環(huán)孢菌素A生產(chǎn)菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立

戴 夢,劉 靜,趙 穎,張 佳,章 麗,鄭桂珍

(華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司微生物藥物國家工程研究中心,河北石家莊050015)

環(huán)孢菌素A生產(chǎn)菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立

戴 夢,劉 靜,趙 穎,張 佳,章 麗,鄭桂珍

(華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司微生物藥物國家工程研究中心,河北石家莊050015)

以腐草霉素抗性為選擇標(biāo)記,建立了環(huán)孢菌素A生產(chǎn)菌株的基因轉(zhuǎn)化體系,成功將外源基因轉(zhuǎn)入環(huán)孢菌素A生產(chǎn)菌,并整合到染色體上。傳代實(shí)驗(yàn)表明,外源基因可以穩(wěn)定表達(dá)。該體系的建立為環(huán)孢菌素A生產(chǎn)菌的基因工程育種奠定了基礎(chǔ)。

環(huán)孢菌素A;多孔木霉;原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

環(huán)孢菌素A是由11個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽,20世紀(jì)70年代由瑞士巴塞爾(Basel)的Sandoz公司實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn),并由該公司成功上市[1]。1978年,環(huán)孢菌素A被應(yīng)用于第一例腎移植患者。因其具有免疫抑制活性強(qiáng)、對骨髓的毒性低等特點(diǎn),目前廣泛應(yīng)用于異體器官移植后的排異反應(yīng)及一些自體免疫缺陷疾病的治療。除免疫抑制活性外,環(huán)孢菌素A還具有抗真菌、抗寄生物及抗炎活性[2]。2005年,環(huán)孢菌素A的年銷售額已達(dá)10億美元[3]。工業(yè)生產(chǎn)中,環(huán)孢菌素A由絲狀真菌多孔木霉(Tolypocladium inflatum,又名雪白白僵菌Beauveria nivea)深層發(fā)酵產(chǎn)生。催化環(huán)孢菌素A生物合成的環(huán)孢菌素A合成酶,為多功能非核糖體多肽合成酶,分子量約1.6 MDa,由11個(gè)模塊組成[4],定位于液泡膜上[5]。通過傳統(tǒng)的誘變篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化,環(huán)孢菌素A的產(chǎn)量不斷提高[6-8]。但對于產(chǎn)量已較高的生產(chǎn)菌株,再通過常規(guī)的誘變育種來提高產(chǎn)量就很困難。基因工程和代謝途徑工程技術(shù)的發(fā)展,為工業(yè)生產(chǎn)菌種的改良和改造提供了更為直接有效的手段,在很多品種上已經(jīng)獲得了成功[9-11]。但對于環(huán)孢菌素A生產(chǎn)菌,特別是高產(chǎn)菌株的基因工程改造還鮮見報(bào)道。作者針對環(huán)孢菌素A生產(chǎn)菌原生質(zhì)體制備、再生、轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行探索,建立了可行的轉(zhuǎn)化體系,為后續(xù)的環(huán)孢菌素A生產(chǎn)菌株的基因工程育種奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒與試劑

環(huán)孢菌素A高產(chǎn)菌株多孔木霉(Tolypocladium inflatum)060901,華北制藥集團(tuán)新藥研究有限責(zé)任公司。質(zhì)粒pPIPKA,自行保存,含有融合了產(chǎn)黃青霉異青霉素N合成酶基因啟動子(Pipns)的腐草霉素抗性基因[12]。

裂解酶、麥芽粉,Sigma公司;酵母粉、蛋白胨, Oxoid公司;Easy-DNA試劑盒,Invitrogen公司;腐草霉素,InvivoGen公司;其它試劑均為國產(chǎn)。

1.1.2 培養(yǎng)基、緩沖溶液

菌絲培養(yǎng)基和高滲培養(yǎng)基均參照Weber等[13]方法配制,略作改進(jìn)。菌絲培養(yǎng)基:一水麥芽糖5%,蛋白胨1%,KH2PO40.5%,KCl 0.25%,p H值5.6。高滲培養(yǎng)基:麥芽粉2%,酵母粉0.4%,山梨醇21. 8%,瓊脂0.8%,p H值5.7。

斜面培養(yǎng)基:可溶性淀粉1.5%,玉米漿1.0%,蛋白胨0.15%,蔗糖0.25%,KH2PO40.025%,瓊脂2.5%,p H值5.0。

原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化緩沖溶液[12]:KMP(KCl 0.7 mol·L-1,甘露醇0.8 mol·L-1,磷酸鉀緩沖溶液20 mmol·L-1,p H值6.3),KMPC(KMP加50 mmol·L-1CaCl2),PPC(PEG3500 40%,CaCl250 mmol·L-1,磷酸鉀緩沖溶液20 mmol·L-1,p H值6.3)。

1.2 方法

1.2.1 多孔木霉060901對腐草霉素的敏感性考察

制備多孔木霉060901孢子液,取適量涂布在含不同濃度腐草霉素的高滲培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基平板上, 28℃下培養(yǎng)10 d左右,觀察其生長情況。

1.2.2 原生質(zhì)體制備

接種多孔木霉060901到菌絲培養(yǎng)基,孢子終濃度為6.5×106個(gè)·m L-1,28℃、230 r·min-1下培養(yǎng)72 h。收集菌絲,用含0.5%裂解酶的KMP溶液28℃下處理1 h,過濾除去菌絲碎片,900 g、4℃下離心10 min收集原生質(zhì)體,用0.8 mol·L-1KCl溶液洗原生質(zhì)體2次,原生質(zhì)體懸于KMPC溶液,終濃度為1.5 ×108個(gè)·m L-1。

1.2.3 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

取200μL原生質(zhì)體加到2 m L離心管中,加50μL PPC溶液和5μg質(zhì)粒p PIPKA,冰上放置30 min,再加1 m L PPC溶液,混勻加到高滲培養(yǎng)基中,倒平板。28℃下培養(yǎng)20 h左右,加蓋腐草霉素抗性(5 μg·m L-1),28℃下繼續(xù)培養(yǎng)10 d左右,挑取腐草霉素抗性克隆,轉(zhuǎn)接到含2μg·m L-1腐草霉素的抗性斜面培養(yǎng)基上,培養(yǎng)7 d左右。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子分析

1.2.4.1 基因組DNA提取

取斜面孢子接種到菌絲培養(yǎng)基,28℃下振蕩培養(yǎng)48 h,取菌絲,液氮研磨,用Easy-DNA試劑盒提取DNA基因組。

1.2.4.2 轉(zhuǎn)化子基因水平鑒定

采用文獻(xiàn)[13]設(shè)計(jì)的腐草霉素抗性基因的引物ph1、ph2,以出發(fā)菌株及陽性克隆的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過瓊脂糖凝膠電泳對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 多孔木霉060901對腐草霉素的敏感性

腐草霉素抗性為絲狀真菌基因轉(zhuǎn)化中常用的篩選標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)表明,多孔木霉對腐草霉素極為敏感,在高滲培養(yǎng)基中加入1μg·m L-1的腐草霉素即可抑制其生長;在斜面培養(yǎng)基上加入2μg·m L-1的腐草霉素,只有少數(shù)菌落能生長,且形態(tài)與對照菌株有明顯的區(qū)別。因此,嘗試采用含有腐草霉素抗性基因的產(chǎn)黃青霉轉(zhuǎn)化載體pPIPKA建立多孔木霉的轉(zhuǎn)基因體系。

2.2 多孔木霉060901原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

原生質(zhì)體的制備方法參考了產(chǎn)黃青霉的制備和轉(zhuǎn)化方法[12],主要對菌絲的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,根據(jù)該菌生長慢、易結(jié)球的特點(diǎn),采取了加大接種量、并在搖瓶中加玻璃珠的方法,菌絲培養(yǎng)48～96 h均可得到原生質(zhì)體,但以72 h效果最好,原生質(zhì)體的制備量大,達(dá)7×107個(gè)·g-1濕菌絲,且再生率高,在30%左右。原生質(zhì)體量和質(zhì)粒量對轉(zhuǎn)化效率的影響見表1。

表1 原生質(zhì)體量和質(zhì)粒量對轉(zhuǎn)化效率的影響Tab.1 The effect of protoplast amount and plasmid amount on transformation efficiency

由表1可以看出,毎個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)選用3×107個(gè)· g-1濕菌絲的原生質(zhì)體和5μg質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效果比較好。經(jīng)過多批轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)批次間的差異比較大,可能一些細(xì)微的變化也會對轉(zhuǎn)化效率造成影響。

2.3 轉(zhuǎn)化子鑒定

經(jīng)過轉(zhuǎn)化共得到能在腐草霉素抗性斜面上正常生長的菌株228株,隨機(jī)挑選部分菌株提取基因組DNA,并以其為模板,用腐草霉素抗性基因引物ph1/ ph2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明所選菌株均有預(yù)期的腐草霉素抗性基因(圖1)。

2.4 傳代實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)化菌株在無抗性斜面?zhèn)鞔?次,再接種到含腐草霉素的斜面上,仍生長良好,證明轉(zhuǎn)化子抗性基因能夠穩(wěn)定遺傳。

圖1 轉(zhuǎn)化菌株的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 The results of PCR identification for transformation strains

2.5 討論

環(huán)孢菌素A因其在器官移植和自體免疫疾病治療方面所起的重要作用,一直受到人們的重視,不斷提高其產(chǎn)量是工業(yè)化生產(chǎn)的重要目標(biāo)。建立在隨機(jī)突變和大規(guī)模篩選基礎(chǔ)上的常規(guī)育種方法及培養(yǎng)工藝的改進(jìn)在環(huán)孢菌素A產(chǎn)量的提高方面發(fā)揮了重大的作用,但隨著菌株產(chǎn)量的提高和突變的累積,傳統(tǒng)育種方法的局限性不斷顯現(xiàn),進(jìn)一步提高高產(chǎn)菌株的產(chǎn)量越來越困難?，F(xiàn)代生物技術(shù)為菌種改良提供了更為直接和理性的方法。通過基因工程方法對工業(yè)微生物的改造,在放線菌和真菌上均有成功的報(bào)道[9-11],但基因工程技術(shù)在環(huán)孢菌素A生產(chǎn)菌改造方面應(yīng)用的報(bào)道還很少。高效的轉(zhuǎn)基因體系是工業(yè)微生物基因工程育種的基礎(chǔ)。原生質(zhì)體制備的預(yù)實(shí)驗(yàn)中曾采用Weber等[13]報(bào)道的環(huán)孢菌素A生產(chǎn)菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體的制備量少,所需酶濃度高,而且在離心濃縮時(shí),原生質(zhì)體大部分懸浮在上清中,不易沉淀。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn),對產(chǎn)黃青霉的原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化體系[12]進(jìn)行改良,確定了用于環(huán)孢菌素A高產(chǎn)菌株多孔木霉060901的原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化方法,該方法所需酶濃度低,原生質(zhì)體制備量大,成活率高。但與Weber等的報(bào)道相比,轉(zhuǎn)化效率還比較低,這可能與本研究選用的宿主為環(huán)孢菌素A高產(chǎn)菌株有關(guān)。本研究選用的質(zhì)粒pPIPKA曾用于產(chǎn)黃青霉菌的轉(zhuǎn)化,可以成功地整合到多孔木霉基因組中,且經(jīng)過多次傳代仍可以穩(wěn)定地表達(dá)。由于該菌對腐草霉素比較敏感,使用較低濃度的腐草霉素便可篩選得到陽性克隆,與Weber等使用的潮霉素(600μg·m L-1)相比,是一種比較經(jīng)濟(jì)的選擇。

3 結(jié)論

以腐草霉素抗性為選擇標(biāo)記,建立了環(huán)孢菌素A高產(chǎn)工業(yè)菌株的基因轉(zhuǎn)化體系,成功將外源基因轉(zhuǎn)入環(huán)孢菌素A生產(chǎn)菌,并整合到染色體上。傳代實(shí)驗(yàn)表明,外源基因可以穩(wěn)定表達(dá)。為后續(xù)的環(huán)孢菌素A生產(chǎn)菌的基因工程育種奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of Protoplasts Transformation System for Cyclosporin A Industrial Strain

DAI Meng,LIU Jing,ZHAO Ying,ZHANG Jia,ZHANG Li,ZHENG Gui-zhen
(New Drug R&D Center of North China Pharmaceutical Co.,National Engineering& Research Center of Microbial Medicine,Shijiazhuang 050015,China)

A protoplasts transformation system for high-productive industrial strain of cyclosporin A was successfully constructed by using phleomycin resistant gene as select marker.The PCR results proved that the foreign DNA had been integrated in the chromosome of T.inflatum and it could be expressed steadily after several generations.This system laid a foundation for genetic engineering breeding of the cyclosporin A-producing strain.

cyclosporin A;Tolypocladium inflatum;protoplasts transformation

Q 813

A

1672-5425(2013)03-0036-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.009

石家莊高端醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)園創(chuàng)新藥物孵化基地資助項(xiàng)目(2011ZX09401-306)

2013-01-09

戴夢(1980-),男,上海人,工程師,研究方向:微生物功能基因組學(xué)及基因工程育種,E-mail:daimeng80927@2008.sina. com,daimeng80927@gmail.com;通訊作者:鄭桂珍,高級工程師。