANG Yu-feng,XIAO Hui-xia,WANG Fu-rui,LIU Xiao-ni,ZHAO Yan-lin.*Tuberculosis Reference Department,the Fourth Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region,Yinchuan 750021,China Corresponding author:ZHAO Yan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

    Objective To study the relationship between genotype and drug resistance of M.tuberculosis representative strains in Ningxia,and to investigate their molecular epidemiological characteristics.Methods One hundred and fifteen M.tuberculosis clinical isolates were collected in Ningxia,and analyzed their genotypes by spoligotyping and drug susceptibility by the proportional method.The chi-square test was used to compare the differences among the results of different groups.Results Of 115 M.tuberculosis isolates,90(78.3%)isolates belonged to Beijing genotype,25(21.7%)isolates belonged to non-Beijing genotype.Of 90 Beijing genotype isolates,41 (45.6%)isolates belonged to the ancient genotype,in which drug-resistant rate was 17.8%(16/90);49(54.4%)isolates belonged to the modern genotype,in which drug-resistant rate was 36.7%(33/90).There were no significant difference of drug resistances between different genotypes(χ2=1.27,P>0.05).Conclusion M.tuberculosis Beijing genotype was the predominant in Ningxia.There was no significant relationship between Beijing genotype and drug resistance.

    Mycobacterium tuberculosis; Genotype; Drug resistance,bacterial; Genotyping techniques;Ningxia

    2013-07-22)

    (本文編輯:郭萌)

    寧夏自然科學(xué)基金(NZ1299)

    750021銀川,寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院結(jié)核病參比室(王曉平、趙曉、王曉林、肖慧霞、王福銳、劉曉妮);中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實(shí)驗室(逄宇、王玉峰、趙雁林)

    趙雁林,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

    猜你喜歡
    結(jié)核分型寧夏
    失眠可調(diào)養(yǎng),食補(bǔ)需分型
    寧夏
    寧夏畫報(2019年5期)2019-09-19 14:42:26
    便秘有多種 治療須分型
    一度浪漫的結(jié)核
    特別健康(2018年4期)2018-07-03 00:38:26
    寧夏煤電博弈
    能源(2017年5期)2017-07-06 09:25:50
    層次分析模型在結(jié)核疾病預(yù)防控制系統(tǒng)中的應(yīng)用
    寧夏
    寧夏畫報(2016年5期)2016-06-28 05:48:08
    基于分型線驅(qū)動的分型面設(shè)計研究
    中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核感染的中醫(yī)辨治思路
    寧夏:首辦立法論辯會
    浙江人大(2014年4期)2014-03-20 16:20:15
    最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲国产精品999在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 黄色视频不卡| 深夜精品福利| 国产真人三级小视频在线观看| 免费看a级黄色片| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 99国产精品99久久久久| 日本三级黄在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 在线观看午夜福利视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 午夜免费观看网址| 国产av一区二区精品久久| 国产主播在线观看一区二区| 乱人伦中国视频| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 国产一区二区激情短视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲成人精品中文字幕电影| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产99久久九九免费精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产单亲对白刺激| 美女 人体艺术 gogo| 嫁个100分男人电影在线观看| 色播亚洲综合网| 99国产精品一区二区蜜桃av| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品国产乱码久久久久久男人| 69av精品久久久久久| 亚洲人成电影观看| 午夜精品在线福利| cao死你这个sao货| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 淫秽高清视频在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看 | 一区二区三区精品91| 香蕉国产在线看| 波多野结衣一区麻豆| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产色视频综合| 后天国语完整版免费观看| 麻豆国产av国片精品| 久9热在线精品视频| 国产av又大| 99在线视频只有这里精品首页| 久久久久国内视频| 国产精品 国内视频| 久久久久久久精品吃奶| 满18在线观看网站| 大型av网站在线播放| 免费搜索国产男女视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 69av精品久久久久久| 国产成人影院久久av| cao死你这个sao货| 电影成人av| www.www免费av| 99香蕉大伊视频| 极品人妻少妇av视频| x7x7x7水蜜桃| 人人妻人人澡人人看| 久久香蕉激情| 人人妻人人澡人人看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 女警被强在线播放| av片东京热男人的天堂| 亚洲一区高清亚洲精品| www国产在线视频色| 成人国语在线视频| 欧美日韩黄片免| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| videosex国产| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美中文综合在线视频| 在线观看舔阴道视频| 老汉色∧v一级毛片| 国产一卡二卡三卡精品| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美日韩福利视频一区二区| 在线播放国产精品三级| 国产精品乱码一区二三区的特点 | videosex国产| 大型av网站在线播放| 两性夫妻黄色片| 亚洲人成电影免费在线| 精品国产一区二区久久| 99久久精品国产亚洲精品| 91麻豆av在线| 国产片内射在线| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 女性被躁到高潮视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲五月色婷婷综合| 久久久久久人人人人人| 欧美日本亚洲视频在线播放| 99re在线观看精品视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲,欧美精品.| 久久香蕉国产精品| 18禁美女被吸乳视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久久国产成人免费| 国产成人一区二区三区免费视频网站| www国产在线视频色| 日韩欧美在线二视频| 国产激情欧美一区二区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日本欧美视频一区| 深夜精品福利| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产成年人精品一区二区| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产91精品成人一区二区三区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲精品在线观看二区| 啦啦啦免费观看视频1| 久久精品91蜜桃| 色在线成人网| 欧美午夜高清在线| 久久精品人人爽人人爽视色| 大型av网站在线播放| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美丝袜亚洲另类 | www.自偷自拍.com| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久久精品欧美日韩精品| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 久久久久久久精品吃奶| 国产av又大| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 午夜福利影视在线免费观看| 少妇 在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲自拍偷在线| 午夜福利欧美成人| 国产精品日韩av在线免费观看 | 岛国在线观看网站| 午夜福利高清视频| 在线观看一区二区三区| 免费高清视频大片| 男女之事视频高清在线观看| tocl精华| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品国产乱子伦一区二区三区| 日韩国内少妇激情av| 丝袜在线中文字幕| 亚洲片人在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 满18在线观看网站| 久久香蕉激情| 欧美国产日韩亚洲一区| 99国产精品99久久久久| 一级a爱视频在线免费观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 变态另类丝袜制服| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 两性夫妻黄色片| 欧美日韩一级在线毛片| 岛国视频午夜一区免费看| videosex国产| 亚洲精品久久国产高清桃花| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美国产日韩亚洲一区| 一级毛片高清免费大全| 色老头精品视频在线观看| 精品电影一区二区在线| 在线观看一区二区三区| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美乱妇无乱码| www.精华液| 成人精品一区二区免费| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲精品一区av在线观看| av欧美777| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日韩av在线大香蕉| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久国产精品人妻蜜桃| 9191精品国产免费久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 精品久久久久久,| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲欧美激情综合另类| 国产高清videossex| 韩国av一区二区三区四区| 老司机靠b影院| 国产主播在线观看一区二区| 久久中文字幕人妻熟女| 99精品久久久久人妻精品| 99久久精品国产亚洲精品| 黄色a级毛片大全视频| 一二三四在线观看免费中文在| av中文乱码字幕在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 色播亚洲综合网| 免费不卡黄色视频| 欧美大码av| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产av在哪里看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产成人影院久久av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 精品久久久久久,| 亚洲av成人av| 51午夜福利影视在线观看| 久久香蕉激情| 午夜久久久久精精品| 免费无遮挡裸体视频| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美日本视频| ponron亚洲| 91精品三级在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 午夜成年电影在线免费观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 在线天堂中文资源库| 亚洲精品久久国产高清桃花| √禁漫天堂资源中文www| 搡老熟女国产l中国老女人| 999久久久国产精品视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一区二区三区精品91| 日本三级黄在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 国产在线观看jvid| 黄频高清免费视频| 国产单亲对白刺激| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲伊人色综图| 久久久久久国产a免费观看| 制服诱惑二区| 日本三级黄在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 美女免费视频网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲人成电影免费在线| 人人澡人人妻人| 在线观看www视频免费| 88av欧美| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲精品国产区一区二| 久久久久久国产a免费观看| 两人在一起打扑克的视频| 看免费av毛片| 欧美中文日本在线观看视频| 欧美日韩精品网址| www.999成人在线观看| 青草久久国产| 看黄色毛片网站| 精品电影一区二区在线| 久久久久久久午夜电影| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美中文综合在线视频| 深夜精品福利| 人成视频在线观看免费观看| 人妻久久中文字幕网| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜影院日韩av| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲免费av在线视频| 国产亚洲精品一区二区www| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品九九99| 精品欧美一区二区三区在线| 中文字幕久久专区| 免费在线观看影片大全网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 一级a爱视频在线免费观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日本a在线网址| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美国产精品va在线观看不卡| 涩涩av久久男人的天堂| 51午夜福利影视在线观看| 精品欧美一区二区三区在线| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产欧美日韩一区二区三| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| aaaaa片日本免费| 亚洲最大成人中文| 一区福利在线观看| 69av精品久久久久久| 久久草成人影院| 午夜激情av网站| 男女午夜视频在线观看| а√天堂www在线а√下载| 欧美另类亚洲清纯唯美| 一级a爱视频在线免费观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 十八禁人妻一区二区| 免费在线观看日本一区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲性夜色夜夜综合| 女人被狂操c到高潮| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 日本 av在线| 在线观看午夜福利视频| 人人澡人人妻人| 亚洲 国产 在线| 久久中文字幕人妻熟女| 美女扒开内裤让男人捅视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久久久久人人人人人| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲人成电影观看| 日韩大尺度精品在线看网址 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 香蕉久久夜色| 最好的美女福利视频网| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 麻豆成人av在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 搡老熟女国产l中国老女人| av欧美777| 午夜福利在线观看吧| 制服人妻中文乱码| 免费在线观看影片大全网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 夜夜夜夜夜久久久久| 老司机在亚洲福利影院| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产在线观看jvid| 国产成人精品久久二区二区91| 久久人人爽av亚洲精品天堂| ponron亚洲| 欧美激情高清一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲成国产人片在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 日日爽夜夜爽网站| 我的亚洲天堂| 一级毛片女人18水好多| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久九九热精品免费| 国产真人三级小视频在线观看| 成年版毛片免费区| 国产精品一区二区在线不卡| 妹子高潮喷水视频| 亚洲,欧美精品.| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 亚洲人成77777在线视频| 国产精品 欧美亚洲| 少妇粗大呻吟视频| 国产伦人伦偷精品视频| 级片在线观看| 不卡一级毛片| 久久中文字幕一级| 久久人妻av系列| 国产成人系列免费观看| 高清毛片免费观看视频网站| 中文字幕久久专区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 91国产中文字幕| 香蕉久久夜色| 他把我摸到了高潮在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 岛国在线观看网站| 欧美黄色片欧美黄色片| av片东京热男人的天堂| 亚洲三区欧美一区| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美大码av| av天堂在线播放| 中亚洲国语对白在线视频| 黄色a级毛片大全视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 在线观看免费视频网站a站| 99香蕉大伊视频| 亚洲国产精品合色在线| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲免费av在线视频| 999久久久精品免费观看国产| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产精品免费视频内射| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲精品在线观看二区| 久久精品91无色码中文字幕| 色播在线永久视频| av视频免费观看在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| av免费在线观看网站| 亚洲精品美女久久av网站| 人妻久久中文字幕网| 亚洲一区二区三区色噜噜| 真人做人爱边吃奶动态| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲av熟女| 窝窝影院91人妻| 婷婷六月久久综合丁香| 国产麻豆成人av免费视频| 黄色成人免费大全| 久久中文字幕一级| 淫妇啪啪啪对白视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产精品综合久久久久久久免费 | 免费在线观看亚洲国产| 久久精品91蜜桃| 欧美成人性av电影在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 久久青草综合色| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 欧美激情 高清一区二区三区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 大型黄色视频在线免费观看| 一级,二级,三级黄色视频| 精品高清国产在线一区| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产97色在线日韩免费| 午夜视频精品福利| 这个男人来自地球电影免费观看| 无限看片的www在线观看| 国产午夜精品久久久久久| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美av亚洲av综合av国产av| 精品熟女少妇八av免费久了| 一边摸一边做爽爽视频免费| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产免费av片在线观看野外av| 夜夜夜夜夜久久久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久久久九九精品影院| 欧美 亚洲 国产 日韩一| av有码第一页| 精品久久久久久久久久免费视频| avwww免费| 欧美黄色淫秽网站| ponron亚洲| 国产精华一区二区三区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲精品一区av在线观看| 大型av网站在线播放| 国内精品久久久久精免费| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 女人被狂操c到高潮| 午夜视频精品福利| 久久九九热精品免费| 一级黄色大片毛片| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| aaaaa片日本免费| 国产精品综合久久久久久久免费 | 伦理电影免费视频| 无遮挡黄片免费观看| 99在线视频只有这里精品首页| 一二三四在线观看免费中文在| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | av免费在线观看网站| 18禁美女被吸乳视频| 一本综合久久免费| 变态另类丝袜制服| 中文字幕最新亚洲高清| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产区一区二久久| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久久久国内视频| 午夜激情av网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品免费一区二区三区在线| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产亚洲精品av在线| av有码第一页| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 他把我摸到了高潮在线观看| 精品久久久久久成人av| 波多野结衣av一区二区av| 两人在一起打扑克的视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 成年人黄色毛片网站| 在线观看www视频免费| 1024视频免费在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲九九香蕉| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 高清毛片免费观看视频网站| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 18禁美女被吸乳视频| 美国免费a级毛片| 久久中文字幕一级| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲片人在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲成人精品中文字幕电影| 老司机午夜十八禁免费视频| 午夜免费成人在线视频| 国产国语露脸激情在线看| 黄色 视频免费看| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲欧美激情在线| 老鸭窝网址在线观看| 韩国av一区二区三区四区| videosex国产| 日日爽夜夜爽网站| 在线免费观看的www视频| 正在播放国产对白刺激| av在线播放免费不卡| 国产亚洲欧美98| 悠悠久久av| 69精品国产乱码久久久| 欧美日韩黄片免| 91国产中文字幕| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 中国美女看黄片| 少妇 在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 超碰成人久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲人成电影免费在线| 欧美不卡视频在线免费观看 | 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 色播亚洲综合网| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 男女之事视频高清在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品国产乱码久久久久久男人| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美激情高清一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲午夜理论影院| 叶爱在线成人免费视频播放| 香蕉久久夜色| 欧美日韩乱码在线| 亚洲国产精品合色在线| 夜夜爽天天搞| 在线观看66精品国产| 高清毛片免费观看视频网站| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 成人av一区二区三区在线看| 国产成人av教育| 亚洲精品一区av在线观看| 女人被狂操c到高潮| avwww免费| 国产大屁股一区二区在线视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 99热这里只有是精品50| 少妇的逼好多水| 波多野结衣巨乳人妻| 欧美性感艳星| 亚洲av五月六月丁香网| 色播亚洲综合网| 熟女电影av网| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲真实伦在线观看| 如何舔出高潮| 久久久久久伊人网av| 国内精品久久久久精免费| 亚洲无线在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 毛片女人毛片| 此物有八面人人有两片| 色av中文字幕| 在线免费观看的www视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 深爱激情五月婷婷| 亚洲av五月六月丁香网|