羅非魚(yú)肉水解蛋白Alcalase酶解工藝優(yōu)化

方細(xì)娟，曾慶祝，許慶陵，戰(zhàn)宇，劉鵬，林金鷹，顧采琴

（廣州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣東廣州 510006）

羅非魚(yú)是一種中小型魚(yú)，繁殖能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，肉味鮮美，含有多種不飽和脂肪酸和豐富的蛋白質(zhì)，素有“白肉三文魚(yú)”之稱[1]。2010 年，我國(guó)羅非魚(yú)（tilapia）產(chǎn)量達(dá)120 萬(wàn)t，占世界總產(chǎn)量的50%以上。羅非魚(yú)主要用于加工冷凍魚(yú)片出口歐美市場(chǎng)。由于羅非魚(yú)體形較扁，制造魚(yú)片的利用率只有整條魚(yú)的46%左右，而下腳料則高達(dá)54%以上，加工利用率不高，廢棄物較多[2]，導(dǎo)致加工企業(yè)利潤(rùn)低，難以確保羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展，所以探索新的加工方法具有重要現(xiàn)實(shí)意義。利用羅非魚(yú)制造水解蛋白具有原料利用率高、水解蛋白多肽及其相關(guān)產(chǎn)物具有特殊生物活性和重要應(yīng)用價(jià)值[3]。有關(guān)蛋白多肽的生物利用，Hara[4]較早就指出，蛋白質(zhì)在消化道中的消化終產(chǎn)物大部分是小肽而不是游離氨基酸（FAA），這些多肽具有與原蛋白相同的氨基酸組成成分，且這類小肽具有良好的溶解性和穩(wěn)定性。在此之后，開(kāi)展了較多關(guān)于蛋白多肽制備及其生物活性等研究工作。目前，關(guān)于羅非魚(yú)肉蛋白的水解工藝研究的報(bào)道較少，這些研究主要是以水解度為指標(biāo)，探討不同酶對(duì)羅非魚(yú)肉水解的影響，得出最佳水解酶及其最佳水解工藝條件，有的文獻(xiàn)還對(duì)水解產(chǎn)物的生理活性進(jìn)行了研究[5-7]。而以水解度（DH）、三氯乙酸蛋白質(zhì)氮溶解指數(shù)（TCA-NSI）、酸溶肽得率（YASP）三個(gè)參數(shù)作為羅非魚(yú)蛋白水解工藝指標(biāo)，并采用響應(yīng)面優(yōu)化手段探究其最佳工藝條件的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以DH、TCA-NSI、YASP 為指標(biāo)探討了羅非魚(yú)蛋白水解的最佳工藝條件并得出回歸模型，為羅非魚(yú)深加工及高級(jí)蛋白產(chǎn)品的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

羅非魚(yú)：購(gòu)于市場(chǎng)，取其魚(yú)肉絞碎后冰箱冷凍保存，測(cè)其粗蛋白含量為18.31%、水分74.46%；Alcalase蛋白酶：天津諾維信生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白：上海緣聚生物科技有限公司。

1.2 主要設(shè)備

PL403 電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV2300 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海天美可惜儀器有限公司；SHZ-D 循環(huán)水式真空泵：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-25 數(shù)顯pH 計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司；飛鴿牌離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SZ-93 自動(dòng)雙重純水蒸流器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 酶活的測(cè)定用福林酚法[8]

酶活力的定義為：在40 ℃下每分鐘水解干酪素產(chǎn)生1 mg/L 酪氨酸定為一個(gè)酶活力單位。

1.3.2 水解度的測(cè)定用甲醛滴定法[9]

1.3.3 三氯乙酸蛋白質(zhì)氮溶解指數(shù)的測(cè)定

先用10%的TCA 沉淀羅非魚(yú)魚(yú)肉蛋白水解液中的蛋白質(zhì)和大分子多肽，離心后取上清液，用甲醛滴定法測(cè)上清液中的游離氨基酸的含量[10]：

1.3.4 酸沉肽得率的測(cè)定用福林酚法[11]

1.4 酶解

稱取適量的自制魚(yú)靡加水混勻→55 ℃水浴預(yù)熱5 min →調(diào)pH →加入適量的酶→在適宜條件下水解→100 ℃水浴滅酶→冷卻→離心→抽濾分離→多肽水解液冰箱保存?zhèn)溆茫看螌?shí)驗(yàn)做三組平行）。

2 結(jié)果與討論

2.1 各單因素對(duì)魚(yú)肉蛋白水解過(guò)程的影響

2.1.1 加酶量的影響

在液固比為3 ∶1、pH8.0、溫度為50 ℃、水解時(shí)間為1 h 的條件下，分別加925.5、1 851、3 702、5 553、7 404 U/g（以羅非魚(yú)計(jì)）的酶對(duì)魚(yú)肉蛋白進(jìn)行水解，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 加酶量對(duì)DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig 1 Effect of enzyme Quantity on DH，TCA-NSI and YASP

圖1 結(jié)果表明，DH、TCA-NSI 及YASP 均隨著加酶量的增加而逐漸升高，在液固比一定的情況下，隨著加酶量的增加，酶與底物接觸機(jī)會(huì)增多，酶對(duì)蛋白肽鍵的切割作用增大，DH、TCA-NSI 及YASP 均逐漸增加，如圖可知，DH 和TCA-NSI 增加幅度較大，而YASP 增加幅度較小，說(shuō)明加酶量對(duì)溶液中產(chǎn)生游離氨基酸的影響很大而對(duì)溶液中產(chǎn)生多肽影響較少；當(dāng)加酶量超過(guò)3 702U/g 時(shí)，隨著加酶量的增加，DH、TCA-NSI 及YASP 的增幅都趨于平緩。這是由于酶與底物的溶度已經(jīng)達(dá)到了飽和，底物被酶所飽和，底物可供酶所切割位點(diǎn)有限，再增加酶量，DH、TCA-NSI 及YASP 不會(huì)發(fā)生太大的變化。綜合加酶量對(duì)三個(gè)指標(biāo)的影響，取3 702 U/g（以羅非魚(yú)計(jì)）為最適加酶量。

2.1.2 溫度的影響

在液固比為3 ∶1、pH8.0、加酶量為3 702 U/g（以羅非魚(yú)計(jì)）的條件下，分別在40、45、50、55、60 ℃下進(jìn)行水解1 h，結(jié)果如圖2，可以看出，在溫度為40 ℃～55 ℃范圍內(nèi)，DH、TCA-NSI 和YASP 3 個(gè)指標(biāo)都呈上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度超過(guò)55 ℃以后，DH、TCA-NSI 和YASP 反而呈下降趨勢(shì)，DH 值上升或下降幅度隨溫度的變化都不大，說(shuō)明水解液中游離氨基酸的量基本保持不變。在酶解過(guò)程中，適當(dāng)提高溫度可增強(qiáng)酶活力，從而促進(jìn)魚(yú)肉蛋白的水解，但溫度太高則會(huì)使酶活力下降甚至有可能使酶失活，反而不利于水解。因此選擇55 ℃為適宜的水解溫度。

圖2 溫度對(duì)DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig.2 Effect of temperature on DH，TCA-NSI and YASP

2.1.3 pH 的影響

認(rèn)識(shí)空間圖形，培養(yǎng)和發(fā)展學(xué)生的空間想像能力、推理論證能力、運(yùn)用圖形語(yǔ)言進(jìn)行交流的能力以及幾何直觀能力，是高中階段數(shù)學(xué)必修系列課程的基本要求.

選用不同的pH，在液固比為3 ∶1、溫度55 ℃、加酶量3 702 U/g（以羅非魚(yú)計(jì)）的條件，水解1 h，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 pH 對(duì)DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig.3 The effect of pH on DH，TCA-NSI and YASP

圖3 結(jié)果顯示，pH 對(duì)DH、TCA-NSI、YASP 都有一定程度的影響，在pH 達(dá)到9 時(shí)，DH、TCA-NSI、YASP都達(dá)到了最大，然后pH 超過(guò)9 之后，DH、TCA-NSI 和YASP 均呈下降趨勢(shì)，由于pH 的升高，使酶的活性下降。從圖中也可以看出pH 對(duì)YASP 的影響比較大，這可能是因?yàn)閜H 比較低時(shí)，溶液中的大分子比較多，而當(dāng)pH 超過(guò)8.5 時(shí)，溶液中小分子肽和氨基酸的含量開(kāi)始增加。因此，取最適pH 為9。

2.1.4 液固比的影響

選用不同的液固比，在pH9.0、溫度55 ℃、加酶量3 702 U/g（以羅非魚(yú)計(jì)）的條件，水解1 h，結(jié)果如圖4所示，從圖4 可以看出，隨著酶與底物比的增加，DH、TCA-NSI、YASP 都有增加趨勢(shì)，而當(dāng)酶與底物比超過(guò)一定值時(shí)，DH、TCA-NSI、YASP 都有所降低，原因在于特定的酶與底物濃度比有特定的結(jié)合方式，即不同的酶與底物濃度比將有不同的產(chǎn)物（分子量不同）。所以在較大的酶與底物比條件下的產(chǎn)物中，可能含有較多的較大分子量的分子。在測(cè)定TCA-NSI 和YASP 時(shí)，這些具有較大分子量的分子的部分或者全部就會(huì)沉淀下來(lái)，根據(jù)質(zhì)量守恒定律，留在溶液中的蛋白質(zhì)類（即多肽）就少了，所以TCA-NSI 和YASP 都降低了，且液固比過(guò)大的話，一方面雖然使底物分散更均勻，溶解度增加，但同時(shí)酶的溶度下降，勢(shì)必對(duì)蛋白水解產(chǎn)成不利影響。圖中液固比為1 ∶1～3 ∶1 時(shí)，DH、TCANSI、YASP 都呈上升趨勢(shì)，但超過(guò)3 ∶1 以后，都略微的有所下降，因此取3 ∶1 為適宜的液固比。

圖4 加水量與羅非魚(yú)肉之比對(duì)DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig.4 The effect of liquid-to-solid ratio on DH，TCA-NSI and YASP

2.1.5 酶解時(shí)間的影響

選用液固比為3 ∶1、pH9.0、溫度55 ℃、加酶量3 702 U/g（以羅非魚(yú)計(jì)）的條件，分別水解不同時(shí)間，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 水解時(shí)間對(duì)DH、TCA-NSI 及YASP 的影響Fig.5 The effect of reaction time on DH，TCA-NSI and YASP

從圖5 可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，DH、TCA-NSI、YASP 都增大，在反應(yīng)時(shí)間在1 h 之內(nèi)，DH、TAC-NSI、YASP 的增幅較大，當(dāng)時(shí)間超過(guò)1 h 之后，DH 增幅趨于平穩(wěn)，TAC-NSI 不再增加，但YASP 反而有所下降，可能是由于水解越長(zhǎng)，魚(yú)肉蛋白水解程度越大，產(chǎn)生的多肽被進(jìn)一步水解，從而導(dǎo)致多肽減少，游離氨基酸的含量增加。從獲取較多多肽組分和節(jié)省能耗方面來(lái)考慮，選擇控制反應(yīng)的最佳時(shí)間為1 h。

2.2 酶解工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化

表1 相應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface experiment

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合得到回歸方程如下。

DH 的回歸方程：

TCA-NSI 的回歸方程：

YASP 的回歸方程：

從表3 可以看出，3 個(gè)指標(biāo)的回歸模型項(xiàng)都顯著，且失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明3 個(gè)回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果擬合得較好。從DH 模型的方差分析中可知，pH 和4 個(gè)條件的二次項(xiàng)顯著，說(shuō)明溫度、pH、加酶量及液固比之間的交互作用對(duì)DH 無(wú)顯著影響；從TCA-NSI 模型的方差分析中可知，溫度的二次項(xiàng)極顯著以及交互相BC顯著，交互相BC 對(duì)TCA-NSI 的影響可從圖7 反映出；從YASP 模型的方差分析中可知，一次項(xiàng)C 影響顯著和二次項(xiàng)D2影響極顯著，交互性無(wú)顯著影響，說(shuō)明溫度、pH、加酶量及液固比之間的交互作用對(duì)YASP無(wú)顯著影響。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表3 回歸模型的方差分析Continue table 3 Variance analysis of regression model

上面響應(yīng)分析圖直觀反映了4 個(gè)因素以及交互作用對(duì)DH、TCA-NSI、YASP 3 個(gè)指標(biāo)的影響程度。為了進(jìn)一步優(yōu)化酶解的最佳工藝條件，通過(guò)Design expert 7.1.6 軟件綜合3 個(gè)指標(biāo)的影響，對(duì)回歸方程進(jìn)行偏微分，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，得到最佳工藝條件為：溫度54.30 ℃，pH 為8.77，加酶量為3 702 U/g（以羅非魚(yú)計(jì)），液固比為3.06：1，而在此條件下預(yù)測(cè)值DH為33.63%、TCA-NSI 為22.10%、YASP 為64.55%。從響應(yīng)面分析得出的最佳條件與單因素所得出的結(jié)果總體一致。

2.3 模型的驗(yàn)證性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，根據(jù)所得的最佳工藝條件：溫度54.30 ℃，pH 為8.77，加酶量為3 702 U/g（以羅非魚(yú)計(jì)），液固比為3.06 ∶1，水解時(shí)間1 h，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在此條件下進(jìn)行了3 次平行試驗(yàn)（如表4 所示），測(cè)出3 次DH 的平均值為33.57%、TCA-NSI 的平均值為22.09%、YASP 的平均值為64.52%，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好，證明該模型合理可靠。

圖6 各因素對(duì)DH 影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagrams for four factors on DH

圖7 各因素對(duì)TCA-NSI 影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagrams for four factors on TCA-NSI

圖8 各因素對(duì)YASP 影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagrams for four factors on YASP

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)Table 4 The test of validation

3 結(jié)論

1）單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，Alcalase 對(duì)羅非魚(yú)肉蛋白水解的適宜水解條件為：酶解時(shí)間1 h、液固比為3 ∶1、酶解pH 為9、酶解溫度為55 ℃、加酶量為3 702 U/g（以羅非魚(yú)計(jì)）。

2）用單因素所得的最佳條件進(jìn)行了響應(yīng)面分析，對(duì)水解工藝條件做進(jìn)一步優(yōu)化，得到了DH、TCA-NSI、YASP 的回歸方程模型，并通過(guò)微積分優(yōu)化得出羅非魚(yú)肉蛋白水解的最佳工藝條件：溫度54.30 ℃、pH 為8.77、加酶量為3 702 U/g（以羅非魚(yú)計(jì)）、液固比為3.06 ∶1、水解時(shí)間1 h，在此條件下預(yù)測(cè)值DH 為33.63%、TCANSI 為22.10%、YASP 為64.55%，實(shí)測(cè)值DH 為33.57%、TCA-NSI 為22.09%、YASP 為64.52%，預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值吻合較好，說(shuō)明回歸模型能較好地預(yù)測(cè)DH、TCA-NSI、YASP 的實(shí)際指標(biāo)。

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