鹽鹵濃漿豆腐凝膠形成作用力的研究

周淑紅，陳野，張敏，劉君，王君予，郭爽

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

大豆是蛋白質(zhì)含量最高的植物之一，含有人體必需的8 種氨基酸。中國(guó)傳統(tǒng)的豆制品以豆腐及豆腐制品為主，在豆腐加工過(guò)程中，產(chǎn)生大量營(yíng)養(yǎng)豐富的黃漿水，然而，目前我國(guó)大多數(shù)企業(yè)將黃漿水直接排放，不僅沒(méi)有充分利用其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且對(duì)環(huán)境造成污染，不利于增加大豆加工附加值和清潔生產(chǎn)[1]。

蛋白質(zhì)凝膠是變性蛋白質(zhì)分子間排斥和吸引相互作用力相平衡的結(jié)果，形成和維持蛋白質(zhì)凝膠的主要作用力是靜電相互作用、二硫鍵、疏水相互作用、氫鍵等物理作用力[2]。氫鍵、疏水相互作用、鹽鍵、范德華力都是非共價(jià)鍵，鍵能雖然小，但由于數(shù)量大，并且具有加和性，因此是蛋白質(zhì)之間不可忽視的作用力。使用不同的凝固劑形成的凝膠分子間作用力不同，目前對(duì)葡萄糖酸內(nèi)酯（GDL）和硫酸鈣豆腐凝膠研究較多，Hashizume 等[3-4]認(rèn)為，對(duì)GDL 和硫酸鈣豆腐凝膠的形成起重要作用的是二硫鍵、氫鍵和疏水相互作用。但Kohyama 等[5]認(rèn)為，豆?jié){凝固時(shí)，由于pH 偏酸性，不利于疏基與二硫鍵的交換反應(yīng)，因此在豆?jié){凝固過(guò)程中很難形成新的二硫鍵。此外，由于生豆?jié){只能形成沉淀，不能形成豆腐凝膠，所以氫鍵不可能是豆?jié){凝固的主要作用力：大豆蛋白之所以能夠形成豆腐凝膠，主要是由于大豆蛋白變性后，暴露出疏水基團(tuán)，于是在疏水相互作用下大豆蛋白分子相互結(jié)合，形成了豆腐凝膠。然而，對(duì)鹽鹵豆腐凝膠的分子間作用力研究較少，其凝膠形成機(jī)制與GDL 或硫酸鈣豆腐凝膠是否相同仍未知。

目前主要用間接手段研究蛋白質(zhì)凝膠過(guò)程中分子間的作用力，通過(guò)添加可以增強(qiáng)或削弱蛋白質(zhì)分子間作用力的試劑觀察凝膠特性的變化，如添加強(qiáng)的表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）可以破壞疏水作用[6]，而氯化鈉等高溶解度的鹽類可以破壞蛋白質(zhì)分子間的靜電引力[7]。

本研究采用濃縮方法，進(jìn)而省去在豆腐的制備工藝中排出黃漿水這一工序制備濃漿豆腐，并且試圖通過(guò)添加可影響特定化學(xué)作用力的氯化鈉，DTT，SDS，脲等試劑考察其對(duì)豆腐凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響，分析各種化學(xué)作用力對(duì)穩(wěn)定豆腐凝膠結(jié)構(gòu)的重要性，這對(duì)掌握豆腐凝固機(jī)理，確定豆腐加工條件，無(wú)疑具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆：市售；鹽鹵（食品級(jí)）：天津長(zhǎng)蘆海晶集團(tuán)有限公司；氯化鈉、鹽酸、甘氨酸，EDTA，尿素、DTT、、SDS、脲等試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

RE-3000A 真空旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；磨漿機(jī)：北京京美華研科技有限公司；TA-XT plus 型質(zhì)構(gòu)儀：北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；756PC UV 系列紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：天津市普銳斯儀器有限公司；RF-5301 熒光分光光度計(jì)：島津公司；PHS-25 pH 計(jì)：上海今邁儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 濃漿豆腐的工藝流程

挑選顆粒飽滿的優(yōu)質(zhì)大豆，按大豆干重∶水=1 ∶3的比例浸泡12 h 左右（20 ℃），使浸泡好的豆重約為干豆重2.2 倍～2.3 倍。按干豆重∶水=1 ∶8 的比例進(jìn)行兩次磨漿，過(guò)濾，濃縮至豆?jié){的蛋白質(zhì)濃度約為10%。蒸汽加熱至95 ℃保持5 min，冷水快速冷卻，加入0.6%（w/v）的鹽鹵，快速攪拌均勻，90℃下水浴加熱30 min，凝固成型，冷卻30 min 后得到濃漿豆腐。

1.3.2 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定方法

將上述制備的豆腐凝膠在冷藏箱（4 ℃）中靜置10 h 后，取出于室溫下放置1 h，用質(zhì)構(gòu)儀的TPA 模式測(cè)定其凝膠特性。采用P0.5 的探頭，測(cè)前速度5 mm/s，檢測(cè)速度1 mm/s，測(cè)后速度1 mm/s，時(shí)間5 s，力5.0 g，距離5 mm。每個(gè)樣品平行試驗(yàn)3 次。

1.3.3 鹽鹵豆腐凝膠形成過(guò)程中巰基含量的測(cè)定

1.3.3.1 樣品制備

將濃縮好的生豆?jié){加熱至95 ℃保持5 min，冷水快速冷卻，加入鹽鹵并攪拌均勻，90 ℃水浴，分別加熱0、10、20、30、40、60 min 時(shí)取樣。

1.3.3.2 巰基含量的測(cè)定

分別取上述制備的豆腐凝膠樣品1 g，加入緩沖液（每升溶液含Tris 10.4 g，甘氨酸6.99 g，EDTA1.2 g，尿素480 g，pH=8.0）15 mL，均質(zhì)1 min，在4 000 r/min下離心15 min，取上清液，濾渣中繼續(xù)加緩沖液5 mL，4 000 r/min 下離心15 min，取上清液，合并前后兩次的上清液。取合并后的上清液1 mL+緩沖液2.0 mL+Ellman 試劑0.02 mL，25 ℃保溫5 min，在412 nm 下，用分光光度計(jì)測(cè)定溶液吸光值。實(shí)驗(yàn)以不加樣品，而加Ellman 試劑為空白，以不加Ellman 試劑，而加樣品的溶液確定其混濁度。

1.3.4 鹽鹵豆腐凝膠形成過(guò)程中表面疏水性的測(cè)定

1.3.4.1 制備樣品

制備方法與上述測(cè)定巰基含量樣品的制備方法相同。

1.3.4.2 表面疏水性的測(cè)定

采用ANS 熒光探針?lè)?。?g 豆腐凝膠溶于150mL的0.01 mol/L 磷酸緩沖液中，然后在均質(zhì)機(jī)上均質(zhì)4 min，然后在5 000 r/min 下離心15 min，取上清液，用考馬斯亮蘭法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的濃度。然后再使用磷酸緩沖液將上清液稀釋至0.02 mg/mL～0.10 mg/mL之間。然后，取不同濃度的樣品溶液10 mL，采用熒光分光光度計(jì)在330.0 nm 的激發(fā)波長(zhǎng)（狹縫寬度10.0 nm）和467.0 nm 的發(fā)射波長(zhǎng)（狹縫寬度3.0 nm）下測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度（FI0），以及樣品中加入50 μL 濃度為8 mmol/L 的ANS 溶液后的熒光強(qiáng)度，振蕩，靜置10 min后測(cè)其熒光強(qiáng)度（FI1）。FI1和FI0的差值記為FI。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，初始段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子間靜電作用對(duì)鹽鹵豆腐凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

2.1.1 氯化鈉對(duì)鹽鹵豆腐凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

氯化鈉對(duì)凝膠硬度和彈性的影響分別如圖1 和圖2所示?？芍S著氯化鈉濃度的增加，鹽鹵豆腐的硬度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在氯化鈉濃度達(dá)到5 mmol/L 時(shí)，硬度達(dá)到最大值。而彈性趨勢(shì)與之相反，即先降低后增加，在氯化鈉濃度達(dá)到5 mmol/L 時(shí)，彈性為最小值。

圖1 氯化鈉濃度對(duì)凝膠硬度的影響Fig.1 Effect of NaCl concentration on on the hardness of gel

圖2 氯化鈉濃度對(duì)凝膠彈性的影響Fig.2 Effect of NaCl concentration the the springiness of gel

這是因?yàn)槁然c在較低濃度（≤5 mmol/L）時(shí)，具有電荷中和的作用，其加入有利于中和豆腐凝膠表面的負(fù)電荷，降低肽鏈間的靜電斥力，有利于凝膠的形成，因而凝膠硬度增加。氯化鈉還可以使蛋白質(zhì)的水化作用增強(qiáng)，破壞蛋白質(zhì)間的次級(jí)鍵[6]，因此，當(dāng)氯化鈉超過(guò)一定濃度，蛋白質(zhì)的水化作用逐漸加強(qiáng)，阻礙蛋白質(zhì)分子間的凝聚，不利于凝膠的形成，使得凝膠強(qiáng)度降低。

2.1.2 pH 對(duì)鹽鹵豆腐凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

pH 對(duì)凝膠硬度和彈性的影響分別如圖3 和圖4所示。

圖3 pH 對(duì)凝膠硬度的影響Fig.3 Effect of pH on the hardness of gel

圖4 pH 對(duì)凝膠彈性的影響Fig.4 Effect of pH on the springiness of gel

由圖可知，pH 由6.0 增加到9.0 的過(guò)程中，凝膠硬度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在pH=7.0 時(shí)，凝膠硬度達(dá)到最大值。而彈性則隨著pH 增加而降低。當(dāng)pH 遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子帶有同種電荷，相互排斥力占主導(dǎo)，當(dāng)靜電排斥力與蛋白分子變性后暴露的疏水基團(tuán)之間的吸引力達(dá)到平衡時(shí)，凝膠形成。因此pH 越高，游離水量越少，形成的豆腐凝膠情況越好，但pH過(guò)大會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子變性[8]。

2.2 二硫鍵對(duì)鹽鹵豆腐凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

2.2.1 二硫蘇糖醇（DTT）對(duì)鹽鹵豆腐凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

DTT 對(duì)凝膠硬度和彈性的影響分別如圖5 和圖6所示。

圖5 DTT 濃度對(duì)凝膠硬度的影響Fig.5 Effect of DTT concentration on hardness of gel

圖6 DTT 濃度對(duì)凝膠彈性的影響Fig.6 Effect of DTT concentration on the the the springiness of gel

由圖可知，隨著DTT 濃度的增加，鹽鹵豆腐凝膠的硬度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且低濃度范圍內(nèi)下降趨勢(shì)較大，隨著DTT 濃度的增加，下降趨緩。DTT 是常用還原劑，有抗氧化作用，可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)的活性，同時(shí)又是蛋白質(zhì)變性劑，可破壞二硫鍵，抑制二硫鍵的生成。有報(bào)道稱，蛋白質(zhì)中的二硫鍵經(jīng)還原反應(yīng)形成巰基后，蛋白質(zhì)構(gòu)象將變得松散[9]。由如圖5 可以看出，在DTT存在下，鹽鹵豆腐凝膠的硬度降低。這說(shuō)明凝集時(shí)發(fā)生了巰基的氧化，二硫鍵的生成對(duì)凝膠強(qiáng)度有一定的影響。

2.2.2 鹽鹵豆腐凝膠形成過(guò)程中巰基含量的變化

鹽鹵豆腐凝膠形成過(guò)程中巰基含量的變化如圖7所示。

圖7 鹽鹵豆腐凝膠形成過(guò)程中巰基含量的變化Fig.7 Changes of the sulfhydryl content during bittern tofu gel formation process

由圖7 看出，隨著凝固時(shí)間的延長(zhǎng)，巰基含量基本呈下降趨勢(shì)。巰基含量在凝膠凝固過(guò)程中降低，說(shuō)明在水解過(guò)程中一些游離的巰基發(fā)生氧化，生成了二硫鍵。二硫鍵是共價(jià)鍵，鍵能大于疏水作用和氫鍵。二硫鍵，尤其是鏈間二硫鍵的生成對(duì)穩(wěn)定和增強(qiáng)凝膠結(jié)構(gòu)具有重要的作用[10]。

2.3 疏水相互作用對(duì)鹽鹵豆腐凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

2.3.1 十二烷基硫酸鈉（SDS）對(duì)鹽鹵豆腐凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

SDS 對(duì)凝膠硬度和彈性的影響分別如圖8 和圖9所示。

圖8 SDS 對(duì)凝膠硬度的影響Fig.8 Effect of SDS concentration on the hardness of gel

圖9 SDS 對(duì)凝膠彈性的影響Fig.9 Effect of SDS concentration on the springiness of gel

由圖可知，隨著SDS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，鹽鹵豆腐凝膠的硬度呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，當(dāng)SDS 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.09%時(shí)，凝膠的硬度達(dá)到了最大值。同樣，彈性也隨SDS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而增大。SDS 是一種強(qiáng)的親水表面活性劑，加入后可以破壞蛋白質(zhì)分子的疏水結(jié)合[6]，有助于肽鏈的充分展開(kāi)和疏水基團(tuán)的暴露，使蛋白溶液的疏水性增大，有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。另外溶液的疏水性的增大，有利于鏈間二硫鍵的形成，從而有助于凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

2.3.2 鹽鹵豆腐凝膠形成過(guò)程中表面疏水性的變化

鹽鹵豆腐凝膠形成過(guò)程中表面疏水性的變化如圖10 所示。

圖10 鹽鹵豆腐凝膠形成過(guò)程中表面疏水性的變化Fig.10 Changes of the surface hydrophobicity during bittern tofu gel formation process

隨著鹽鹵豆腐凝膠形成時(shí)間的延長(zhǎng)，凝膠的表面疏水性指數(shù)S0呈先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)凝膠時(shí)間為30 min 時(shí)，表面疏水性指數(shù)達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)殡S著凝固時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的變性程度增大，疏水區(qū)域暴露在外，促進(jìn)蛋白質(zhì)通過(guò)疏水相互作用形成凝聚體。但是當(dāng)凝固時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)通過(guò)疏水相互作用交聯(lián)的機(jī)會(huì)增多，表現(xiàn)為表面疏水性指數(shù)降低，參與豆腐凝膠形成的疏水性基團(tuán)減少，導(dǎo)致豆腐的凝膠強(qiáng)度降低[11]。

2.4 氫鍵對(duì)鹽鹵豆腐凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

脲對(duì)凝膠硬度和彈性的影響分別如圖11 和圖12所示。

由圖可知，隨著脲濃度的增加，鹽鹵豆腐凝膠的硬度呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，彈性也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)脲的濃度為0.05 mol/L 時(shí)，凝膠硬度顯著下降，繼續(xù)增加脲的濃度，則凝膠無(wú)法形成。

圖12 脲的濃度對(duì)鹽鹵豆腐凝膠彈性的影響Fig.12 Effect of urea concentration on the springiness of gel

煮沸后蛋白質(zhì)變性，肽鏈展開(kāi)隨機(jī)排列，破壞了原來(lái)的氫鍵，原來(lái)形成氫鍵的基團(tuán)暴露，暴露的氫鍵基團(tuán)促進(jìn)展開(kāi)的肽鏈相互聚集，氫鍵的結(jié)合使得肽鏈形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。當(dāng)加入一定濃度的脲后，脲與肽鏈間的氫鍵基團(tuán)結(jié)合，肽鏈上的氫鍵基團(tuán)被屏蔽，影響肽鏈間氫鍵的形成。因此，凝膠的硬度及彈性顯現(xiàn)下降趨勢(shì)，甚至不能形成凝膠。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明隨著脲濃度的增大，脲對(duì)肽鏈間氫鍵形成的影響加大，由此可以看出氫鍵是豆腐凝膠形成的分子間作用力之一，并且對(duì)豆腐凝膠的形成有重要的影響[8]。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同pH 以及NaCl 濃度對(duì)鹽鹵凝固豆腐凝膠過(guò)程的影響的研究，結(jié)果表明：在腐凝膠形成過(guò)程中離子鍵的作用較大，凝膠的形成需要克服蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力。通過(guò)DTT 對(duì)鹽鹵凝固豆腐凝膠過(guò)程中的影響以及巰基含量變化的研究可知，二硫鍵在凝膠形成過(guò)程中的起著重要作用，能夠較大的促進(jìn)凝膠的形成。結(jié)合SDS 對(duì)鹽鹵豆腐凝膠的影響以及疏水性的測(cè)定，可見(jiàn)疏水相互作用對(duì)豆腐凝膠有顯著的作用。脲的添加也證實(shí)了氫鍵對(duì)形成凝膠的重要影響。因此，在鹽鹵濃漿豆腐凝膠形成中，靜電相互作用，二硫鍵，疏水相互作用以及氫鍵對(duì)凝膠的形成都具有重要作用。

[1]唐鑫,陳卓然,黃薪安,等.豆制品生產(chǎn)中黃漿水的綜合應(yīng)用[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2010(6)：67

[2]董秋穎,楊玉玲,許婷.從質(zhì)構(gòu)學(xué)角度研究肌原纖維蛋白凝膠形成的作用力[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35(5)：45

[3]Hashizume K,Maeda M,Watanabe T.Relationships of heating and cooling condition to hardness of tofu[J].Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi,1978,25：387-391

[4]Hashizume K,Ka G.Difference between tofus coagulated with glueono-delta-lacton and calcium salts[J].Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi,1978,25(7)：383-386

[5]Kohyama K,Sano Y,Doi E.Reological characteristics and gelation mechanism of tofu (soybean curd)[J].J Aghe Food Chem,1995,43：1808-1812

[6]沈同,王鏡巖.生物化學(xué)[M].2 版.北京：高等教育出版社,1990：34-37

[7]RENKMA J M S,LAKEMOND C M M,JONGH H H J,et al.The effect of pH on heat denaturation and gel forming properties of soy proteins[J].Biotechnology,2000,79：223-230

[8]CHEFTEL C,CUQ J L,LORIENT D.Amino acids,peptides and pmteins[M].FEUNENM O R.Food Chemisty,1993：275-414

[9]田悅,社軍保.二硫鍵和巰基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能中的作用及分析方法[J].實(shí)用兒科臨床雜志,2007,22(19)：1499-1501

[10]Cherry J P.Protein Functionality in Foods (ACS Symposium Series 147)[M].Washington：American Chemistry Society,1981：136-137

[11]李里特,汪立君,李再貴,等.大豆蛋白熱變性程度對(duì)豆腐品質(zhì)的影響[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2002,17(1)：3