新生脈散片的提取工藝研究*

劉建海，崔維利，陳 濤，孟 萌

300193 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（崔維利，陳 濤，孟 萌）

新生脈散片具有益氣、活血、利水的功效，臨床用于治療氣虛血瘀水停證。全方由刺五加、黃芪、黨參、丹參等9味中藥材組成，方中君藥刺五加，功能益氣健脾，補(bǔ)腎安神，主含紫丁香苷等成分；黃芪功能補(bǔ)氣固表，利尿托毒，主含黃芪甲苷等成分[1]。為保證藥物療效和有效成分的提取效果，實(shí)驗(yàn)中參考有關(guān)文獻(xiàn)[2-9]，采用正交實(shí)驗(yàn)法，以紫丁香苷含量和黃芪甲苷含量為考察指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，優(yōu)選新生脈散片的提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司，配備Waters ACQUITY PDA二極管陣列檢測(cè)器，四元溶劑管理器，自動(dòng)進(jìn)樣恒溫管理器，EmpowerⅢ色譜工作站）；Waters 600E HPLC高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司，配備Waters 2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，Waters 600E四元高壓泵，Waters In-Line脫氣機(jī)，EmpowerⅡ色譜工作站）；AG135電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；DZKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試藥 紫丁香苷對(duì)照品（批號(hào)111574-200603）、黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)110781-200109），均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；方中藥材購(gòu)自安徽亳州藥材公司，經(jīng)鑒定均符合中國(guó)藥典2010年版一部要求；乙腈（色譜純，美國(guó)Dikma公司）；磷酸（色譜純，天津科密歐公司）；正丁醇（天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司）；氨水（天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司）；水為自制超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)資料及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，影響有效成分提取效果的主要因素為加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）。實(shí)驗(yàn)中對(duì)上述每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表，對(duì)新生脈散片的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，因素水平見表1。

表1 因素與水平

2.2 考察指標(biāo)及評(píng)分方法 采用紫丁香苷含量和黃芪甲苷含量為考察指標(biāo)，各占50%加權(quán)計(jì)算綜合評(píng)分，對(duì)新生脈散片的提取工藝進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。按下式計(jì)算綜合評(píng)分。綜合評(píng)分＝（紫丁香苷含量／最大紫丁香苷含量）×50%×100＋（黃芪甲苷含量／最大黃芪甲苷含量）×50%×100。

2.3 紫丁香苷的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEN C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水-磷酸（5∶95∶0.4）；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；柱溫：30℃。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥12h的紫丁香苷對(duì)照品10.00mg，加甲醇溶解并定容至50 mL，即得0.200g/L的對(duì)照品貯備溶液。分別精密量取對(duì)照品貯備溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加甲醇稀釋并定容至10 mL，分別精密吸取上述溶液及對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各1μL，依次注入超高效液相色譜儀，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，以峰面積值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的濃度（g/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y贊=1.43×107X－5.55×104，r＝0.999 8（n＝6）。結(jié)果表明，紫丁香苷在 0.020～0.200g/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取紫丁香苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并配制成0.080g/L的溶液，過0.22 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液作為對(duì)照品溶液。

2.3.4 供試品溶液的制備 取新生脈散片處方中各藥材共9份，按正交實(shí)驗(yàn)表中的條件，分別加水回流提取，合并水提液，靜置，濾過，濃縮至每1 mL相當(dāng)于1g原生藥材的流浸膏，精密量取10 mL，用水飽和的正丁醇提取4次，每次20mL，合并正丁醇液，精密量取正丁醇液40 mL備用，其余正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，過0.22 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.5 陰性供試品溶液的制備 取處方中除刺五加外其余藥物按“2.3.4”項(xiàng)制備方法，制成刺五加陰性供試品溶液。

2.3.6 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各1 μL，注入超高效液相色譜儀，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，陰性供試品色譜中，在與紫丁香苷對(duì)照品峰相應(yīng)的位置上無干擾峰，結(jié)果見圖1。

2.3.7 樣品含量測(cè)定 分別精密吸取“2.3.4”項(xiàng)下制備的供試品溶液各1 μL，依次注入超高效液相色譜儀，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算紫丁香苷的含量。

2.4 黃芪甲苷的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 Waters Sunfire TM C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（35∶65）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)：漂移管溫度為65℃，載氣壓力為35 kPa。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品12.00 mg，加甲醇溶解并定容至50 mL，即得0.240g/L的對(duì)照品貯備溶液。分別精密量取對(duì)照品貯備溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，加甲醇稀釋并定容至10 mL，分別精密吸取上述溶液及對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各10 μL，依次注入高效液相色譜儀，按“2.4.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，以峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（mg/mL）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y贊=1.23X+6.17，r=0.999 7（n＝6）。結(jié)果表明，黃芪甲苷在0.024～0.240g/L濃度范圍內(nèi)，對(duì)照品濃度的對(duì)數(shù)值與峰面積的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

2.4.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并配制成0.120g/L的溶液，過0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液作為對(duì)照品溶液。

2.4.4 供試品溶液的制備 取“2.3.4”項(xiàng)下備用的正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次20 mL，棄去氨試液，正丁醇液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，過0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4.5 陰性供試品溶液的制備 取處方中除黃芪外其余藥物按“2.4.4”項(xiàng)制備方法，制成黃芪陰性供試品溶液。

2.4.6 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.4.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，陰性供試品色譜中，在與黃芪甲苷對(duì)照品峰相應(yīng)的位置上無干擾峰，結(jié)果見圖2。

圖2 黃芪甲苷高效液相色譜圖

2.4.7 樣品含量測(cè)定 分別精密吸取“2.4.4”項(xiàng)下制備的供試品溶液各10 μL，依次注入高效液相色譜儀，按“2.4.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算黃芪甲苷的含量。

2.5 干膏率的測(cè)定 精密量取水提液50 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3 h，移置干燥器中冷卻30 min，取出后迅速稱定質(zhì)量，按下式計(jì)算干膏率。干膏率（%）＝（干浸膏質(zhì)量／藥材質(zhì)量）×100%。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 以紫丁香苷含量和黃芪甲苷含量為考察指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

表2分析結(jié)果表明，各因素對(duì)紫丁香苷含量和黃芪甲苷提取效果的影響順序?yàn)镃>B>A，即提取次數(shù)>提取時(shí)間>加水量，因此，提取次數(shù)在新生脈散片的提取工藝中影響最大。表3分析結(jié)果表明，提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提取時(shí)間、加水量對(duì)提取效果的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合直觀分析和方差分析，同時(shí)考慮提高效率及節(jié)約能源等因素，優(yōu)選提取工藝的最佳水平為A2B2C3，即：處方藥材加10倍量水，提取3次，每次1.5 h。

2.7 驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn) 按正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳工藝條件提取3批樣品，分別測(cè)定紫丁香苷含量、黃芪甲苷含量、干膏率，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該提取工藝條件穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性好。因此新生脈散片的最佳提取工藝為：處方藥材加10倍量水，提取3次，每次1.5 h。

3 討論

新生脈散具有益氣、活血、利水的功效，是中醫(yī)治療氣虛血瘀水停證的常用方劑，原方以水為溶媒，采用湯劑形式應(yīng)用于臨床療效顯著。新生脈散片是在原方基礎(chǔ)上開發(fā)的新劑型，在保證原方療效的同時(shí)，又具有服用量小、服用方便、口感改善、便于保存等優(yōu)點(diǎn)。

刺五加和黃芪均為方中君藥，紫丁香苷、黃芪甲苷為方中君藥的主要有效成分。因此，為保證全方中主要有效成分的提取效果，以紫丁香苷和黃芪甲苷含量各占50%加權(quán)，計(jì)算綜合評(píng)分，作為提取工藝的考察指標(biāo)；干膏率是確定制劑規(guī)格的重要參數(shù)，但由于不參與對(duì)療效的貢獻(xiàn)，所以在驗(yàn)證正交實(shí)驗(yàn)中對(duì)其進(jìn)行考察。

實(shí)驗(yàn)中紫丁香苷及黃芪甲苷的供試品溶液制備方法均為液液提取法，該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)紫丁香苷及黃芪甲苷的提取，而采用堿性的氨試液洗滌，可以進(jìn)一步富集黃芪總皂苷，提高黃芪甲苷轉(zhuǎn)化率，最終提高黃芪甲苷含量。所建立的供試品溶液制備方法，在保證提取效果的前提下，簡(jiǎn)化了操作步驟，便于在實(shí)際工作中使用。

實(shí)驗(yàn)中采用超高效液相色譜（UPLC）法測(cè)定紫丁香苷的含量，UPLC法較高效液相色譜（HPLC）法更加簡(jiǎn)便快速，能得到更高的分析靈敏度，減少有機(jī)溶劑的消耗。采用二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定黃芪甲苷的含量時(shí)，檢測(cè)效果不理想；而采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)（ELSD）器測(cè)定時(shí)，對(duì)照品峰面積的對(duì)數(shù)值與濃度的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

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