氣相色譜法同時測定中藥糖漿劑中3種防腐劑含量*

趙培莉，吳靜明，張 毅，韓曉燕，吳麗平

防腐劑是能夠抑制微生物的生長和繁殖，防治保護(hù)對象腐敗變質(zhì)的一類制劑，國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定在食品和藥品中可以限量使用防腐劑。中藥液體制劑如糖漿劑、合劑、煎膏劑、口服液等，由于制劑方面的諸多原因及患者開瓶服藥可能造成的污染[1]，及其在平時貯存使用過程中，多次接觸外界，特別容易發(fā)霉變質(zhì)，添加防腐劑是常見的防腐措施[2]。中國藥典2005年版對部分劑型中防腐劑的使用有部分規(guī)定，其中中藥糖漿劑的防腐劑含量檢測項目并沒有規(guī)定，僅規(guī)定最高限量，苯甲酸和山梨酸為0.3%，對羥基苯甲酸脂類為0.05%[3]。本文主要采用氣相色譜法（FID），建立了一種由樣品經(jīng)甲醇萃取溶解及超聲提取，以鹽酸調(diào)節(jié)適當(dāng)pH值，加入定量內(nèi)標(biāo)物，采用大口徑非極性毛細(xì)管色譜柱測定中藥合劑及糖漿劑中的3中常見防腐劑的檢測分析方法。

1 儀器與試藥

美國安捷倫公司GC-6820型氣相色譜儀、DB-1（30 m×0.25 mm×0.25 μm）大口徑非極性毛細(xì)管色譜柱、氫火焰離子化檢測器（FID）、GHL-500氫氣發(fā)生器、WYK-2型空氣壓縮機(jī)、Agilent Cerity QA-QC NDS化學(xué)工作站、超聲波清洗器、高速離心機(jī)等。

對苯二酚、山梨酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯均為分析純，甲醇為色譜純，檢測樣品隨機(jī)購買市售藥品，見表1。

表1 實際樣品品種及編號

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用美國Agilent公司的DB-1（30 m×0.25 mm×0.25 μm）大口徑非極性毛細(xì)管色譜柱，氫火焰離子化檢測器（FID），載氣：氮?dú)猓兌取?9.999%），流量為25 mL/min；燃燒氣：氫氣（純度＞99.99%），流量為 30 mL/min，空氣流量 360 mL/min。進(jìn)樣口溫度250℃，初始柱溫40℃，保持3 min后，以20℃/min升溫至200℃，保持2 min，檢測器溫度300℃；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取對苯二酚、山梨酸、苯甲酸各0.10g，對羥基苯甲酸乙酯0.05g。將山梨酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯混合，用甲醇定容至50 mL容量瓶，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，質(zhì)量濃度為山梨酸、苯甲酸各物質(zhì)2g/L，對羥基苯甲酸乙酯質(zhì)量濃度為1g/L；將對苯二酚用甲醇定容至50 mL容量瓶，作為內(nèi)標(biāo)液儲備液，質(zhì)量濃度為2g/L。再用10 mL容量瓶定容稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，同時每份加入對苯二酚內(nèi)標(biāo)液儲備液0.10 mL配制成含山梨酸、苯甲酸各物質(zhì)質(zhì)量濃度分別為10、20、30、50、100 μg/mL，含對羥基苯甲酸乙酯質(zhì)量濃度分別為5、10、15、25、50 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液（其中內(nèi)標(biāo)物對苯二酚濃度均為20 μg/mL）。

2.2.2 樣品溶液的前處理 稱取待測糖漿樣品1g左右置于10mL離心管中，加入5mL甲醇，用鹽酸酸化至pH2.5，混勻，超聲提取30min，然后以4 000r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)置于25 mL容量瓶，加入對苯二酚內(nèi)標(biāo)儲備液0.25 mL，定容至25 mL，配制成含內(nèi)標(biāo)物對苯二酚質(zhì)量濃度均為20 μg/mL的樣品待測溶液，備樣直接分析。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)系列混合溶液，進(jìn)樣1 μL，每一濃度重復(fù)測定3次，得到含3種防腐劑及內(nèi)標(biāo)物對苯二酚的氣相譜圖，利用內(nèi)標(biāo)物及各物質(zhì)保留時間對各物質(zhì)進(jìn)行定性，以峰面積平均值為縱坐標(biāo)，各物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到3種防腐劑的工作曲線回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)及線性范圍，見表2。

表2 3種防腐劑的工作曲線回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)

2.4 精密度考察 取20和100 μg/mL的山梨酸、苯甲酸及10和50 μg/mL的對羥基苯甲酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液1 μL樣品用上述氣相色譜條件進(jìn)行分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，根據(jù)每次測定色譜峰面積，計算出所測得各防腐劑含量，并計算出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。3種防腐劑高低兩種濃度其RSD為3.2%～3.9%，認(rèn)為該方法有較好的精密度。結(jié)果見表3。

2.5 加樣回收率實驗 選取經(jīng)過測定試樣中含有對羥基苯甲酸乙酯，山梨酸和苯甲酸兩種防腐劑低于檢出限的中藥糖漿劑樣品1.0g，各添加山梨酸、苯甲酸、對羥基苯甲酸乙酯3種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)品一定量，混勻，按照2.2.2節(jié)所述方法對樣品進(jìn)行前處理，然后按照2.1所述檢測方法進(jìn)行檢測分析，重復(fù)進(jìn)樣3次，計算出回收率。測定結(jié)果表明，RSD分別為2.9%、3.0%、3.7%，回收率分別為95.4%、103.7%、97.8%，可以滿足常規(guī)分析方法的要求。見表4。

表3 中藥合劑及糖漿劑中3種防腐劑同時測定的氣相色譜法精密度實驗結(jié)果ng

表4 中藥合劑及糖漿劑中3種防腐劑加標(biāo)回收率計算結(jié)果（n=3）

2.6 最低檢測限考察 對5個濃度的防腐劑標(biāo)準(zhǔn)品系列混合溶液進(jìn)行分析，得到不同的色譜峰高和峰面積，以色譜峰高度是基線噪聲高度的3倍作為標(biāo)準(zhǔn)計算檢出限。山梨酸為1.2 μg/mL；苯甲酸為1.8 μg/mL；對羥基苯甲酸乙酯為 0.7 μg/mL。

2.7 樣品中防腐劑的含量測定 用上述色譜條件及實驗方法對以下6種中藥合劑及糖漿劑樣品（見表1）進(jìn)行檢測分析，獲得結(jié)果，見表5。

表5 市售部分中藥合劑及糖漿劑中防腐劑的檢測結(jié)果

可見，樣品中所含防腐劑檢測出的種類和含量均符合現(xiàn)行國家藥品標(biāo)準(zhǔn)允許量。

3 討論

國內(nèi)外有許多學(xué)者對食品中防腐劑山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸的檢測進(jìn)行了研究，他們大都采用氣相色譜法和液相色譜法[4-9]。但這些方法操作復(fù)雜、時間長，不能適應(yīng)食品藥品行業(yè)發(fā)展的需要[9]。

本實驗采用SE-54型高惰性交聯(lián)弱極性色譜柱（30 m×0.25 mm×0.32 μm）對 3種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行測試，結(jié)果顯示其能較好地分離各組分，但是拖尾比較嚴(yán)重。而采用DB-1型大口徑非極性毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）則較好地解決上述問題，同時還可以提高分析速度，減少固定相流失。氣相色譜法分析中柱溫的選擇和升溫程序設(shè)置是一個重要的因素。為縮短分析周期，并保證方法有較高的靈敏度和分離效果，對不同的初始柱溫進(jìn)行了實驗，當(dāng)初始柱溫在40～70℃時，單位進(jìn)樣量峰高基本不變；當(dāng)初始柱溫大于70℃時，甲醇峰高明顯降低。因此，選擇初始柱溫為40℃，保持3 min之后程序升溫，使樣品中山梨酸、苯甲酸色譜峰拖尾現(xiàn)象減少，并較好的分離了3種防腐劑。色譜峰通過對照保留時間、內(nèi)標(biāo)物的峰高及峰面積，并經(jīng)過加標(biāo)增加峰高的方法來定性，確保了該方法的準(zhǔn)確性。

上述結(jié)果表明，該方法具有檢測時間短、消耗試劑少、前處理簡單、使用樣品量少、方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好及精密度高等優(yōu)點(diǎn)，并可應(yīng)用于合劑及糖漿劑的監(jiān)測工作。

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