飼料蛋白水平對低溫應(yīng)激下吉富羅非魚血清生化指標和HSP70 mRNA表達的影響

強 俊 楊 弘 王 輝 徐 跑 何 杰

(1.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心, 農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點實驗室, 無錫 214081;2.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院, 無錫 214081; 3.廣東海洋大學水產(chǎn)學院, 湛江 524025)

在集約化養(yǎng)殖中, 魚類經(jīng)常會應(yīng)對各種脅迫。脅迫可引發(fā)魚體在短期內(nèi)機體平衡調(diào)節(jié)[1], 從而導致生理上的變化。這些生理響應(yīng)可以通過腎上腺素調(diào)節(jié)機制達到增加能量利用、釋放兒茶酚胺以及提高促腎上腺皮質(zhì)激素和血漿皮質(zhì)醇水平[2]。應(yīng)激時間延長可能導致急性應(yīng)激轉(zhuǎn)為慢性脅迫, 使機體的不平衡增多[3]。

在應(yīng)激期內(nèi), 魚類具有較差的抗逆性, 對病原體的易感性較高。如在低溫環(huán)境下, 屈撓細菌可引發(fā)魚類皮膚損害綜合癥[4]; 而車輪蟲病與淋巴囊炎病毒可能在低溫下引發(fā)魚類的白點病[5]。2010年全球羅非魚產(chǎn)量達到 300萬噸, 中國羅非魚產(chǎn)量占全球產(chǎn)量的一半。羅非魚已成為中國南方地區(qū)主要養(yǎng)殖的淡水品種之一。然而, 隨著全球氣候日益惡化與反常, 夏天溫度過高以及冬天溫度過低等, 這對羅非魚的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生了嚴重影響。低溫應(yīng)激可引發(fā)羅非魚肝臟損傷[6]、機體免疫功能下降, 同時,增加海豚鏈球菌的致病性[3]。

魚類的最優(yōu)生長狀態(tài)依賴于飼料的營養(yǎng)狀況,以及魚類的生理狀態(tài)、年齡、繁殖性能以及一些環(huán)境因子(如： 溫度、鹽度等)[7]。魚類在應(yīng)激時的生理變化往往與營養(yǎng)狀況緊密相關(guān)。Atwood,et al.[8]研究發(fā)現(xiàn), 在飼料中添加椰油后, 尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)的低溫應(yīng)激能力明顯高于添加鯡魚油的實驗組。Abdel-Tawwab & Mousa[9]研究發(fā)現(xiàn),飼料中較高的蛋白水平可明顯提高尼羅羅非魚在擁擠脅迫下的應(yīng)激能力。Kiron,et al.[10]研究發(fā)現(xiàn), 最優(yōu)蛋白水平下虹鱒(Oncorhynchus mykiss)抗病毒感染能力明顯高于低蛋白或高蛋白時的。羅非魚屬亞熱帶魚類, 能夠在 6—10℃的低溫水環(huán)境下短時間存活, 低溫耐受性較差[11]。因而, 研究飼料蛋白水平與低溫脅迫的關(guān)系具有重要意義, 有助于預測魚類生理需求方面可能的變化, 以及飼料蛋白水平是否可以改變魚體的抗應(yīng)激能力, 降低脅迫對魚體的影響。本研究選取在3種蛋白水平下(25%、38%和50%)飼養(yǎng)的羅非魚, 采用急性低溫應(yīng)激, 分析應(yīng)激后羅非魚的生理生化響應(yīng), 旨在為吉富羅非魚的高效健康養(yǎng)殖提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

尼羅羅非魚幼魚來自中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興基地自繁的第 16代“吉富”品系,選擇無病無傷, 活力強的個體作為實驗用魚。實驗前在室內(nèi)水泥池(水溫27 ℃ ± 0.3 ℃ , pH 7.4±0.2)中暫養(yǎng)10d, 水體循環(huán)使用, 連續(xù)充氣, 自然光周期。每天 7：00、11：00和 16：00各投喂沉水性飼料1次(粗蛋白質(zhì)為 38.0%、脂肪 8.0%), 投喂量為體重的10%—12%。

1.2 實驗方法

設(shè)置3組不同飼料蛋白水平, 分別為25%、38%和50%, 每組設(shè)3個平行, 飼料成分(表1)。實驗在封閉式水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行, 實驗用魚平均體重為 27.64 (±2.79) g, 體長為 9.43 (±0.46) cm, 每個養(yǎng)殖桶放置30尾魚。實驗共使用9個450 L的養(yǎng)殖桶,每個蛋白水平設(shè)置3組平行。每日投喂3次(7：00、12：00和 17：00), 日投喂量為魚體總重量的 5%—10%。每隔10天測定魚的生長情況, 調(diào)節(jié)投喂量, 養(yǎng)殖周期為 8周, 養(yǎng)殖條件： 水溫 27(±0.3)℃ , pH 7.5±0.2, 溶氧在5.0 mg/L以上, 氨氮和亞硝酸鹽分別不高于0.01 mg/L, 自然光周期, 每天換水1/3。

飼養(yǎng)結(jié)束后, 禁食 24h, 選擇規(guī)格基本一致的魚進行低溫應(yīng)激實驗。從水溫為27℃的桶中選取20尾轉(zhuǎn)入水溫為14℃(水溫低于14℃時, 吉富羅非魚停止攝食并開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象)的相應(yīng)9個450 L養(yǎng)殖桶中, 進行 24h急性低溫應(yīng)激, 用自動控溫系統(tǒng)控溫于14℃, 保證溶氧充足, 實驗期間不投餌, 盡量減少人為干擾。

表1 飼料組分與組成Tab.1 Ingredients and composition of experimental diets

1.3 采樣與制備

分別于0、6、12和24h進行采樣。每個養(yǎng)殖桶隨機選取3尾魚, 用200 mg/L的MS-222作快速深度麻醉, 尾靜脈采血, 血樣于4℃冰箱中靜置2h, 在4 ℃ , 3500 r/min 離心10min制備血清, 上清液移置?80℃冰箱中保存?zhèn)溆? 并取約0.1 g的肝臟組織用液氮速凍后, 于?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標與方法

血清生化指標的測定 皮質(zhì)醇采用羅氏電化學發(fā)光免疫分析儀E170測定, 試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所; 總蛋白、白蛋白、球蛋白、葡萄糖、甘油三脂、膽固醇、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶用羅氏全自動生化分析儀測定, 試劑盒均購自上海駿實生物科技有限公司; 溶菌酶活力的測定采用南京建成生物科技有限公司的試劑盒。

肝臟HSP70 mRNA表達的測定 根據(jù)Genbank中羅非魚 HSP70序列(FJ207463.1), 設(shè)計HSP70引物, F1： CATCGCCTACGGTCTGGACAA,R1： TGCCGTCTTCAATGGTCAGGAT。用羅非魚的管家基因β-actin (EU887951.1)作為內(nèi)參, 設(shè)計β-actin引物, F1： CCACACAGTGCCCATCTACGA,R1： CCACGCTCTGTCAGGATCTTCA。所有引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成, 擴增的片段為100—110 bp, 取羅非魚肝臟20 mg左右, 參照RNeasy Mini Handbook (QIAGEN 公司)說明書用試劑盒提取總RNA,A260/A280為1.90左右。

根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time(大連 TaKaRa公司)進行 RT反應(yīng), 然后采用ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System的SYBR Green滲入法進行實時定量 PCR擴增反應(yīng), 以β-actin為內(nèi)參。PCR反應(yīng)體系(50 μL)包括： 高壓滅菌去離子水 19 μL、SYBR Green PCR Master Mix(2×)25 μL、正向及反向引物(10 μmol/L)各 2 μL、cDNA工作液4 μL。反應(yīng)條件為： 95 ℃ 5 min,然后40個循環(huán)(95 ℃ 1 5s, 60 ℃ 6 0s,讀板記錄熒光量), 反應(yīng)結(jié)束后制備溶解曲線, 反應(yīng)條件為： 95 ℃ 15s,60 ℃ 1 5s, 95 ℃ 1 5s。每個反應(yīng)設(shè)3復孔。所有檢測樣品均包含1個無模板的陰性對照以排除假陽性結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)處理

在HSP70與β-actin的定量PCR擴增效率基本一致的前提下, 計算HSP70 mRNA表達量。以羅非魚β-actin為內(nèi)參, 對得到的各樣品Ct值進行均一化處理, 以25%蛋白水平組0h時的HSP70 mRNA表達量為基準, 應(yīng)用 2?ΔΔCt法[12]確定不同時間點各處理組 mRNA的相對表達量。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標準差(Mean±SD)表示, 實驗數(shù)據(jù)用 SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 低溫應(yīng)激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清皮質(zhì)醇和葡萄糖水平的影響

飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚在低溫應(yīng)激試驗期間, 未發(fā)現(xiàn)死魚。由圖1A可以發(fā)現(xiàn), 低溫應(yīng)激對羅非魚血清皮質(zhì)醇水平有明顯影響。應(yīng)激 6h時,各蛋白水平組呈上升趨勢。應(yīng)激 24h時, 各實驗組血清皮質(zhì)醇水平分別為557.4、709.5和453.7 ng/mL,均顯著低于應(yīng)激6h的水平, 但仍顯著高于應(yīng)激前的水平(P<0.05)。38%蛋白組的皮質(zhì)醇水平在應(yīng)激24h后高于其他實驗組(P<0.05)。

低溫應(yīng)激對羅非魚的血清葡萄糖水平產(chǎn)生了一定的影響(圖1B)。當溫度從27℃突降到14℃時, 25%和 38%蛋白組的葡萄糖水平在應(yīng)激 6h時表現(xiàn)出上升趨勢, 開始較為緩慢, 24h時急劇上升, 分別達到6.05和 4.99 mmol/L(P<0.05); 50%蛋白組的葡萄糖水平呈先下降后上升的變化趨勢, 應(yīng)激 24h時, 葡萄糖水平與應(yīng)激前相比無顯著差異(P>0.05)。

2.2 低溫應(yīng)激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清總蛋白、白蛋白和球蛋白水平的影響

在低溫應(yīng)激下, 25%蛋白組的血清總蛋白水平在應(yīng)激24h內(nèi)呈上升趨勢; 38%和50%蛋白組的總蛋白水平呈先上升后下降的變化趨勢(圖2A)。24h時,各實驗組的血清總蛋白水平與應(yīng)激前相比無顯著差異(P>0.05)。

圖1 不同蛋白水平對吉富羅非魚幼魚在低溫應(yīng)激下血清皮質(zhì)醇(A)和葡萄糖(B)水平的影響Fig.1 Effects of different dietary protein levels on serum cortisol (A) and glucose (B) levels of GIFT tilapia under low temperature stress

血清白蛋白的變化趨勢與總蛋白相似(圖2B)。38%和50%蛋白組的血清白蛋白水平在應(yīng)激6h時達到峰值, 隨后呈逐漸下降趨勢。24h時, 各實驗組的血清白蛋白水平與應(yīng)激前相比無顯著差異(P>0.05)。

圖2 不同蛋白水平對吉富羅非魚幼魚在低溫應(yīng)激下血清總蛋白(A)、白蛋白(B)和球蛋白(C)水平的影響Fig.2 Effects of different dietary protein levels on serum total protein (A), albumin(B) and globulin(C) levels of GIFT tilapia under low temperature stress

隨著應(yīng)激時間的延長, 各實驗組球蛋白水平均呈先上升后下降的變化趨勢(圖2C)。應(yīng)激24h時, 除38%蛋白組的血清球蛋白水平顯著高于應(yīng)激前外(P<0.05), 其他各實驗組與應(yīng)激前相比無顯著差異(P>0.05)。

38%和50%蛋白組的血清白蛋白/球蛋白比值隨著應(yīng)激時間的延長呈下降趨勢(表 2), 應(yīng)激 24h時,顯著低于應(yīng)激前的水平(P<0.05); 25%蛋白組的比值與應(yīng)激前相比無顯著差異(P>0.05)。

表2 不同蛋白水平對吉富羅非魚幼魚在低溫應(yīng)激下血清白蛋白/球蛋白比值的影響Tab.2 The variation of albumin/globulin ratio of GIFT tilapia under low temperature stress during 24h

2.3 低溫應(yīng)激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶活力的影響

應(yīng)激前, 不同蛋白水平下各實驗組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力有顯著差異(圖 3A), 50%蛋白組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力為8.0 U/L顯著高于25%蛋白組的4.67 U/L。各實驗組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力在應(yīng)激24h內(nèi)呈逐漸上升趨勢, 25%蛋白組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力在應(yīng)激24h時顯著高于38%和50%蛋白組(P<0.05)。

應(yīng)激前, 50%蛋白組的血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活力顯著高于25%和38%蛋白組(圖3B)。低溫應(yīng)激后, 各實驗組的谷草轉(zhuǎn)氨酶活力開始顯著上升。24h時,25%和50%蛋白組血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活力低于12h時的活力, 而 38%蛋白組的谷草轉(zhuǎn)氨酶活力與 12h時相比無顯著差異(P>0.05)。

各實驗組堿性磷酸酶活力的變化趨勢與谷草轉(zhuǎn)氨酶活力的基本相同(圖3C)。應(yīng)激24h時, 38%蛋白組血清堿性磷酸酶活力顯著高于應(yīng)激前的水平(P<0.05), 而 25%和 50%蛋白組堿性磷酸酶活力與應(yīng)激前相比無顯著差異(P>0.05)。

2.4 低溫應(yīng)激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清甘油三酯和膽固醇水平的影響

在應(yīng)激前, 隨著飼料蛋白水平上升, 血清甘油三酯水平顯著提高(P<0.05)(圖 4A)。在低溫應(yīng)激后,各實驗組基本呈先下降會上升的變化趨勢。應(yīng)激6h時, 各實驗組血清甘油三酯水平顯著下降(P<0.05);應(yīng)激24h時, 50%蛋白組血清甘油三酯水平與應(yīng)激前相比無顯著差異(P>0.05)。

在應(yīng)激前, 50%蛋白組的血清膽固醇水平顯著高于 25%和 38%蛋白組(圖 4B)。在應(yīng)激后, 25%和38%蛋白組血清膽固醇水平呈先上升后下降的變化趨勢, 24h時, 兩實驗組與應(yīng)激前相比無顯著差異(P>0.05); 50%蛋白組血清膽固醇水平隨應(yīng)激時間的延長呈下降趨勢。

圖3 不同蛋白水平對吉富羅非魚幼魚在低溫應(yīng)激下血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(A)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(B)和堿性磷酸酶(C)活力的影響Fig.3 Effects of different dietary protein levels on serum glutamic-pyruvic transaminase (A), glutamic-oxaloacetic transaminase(B) and Alkaline phosphatase (C) activities and of GIFT tilapia under low temperature stress

2.5 低溫應(yīng)激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清溶菌酶活力的影響

低溫應(yīng)激對于血清溶菌酶活力有顯著影響(圖5A)。各實驗組血清溶菌酶活力在應(yīng)激前無顯著差異(P>0.05)。低溫應(yīng)激后, 溶菌酶活力顯著升高; 12h和24h時, 各實驗組溶菌酶活力低于6h時的, 但均顯著高于應(yīng)激前水平(P<0.05)。

2.6 低溫應(yīng)激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚肝臟HSP70 mRNA表達的影響

低溫應(yīng)激對羅非魚肝臟HSP70 mRNA的表達水平有顯著影響(P<0.05)。隨著應(yīng)激時間的延長, 各實驗組呈先上升后下降的變化趨勢(圖5B)。應(yīng)激12h時, 38%和50%蛋白組肝臟HSP70 mRNA的相對表達量顯著高于25%蛋白組(P<0.05); 24h時, 各蛋白組均呈下降趨勢。

3 討論

水溫是魚類工廠化養(yǎng)殖中的重要影響因素之一。在實際生產(chǎn)中, 可能因為季節(jié)的變化或其他人為因素的影響, 魚類經(jīng)常會面對低溫所產(chǎn)生的脅迫。低溫環(huán)境會降低魚類的攝食率, 導致魚體生長速度下降, 同時也會誘使魚類產(chǎn)生生理生化上的改變, 增加病害發(fā)生的幾率[3,13]。應(yīng)激反應(yīng)是機體對外界刺激的一種非特異性防御反應(yīng), 主要是交感神經(jīng)興奮和垂體-腎上腺皮質(zhì)分泌增多引起的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)[1]。

3.1 低溫應(yīng)激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清皮質(zhì)醇和葡萄糖水平的影響

急性或慢性應(yīng)激可以顯著影響魚類的血清生化參數(shù)。皮質(zhì)醇是一種與許多生物活性相關(guān)聯(lián)的類固醇激素。通常, 在低溫應(yīng)激下魚類血清皮質(zhì)醇水平開始呈上升趨勢, 隨著時間的延長而逐漸下降, 顯示了魚體對新環(huán)境的適應(yīng)[14]。血清皮質(zhì)醇水平被廣泛用作應(yīng)激狀況下的觀察指標[15]。在本實驗中, 低溫應(yīng)激 6h后, 各應(yīng)激組血清皮質(zhì)醇水平顯著升高,這與Sun,et al.[16]和劉波等[6]的研究結(jié)果相似。Su,et al.[16]研究發(fā)現(xiàn), 在14℃低溫應(yīng)激下, 尼羅羅非魚血清皮質(zhì)醇水平顯著升高; 劉波等[6]也研究發(fā)現(xiàn), 將正常飼養(yǎng)條件下(25)℃的吉富羅非魚進行冷應(yīng)激處理(9), ℃血清皮質(zhì)醇水平顯著升高。在其他魚類,如大西洋鱈魚(Gadus morhua)[17]、雜交條紋鱸(Morone chrysops×Morone saxatilis)[18]和 鱘 魚(Acipenser medirostris)[19]的研究中也得到類似結(jié)論。在應(yīng)激 24h時, 各實驗組血清皮質(zhì)醇水平呈下降趨勢, 但仍顯著高于應(yīng)激前。可能是因為, 在低溫應(yīng)激24h后, 吉富羅非魚的耐受性有所增強, 然而仍未適應(yīng)環(huán)境溫度。50%蛋白組血清皮質(zhì)醇水平在應(yīng)激24h后低于 25%和 38%蛋白組, 短期投喂較高蛋白水平的飼料可能有助于緩解羅非魚在低溫應(yīng)激下的脅迫響應(yīng)。

圖4 不同蛋白水平對吉富羅非魚幼魚在低溫應(yīng)激下血清甘油三酯(A)與膽固醇(B)水平的影響Fig.4 Effects of different dietary protein leveld on serum triglyceride (A) and cholesterol (B) levels of GIFT tilapia under low temperature stress

圖5 不同蛋白水平對吉富羅非魚幼魚在低溫應(yīng)激下血清溶菌酶活力(A)和肝臟HSP70 mRNA (B)表達的影響Fig.5 Effects of different dietary protein levels on serum lysozyme activity (A) and relative expression of liver HSP70 mRNA (B) of GIFT tilapia under low temperature stress

血清葡萄糖主要來自食物中消化吸收后的葡萄糖及肝糖原的分解和異生作用[20]。在投喂不同蛋白的飼料后, 羅非魚血清葡萄糖水平隨飼料蛋白水平的減少而下降, 這與Abdel-Tawwab,et al.[21]對羅非魚的研究結(jié)果相似。面對應(yīng)激時, 機體組織利用血糖作為主要能量來源, 腎上腺素的分泌導致血糖增加。在本實驗中, 低溫應(yīng)激后, 25%和38%蛋白組的血清葡萄糖水平顯著上升。在應(yīng)激條件下可以刺激某些葡萄糖轉(zhuǎn)運基因的表達, 增加葡萄糖在細胞間的轉(zhuǎn)運[22]。同時, 血清中皮質(zhì)醇水平的變化也能對葡萄糖代謝產(chǎn)生影響。Vijayan & Moon[23]研究發(fā)現(xiàn),皮質(zhì)醇是一種重要的皮質(zhì)類固醇激素, 皮質(zhì)類固醇的增加使機體各組織對葡萄糖的利用率降低, 肝臟糖異生作用加強, 結(jié)果導致血糖升高, 為機體應(yīng)對環(huán)境提供能量。Sun,et al.[16]也研究發(fā)現(xiàn), 在低溫應(yīng)激下可以顯著提高尼羅羅非魚血清皮質(zhì)醇與葡萄糖水平。本實驗同時發(fā)現(xiàn), 50%蛋白組的血清葡萄糖水平呈先下降后上升的變化趨勢。短期投喂高蛋白的飼料會提高羅非魚血清中葡萄糖的水平。應(yīng)激前期,可以利用葡萄糖分解來提供能量, 隨著應(yīng)激時間的延長, 機體通過增加組織中糖原的分解或肝臟中糖原代謝的關(guān)鍵酶葡萄糖激酶活性從而提高血清葡萄糖水平[24]。

3.2 低溫應(yīng)激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清總蛋白、白蛋白和球蛋白水平的影響

血清總蛋白、白蛋白與球蛋白水平的變化可以作為魚體應(yīng)對外界應(yīng)激的重要指標[25]。血清總蛋白反映魚體的營養(yǎng)和代謝狀況, 白蛋白在魚體內(nèi)起到營養(yǎng)細胞和維持血液滲透壓的作用, 而球蛋白與機體的免疫功能相關(guān)。在本實驗中, 50%蛋白組中血清總蛋白水平在應(yīng)激前高于25%和38%蛋白組。飼料中粗蛋白水平的提高, 可以增加消化蛋白的含量或飼料中過量的蛋白被消化道吸收后, 在血液中沉積[26]。在低溫應(yīng)激后, 38%和50%蛋白組血清總蛋白水平均呈先上升后下降的變化趨勢?？赡芤驗榈蜏貞?yīng)激使羅非魚肝臟受損, 短期內(nèi)提高了機體的非特異性免疫水平, 隨著應(yīng)激時間延長, 機體合成的能量更多用于應(yīng)對環(huán)境脅迫, 用于魚體蛋白質(zhì)合成則減少, 因而, 引起血清總蛋白水平降低。25%蛋白組血清總蛋白水平在應(yīng)激后24h內(nèi)始終是上升趨勢。投喂低蛋白水平的飼料可能會引起魚體營養(yǎng)不良,造成免疫功能下降[27]。蔡春芳等[27]研究發(fā)現(xiàn), 投喂20%蛋白組的異育銀鯽(Carassius auratus)其機體免疫力高于10%蛋白組。因而, 在應(yīng)激時, 魚體需要不斷地分解組織中儲存的能量來滿足生理需要。

血清白蛋白水平和白蛋白/球蛋白比值可以衡量機體正常的蛋白質(zhì)維持程度[28]。本實驗發(fā)現(xiàn), 38%和50%蛋白組血清白蛋白與球蛋白水平隨著應(yīng)激時間延長呈先上升后下降的變化趨勢。這可能與短期應(yīng)激可以提高羅非魚的能量代謝與免疫功能有關(guān)。25%蛋白組血清白蛋白與球蛋白水平基本處于上升趨勢, 魚體可能需要分解更多的能源物質(zhì)來提供能量。Adham,et al.[28]也認為, 血清總蛋白、白蛋白等濃度的變化可作為魚類環(huán)境響應(yīng)的指標。不同魚類血清蛋白的變化有較大差異, Collazos,et al.[29]發(fā)現(xiàn)丁鯛(Tincatinca)血清白蛋白和球蛋白在冬季低溫時顯著下降; Sala-Rabanal,et al.[27]發(fā)現(xiàn)低溫應(yīng)激下可引起海鯉(Cyprinus qionghaiensis)白蛋白等血漿蛋白質(zhì)水平顯著下降; 冀德偉等[30]發(fā)現(xiàn)在 8.5℃低溫下, 大黃魚(Pseudosciaena crocea)血清總蛋白隨應(yīng)激時間的增加呈先下降后上升的變化趨勢。在本研究中 38%和 50%蛋白組血清白蛋白/球蛋白比值顯著低于應(yīng)激前。這可能與低溫應(yīng)激提高了兩實驗組血清球蛋白水平有關(guān)。

3.3 低溫應(yīng)激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶活力的影響

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活力可以作為肝臟損傷的指示物。在本實驗中, 低溫應(yīng)激前, 50%蛋白組血清ALT 和AST活力高于38%和25%蛋白組, 投喂高蛋白可能會增加了肝臟的壓力。在低溫應(yīng)激后, 各實驗組血清ALT和AST活力基本呈上升趨勢, 這與劉波等[6]的研究結(jié)果相似。在應(yīng)激24h時, 各實驗組 ALT活力顯著高于應(yīng)激前。ALT作為肝臟中連接糖、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝的重要酶,應(yīng)激可能對肝臟組織造成了一定損傷, 導致血清ALT活力短期內(nèi)升高[31]。25%蛋白組血清ALT活力顯著高于38%和50%蛋白組。這可能與短期投喂高蛋白飼料可以提高其免疫功能有關(guān)。AST屬于細胞內(nèi)酶, 在正常情況下主要存在于肝細胞的可溶性部分, 在血清中水平較低。在應(yīng)激條件下可以提高肝細胞的產(chǎn)酶活性或增加細胞膜通透性與細胞壞死,AST大量進入血液, 使血清中酶活性提高[32]。本實驗表明, 50%蛋白組血清AST活力在應(yīng)激24h后顯著低于38%和25%蛋白組。短期投喂較高蛋白水平的飼料可能有助于提高魚體在低溫環(huán)境下的自我保護能力, 降低細胞膜的通透性, 阻抑細胞內(nèi)ALT的溢出。

堿性磷酸酶(AKP)屬于代謝調(diào)控酶, 與磷酸基團轉(zhuǎn)移和鈣磷代謝有關(guān)[33]。在本實驗中, 在應(yīng)激24h內(nèi), 25%和50%蛋白組血清AKP活力呈先上升后下降的變化。在低溫應(yīng)激下, 羅非魚可以增加糖類和脂質(zhì)代謝, AKP與腸內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移有關(guān), 短期應(yīng)激可以促進血清中AKP活力增加。然而, 隨著應(yīng)激時間的延長, 血清中高濃度的皮質(zhì)醇會促使脂肪降解,抑制AKP活性, 降低機體免疫力。38%蛋白組血清AKP活力在應(yīng)激期間始終處于上升趨勢, 應(yīng)激 24h時顯著高于25%和50%蛋白組。當飼料蛋白水平過量或低于適宜范圍時, 可能會對魚體產(chǎn)生分解或應(yīng)激壓力, 增加肝臟與腎臟的負擔, 降低魚體的免疫應(yīng)激能力。

3.4 低溫應(yīng)激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清甘油三酯和膽固醇水平的影響

魚類對應(yīng)激的適應(yīng)能力是由遺傳因素決定的。同時, 飼料的來源與利用、個體的發(fā)育階段等對其應(yīng)激反應(yīng)也有一定的影響[14]。血液中甘油三酯和膽固醇水平的變化與魚類對于脅迫后的抗應(yīng)激能力有關(guān)。甘油三酯和膽固醇主要來源于腸道對于脂類的吸收以及肝臟脂肪的代謝[34]。在本實驗中, 低溫應(yīng)激 24h內(nèi), 各實驗組血清甘油三酯水平基本呈先下降后上升的變化。可能是由于短暫刺激下, 魚類為了保持機體的生理生化平衡, 通過分解血清甘油三酯而提供能量。應(yīng)激24h后, 50%蛋白組血清甘油三酯水平與應(yīng)激前相比無顯著差異; 而 25%和 38%蛋白組血清甘油三酯水平顯著低于應(yīng)激前。短期投喂高蛋白的飼料可以提高羅非魚血清甘油三酯水平,同時也可以增加組織的攝取與轉(zhuǎn)化。當血清甘油三酯水平降低時, 促使了儲存組織中的能源物質(zhì)分解或轉(zhuǎn)化。50%蛋白組血清膽固醇水平顯著下降, 可能是因為魚體增加了脂肪代謝, 提供更多能量用于滿足抗應(yīng)激的需要。

3.5 低溫應(yīng)激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚血清溶菌酶活力的影響

在短期應(yīng)激下血清皮質(zhì)醇水平升高有利于魚體應(yīng)對環(huán)境脅迫, 但持續(xù)升高則會抑制機體的免疫功能。溶菌酶(LSZ)是水生動物血淋巴細胞酶系統(tǒng)中的重要組成部分, 反映了機體非特異性免疫水平的變化[35]。魚體受到急性應(yīng)激時, 肝臟受損, 血清中LSZ活力會顯著上升。飼喂不同蛋白水平的飼料對羅非魚血清LSZ活力無顯著影響。在低溫應(yīng)激6h時, 羅非魚血清LSZ活力顯著升高。推測羅非魚在急性低溫應(yīng)激下, 血清中皮質(zhì)醇濃度升高, 促進血糖的合成, 加快脂肪降解, 從而促使魚體在急性應(yīng)激下獲得更多的能量用于增加血清中一些特定免疫蛋白如LSZ或補體C3、C4等的含量, 從而提高機體的免疫力[36]。然而, 隨著應(yīng)激時間的延長, LSZ活力開始降低, 機體免疫力下降, 進而引起一些相關(guān)免疫指標發(fā)生改變。本實驗發(fā)現(xiàn), 應(yīng)激24h后, 25%蛋白組血清 LSZ活力顯著下降, 這可能與其營養(yǎng)狀態(tài)不良,機體的免疫應(yīng)激能力較差有關(guān)。

3.6 低溫應(yīng)激對飼喂不同蛋白水平的吉富羅非魚肝臟HSP70 mRNA表達的影響

生理及細胞脅迫響應(yīng)代表機體維持體內(nèi)平衡的兩個重要防御機制。生理響應(yīng)包括下丘腦-垂體-腎間組織(Hypothalamic-pituitary-interrenal, HPI)軸所分泌的一種重要的應(yīng)激激素皮質(zhì)醇[37]。而細胞響應(yīng)主要是脅迫過程中蛋白質(zhì)與基因表達的變化, 如分子伴侶HSP70與HSP90, HSPS可以與糖皮質(zhì)激素受體相互作用, 調(diào)控受體的正確折疊、激活活性與細胞轉(zhuǎn)運等[38]。在應(yīng)激條件下可以激活這兩種響應(yīng),Kazumi & George[39]研究發(fā)現(xiàn), 當潮間帶杜父魚(Oligocottus maculosus)體內(nèi)HSP70含量較高時, 機體具有更強的抗應(yīng)激能力, 適應(yīng)較大范圍的溫差變化。Takle,et al.[40]也發(fā)現(xiàn), 低溫應(yīng)激可以提高大西洋鮭(Salmo salar)體內(nèi)HSP70含量。本實驗發(fā)現(xiàn), 在低溫應(yīng)激 6h后, 羅非魚血清皮質(zhì)醇水平與肝臟HSP70 mRNA的表達量顯著上升。HSP70 mRNA的表達量在12h時達到峰值, 同時, 38%和50%蛋白組肝臟HSP70 mRNA的表達量顯著高于25%蛋白組。可見投喂較高的飼料蛋白水平有助于提高魚體對于環(huán)境應(yīng)激的耐受性。在 24h時, 各實驗組的HSP70 mRNA表達水平急劇下降。可能HSP70只在一定范圍內(nèi)對細胞起保護作用, 如果應(yīng)激持續(xù)時間太長,就會引起肝臟細胞膜結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組成的異常, 從而改變HSP70在細胞內(nèi)分布, HSP70對機體的保護能力也會隨之下降。

蛋白質(zhì)在飼料中所占比例較大, 同時也是飼料中非常重要的營養(yǎng)成分之一。本研究結(jié)果表明, 投喂高蛋白飼料可以提高吉富羅非魚血清葡萄糖、總蛋白、甘油三酯和膽固醇水平, 這些能源物質(zhì)在低溫應(yīng)激時為魚體提供能量需求, 在一定程度上提高羅非魚的抗應(yīng)激能力。同時, 投喂高蛋白飼料可能增加肝臟分解蛋白質(zhì)的負擔, 并提高飼料成本。因此, 冬季溫度較低或長途運輸中溫度降幅較大時,在投喂飼料中應(yīng)提早增加飼料蛋白水平, 以便提高羅非魚的抗應(yīng)激能力。

[1] Xu S W, Li T, Wu J Y,et al.Cloning and expression of white cloud mountain minnow (Tanichthys albonubes)Caspase-3 andCaspase-9 cDNAs [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2011,35(1)： 138—144 [徐勝威, 李恬, 吳金英, 等.唐魚Caspase-3和Caspase-9 cDNA全長克隆及脅迫表達分析.水生生物學報, 2011, 35(1)： 138—144]

[2] Li W X, Xie J, Song R,et al.Effects of pH stress on cortisol and non-specific immunity ofCarassius auratus gibelio[J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2011, 35(2)： 256—261[李文祥,謝駿, 宋銳, 等.水體 pH脅迫對異育銀鯽皮質(zhì)醇激素和非特異性免疫的影響.水生生物學報, 2011, 35(2)： 256—261]

[3] Di Marco P, Priori A, Finoia M G,et al.Physiological responses of European sea bassDicentrarchus labraxto different stocking densities and acute stress challenge [J].Aquaculture, 2008, 275(1/4)： 319—328

[4] Paperna L.Parasites, Infections and Diseases of Fshes in Africa [M].CIFA Technical Paper 31, FAO, Rome, Italy.1996, 220

[5] Chavijo A M, Conary G, Santander J,et al.First report ofE.tardafrom tilapia in Venezuela [J].Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 2002, 22(4)： 280—282

[6] Liu B, Wang M Y, Xie J,et al.Effects of acute cold stress on serum biochemical and immune parameters and liverHSP70 gene expression in GIFT strain of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) [J].Acta Ecologica Sinica, 2011, 31(17)： 4866—4873 [劉波, 垚王美, 謝駿, 等.低溫應(yīng)激對吉富羅非魚血清生化指標及肝臟HSP70 基因表達的影響.生態(tài)學報,2011, 31(17)： 4866—4873]

[7] Prymaczok N C, Chaulet A, Medesani D A,et al.Survival,growth, and physiological responses of advanced juvenile freshwater crayf i sh (Cherax quadricarinatus), reared at low temperature and high salinities [J].Aquaculture, 2012,334(7)： 176—181

[8] Atwood H L, Tomasso J R, Webb K,et al.Low-temperature tolerance of Nile tilapia,Oreochromis niloticus, effects of environmental and dietary factors [J].AquacultureResearch,2003, 34(3)： 241—251

[9] Abdel-Tawwab & Mousa.Effect of crowding stress on some physiological functions of Nile tilapia,Oreochromis niloticus(L.), fed different dietary protein levels [J].InternationalJournal of Zoological Research, 2005, 1(1)： 41—47

[10] Kiron V, Watanabe T, Fukuda H,et al.Protein nutrition and defense mechanisms in rainbow troutOncorhynchus mykiss[J].Comparative Biochemistry and Physiology, part A, 1995,111 (3)： 351—359

[11] Fast A.Pond Production Systems： Water Quality Management Practices [M].In： Lannan J E, Smitherman R O, Tchobanoglous G (Eds.), Principles and practices of pond aquaculture.Corvallis, Oregon： Oregon State University.1986,67—141

[12] Livak K J, Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the2-△△CTmethod [J].Methods, 2001, 25(4)： 402—408

[13] Qiang J, Ren H T, Xu P,et al.Synergistic effects of water temperature and salinity on the growth and liver antioxidant enzyme activities of juvenile GIFTOreochromis niloticus[J].Chinese Journal of Applied Ecology, 2012, 23(1)： 255—263[強俊, 任洪濤, 徐跑, 等.溫度與鹽度對吉富品系尼羅羅非魚幼魚生長和肝臟抗氧化酶活力的協(xié)同影響.應(yīng)用生態(tài)學報, 2012, 23(1)： 255—263]

[14] Tort L, Sunyer J O, Gómez E,et al.Crowding stress induced changes in serum haemolytic and agglutinating activity in the gilthead sea breamSparus aurata[J].Veterinary Immunology and Immunopathology, 1996, 51(1/2)： 179—188

[15] Barton B A, Iwama G K.Physiological changes in fi sh from stress in aquaculture with emphasis on the response and effects of corticosteroids [J].Annual Review of Fish Diseases,1991, 1： 3—26

[16] Sun L T, Chen G R, Chang C F.The physiological responses of tilapia exposed to low temperatures [J].Journal of Thermal Biology, 1992, 17(3)： 149—15

[17] King W V, Buckley L J, Berlinsky D L.Effect of acclimation temperature on the acute stress response in juvenile Atlantic cod,Gadus morhuaL., and haddock,Melanogrammus aeglef i nusL [J].Aquaculture Research, 2006, 37(16), 1685—1693

[18] Davis K B.Temperature affects physiological stress responses to acute confinement in sunshine bass (Morone chrysops×Morone saxatilis) [J].Comparative Biochemistry and Physiology, 2004, 139(4A)： 433—440

[19] Lankford S E, Adams T E, Cech J J Jr.Time of day and water temperature modify the physiological stress response in green sturgeon,Acipenser medirostris[J].Comparative Biochemistry and Physiology, 2003, 135(2A)： 291—302

[20] Mommsen T P, Vijayan M M, Moon T W.Cortisol in teleosts：dynamics, mechanisms of action, and metabolic regulation[J].Reviews in Fish Biology and Fisheries, 1999, 9(3)： 211—268

[21] Abdel-Tawwab M, Ahmad M H, Khattab Y A E,et al.Effect of dietary protein level, initial body weight, and their interaction on the growth, feed utilization, and physiological alterations of Nile tilapia,Oreochromis niloticus(L.) [J].Aqua-culture, 2010, 298(3/4)： 267—274

[22] Caipang C M A, Brinchmann M F, Kiron V.Short-term overcrowding of Atlantic cod,Gadus morhua： Effects on serum-mediated antibacterial activity and transcription of glucose transport and antioxidant defense related genes [J].Comparative Biochemistry and Physiology, 2008, 151(4A)：560—565

[23] Vijayan M M, MoonT W.Acute handling stress alters hepatic glycogen metabolism in food-deprived rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) [J].Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1992, 49(11)： 2260—2266

[24] Trenzado C E, Morales A E, De La Higuera M.Physiological effects of crowding in rainbow trout,Oncorhynchus mykiss,selected for low and high stress responsiveness [J].Aquaculture, 2006, 258(1/4)： 583—593

[25] Adham K, Khairalla A, Abu-Shabana M.Environmental stress in lake maryut and physiological response of Tilapia zilli Gerv [J].Journal of Environmental Science and Health,Part A：Environmental Science and Engineering and Toxicology, 1997, 32(9/10)： 2585—2598

[26] Melo J F B, Lundstedt L M, Metón I,et al.Effects of dietary levels of protein on nitrogenous metabolism ofRhamdia quelen(Teleostei： Pimelodidae) [J].Comparative Biochemistry and Physiology, 2006, 145(2A)： 181—187

[27] Cai C F, Wu K, Pan X F,et al.the effects of protein nutrition on growth and immunoloical activity of allogynogenetic silver crucian carp [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2001, 25(6)：590—596 [蔡春芳, 吳康, 潘新法, 等.蛋白質(zhì)營養(yǎng)對異育銀鯽生長和免疫力的影響.水生生物學報, 2001, 25(6)：590—596]

[28] Adham K, Khairalla A, Abu-Shabana M.Environmental stress in lake maryut and physiological response of Tilapia zilli Gerv [J].Journal of Environmental Science and Health,1997, 32(9/10A)： 2585—2598

[29] Collazos M E, BarrigaC, De-Sande F,et al.Seasonal variations and influence of gender on several haematologlcal parameters in the cyprinid fishTinca tinca[M].Actas del IV Congreso Nacional de Acuicultura.Cervino A, Landin A,De-Coo, Guerra A, Torte M (Eds.), Pontevexlra, Spain.1993,173—178

[30] Ji D W, Li M Y, Wang T Z,et al.Effects of low temperature stress periods on serum biochemical indexes in large yellow croakerPseudosciaena crocea[J].Fisheries Science, 2009,28(1)： 1—4 [冀德偉, 李明云, 王天柱, 等.不同低溫脅迫時間對大黃魚血清生化指標的影響.水產(chǎn)科學, 2009,28(1)： 1—4]

[31] Zhang L, Fan Q X, Zhao Z G,et al.The effects of chronic crowding stress on growth and blood biochemical indexes in common carpCyprinus carpio[J].Journal of Dalian Fisheries University, 2007, 22(6)： 465—469 [張磊, 樊啟學, 趙志剛, 等.慢性擁擠脅迫對鯉生長及血液生化指標的影響.大連海洋大學學報, 2007, 22(6)： 465—469]

[32] Richard J, Strance C B, Schreck B.Corticoid stress response to handling and temperature in salmonids [J].Transactions of the American Fisheries Society, 1977, 106(3)： 213—218

[33] Ming J H, Xie J, Xu P,et al.Effects of emodin, vitamin c and their combination on crowding stress resistance of wuchang bream (Megalobrama amblycephala yih) [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2011, 35(3)： 400—413 [明建華, 謝駿, 徐跑,等.大黃素、維生素 C 及其配伍對團頭魴抗擁擠脅迫的影響.水生生物學報, 2011, 35(3)： 400—413]

[34] Lermen C L, Lappe R, Crestani M,et al.Effect of different temperature regimes on metabolic and blood parameters of silver catfishRhamdia quelen[J].Aquaculture, 2004,239(1/4)： 497—507

[35] Ellis A E.Immunity to bacteria in fi sh [J].Fish & Shellf i sh Immunology, 1999, 9(4)： 291—308

[36] M?ck A, Peters G.Lysozyme activity in rainbow trout,Oncorhynchus mykiss(Walbaum), stressed by handling, transport and water pollution [J].Journal of Fish Biology, 1990,37(6)： 873—885

[37] Salas-Leiton E, Anguis V, Martín-Antonio B,et al.Effects of stocking density and feed ration on growth and gene expression in the Senegalese sole (Solea senegalensis)： Potential effects on the immune response[J].Fish & Shellf i sh Immunology, 2010, 28(2), 296—302

[38] Grad I, Picard D.The glucocorticoid responses are shaped by molecular chaperones [J].Molecular and Cellular Endocrinology, 2007, 275(1/2)： 2—12

[39] Kazumi N, George K I.The 70-kDa heat shock protein response in two intertidal sculpins,Oligocottus maculosusandO.snyderi： relationship of hsp70 and thermal tolerance [J].Comparative Biochemistry and Physiology, 2002, 133(1)：79—94

[40] Takle H, Baeverfjord G, Lunde M,et al.The effect of heat and cold exposure on HSP70 expression and development of deformities during embryogenesis of Atlantic salmon (Salmo salar) [J].Aquaculture, 2005, 249(1/4)： 515—524