聚乙二醇硬脂酸酯15對(duì)黃芩苷角膜透過性研究*

張 銳，趙海南，瞿繼蘭，李 琳，李 楠，劉志東

在臨床上，黃芩苷對(duì)眼科疾病如角膜炎、結(jié)膜炎的治療作用已經(jīng)得到廣泛肯定，對(duì)眼科常見的病原菌也均有很強(qiáng)的抑菌殺菌作用。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)上市的黃芩苷眼用制劑主要為滴眼液，但是由于黃芩苷的理化性質(zhì)以及滴眼液本身存在的劑型缺點(diǎn)，黃芩苷滴入眼部后會(huì)大量流失，從而造成藥效的維持時(shí)間較短，生物利用度較低。另外，角膜是呈弧形的透明生物膜，對(duì)外源性異物具有屏障作用，由于其上皮滲透性較差，成為影響眼用制劑吸收的主要因素。所以，改善角膜透過性，增加藥物的跨膜吸收，提高藥物的生物利用度成為眼用制劑面臨的主要問題。目前解決的方法主要是應(yīng)用滲透促進(jìn)劑，如聚乙二醇硬脂酸酯 15（SolutolHS 15，Sol），一種聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯，低毒非離子表面活性劑，已經(jīng)被應(yīng)用于經(jīng)皮和口服給藥系統(tǒng)。

本文的模型藥物為黃芩苷，考察了滲透促進(jìn)劑Sol對(duì)黃芩苷角膜透過率的影響，并探討了其作用機(jī)制，從而明確Sol作為一種新型的滲透促進(jìn)劑在眼部給藥系統(tǒng)的應(yīng)用前景。

1 儀器和試劑

改良Franz擴(kuò)散池﹙上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司），TK-20A型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀﹙上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司﹚，AX205電子天平（MettleToledo，瑞士），Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore，美國(guó)），SPD-10Avp島津高效液相色譜儀（HPLC）（Shimadzu，日本），AT-130柱溫箱（大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。黃芩苷原料藥（天津中新藥業(yè)，含量>90%），黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），聚乙二醇硬脂酸酯15（北京鳳禮精求商貿(mào)有限公司），其他試劑均為分析純。

白色家兔，雌雄兼用，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由北京沙河通利實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，合格證號(hào)：SLXK京2010-0004。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)裝置 本實(shí)驗(yàn)采用改良的Franz立式擴(kuò)散池，它由兩個(gè)內(nèi)徑大小相同的供給池和接受池組成，供給池的容積為0.5mL，接受池的容積為4.5mL，內(nèi)半徑為0.4 cm，有效的擴(kuò)散面積為0.50 cm2。

2.2 樣品溶液的配制

2.2.1 空白溶液的配制 精密稱取黃芩苷0.1g，充分溶解于100 mL的新鮮pH 6.5磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，得黃芩苷pH 6.5 PBS溶液，作為空白對(duì)照溶液。

2.2.2 0.2%～2.0%Sol溶液的配制 分別稱取適量Sol加入新配制的10 mL空白對(duì)照溶液中，得到所需的不同濃度的Sol黃芩苷pH 6.5 PBS溶液。

2.3 離體角膜透過實(shí)驗(yàn) 將家兔耳緣靜脈注射空氣致死，在致死后的20 min內(nèi)，用眼科手術(shù)剪和鑷子小心分離出角膜，并除去虹膜、鞏膜、睫狀體等多余的眼部組織，然后將離體的新鮮角膜小心的放在已放入攪拌子的接受池和供給池的中間，確定角膜的上皮層面向供給池之后，固定角膜，最后在接受池中加入4.5 mL新鮮配制的pH 6.5 PBS溶液，在供給池中加入0.5 mL不同藥物濃度的Sol溶液，并將供給池用保鮮膜密封。

裝置置于透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀中，溫度控制在37℃。實(shí)驗(yàn)開始之后，分別于 40、80、120、160、200、240 min從接受池中將溶液全部取出，同時(shí)分別補(bǔ)充同溫等體積的pH 6.5 PBS溶液4.5 mL，樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，取樣20 μL，作HPLC分析。

2.4 數(shù)據(jù)處理 單位面積累積透過量Q計(jì)算公式如下：

其中：Cn為t時(shí)間藥物的測(cè)定濃度；Ci為t時(shí)間前的測(cè)定濃度；V0為接受池中溶液體積；V為取樣體積。

表觀滲透系數(shù)（Papp，cm/s）計(jì)算公式如下：

其中：C0為供給池初始藥物濃度；A為有效透過面積；ΔQ/Δt可由累積透過量—時(shí)間曲線穩(wěn)態(tài)部分的斜率求得。

表觀滲透系數(shù)及穩(wěn)態(tài)流量均以單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

穩(wěn)態(tài)流量Jss計(jì)算公式如下：

2.5 角膜水化值的測(cè)定 角膜水化值是體外評(píng)價(jià)物質(zhì)對(duì)角膜組織刺激性的重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)以水化值考察促滲劑Sol對(duì)兔眼角膜的損傷。角膜水化值（H）計(jì)算公式如下：

其中，mb為體外實(shí)驗(yàn)后暴露于擴(kuò)散介質(zhì)的角膜區(qū)域的角膜質(zhì)量；ma為60℃干燥16 h后再次稱質(zhì)量的角膜質(zhì)量。

2.6 樣品測(cè)定

2.6.1 色譜條件 參照文獻(xiàn)[1-2]，黃芩苷色譜條件為色譜柱：Diamond DIKMAODS-C18；流動(dòng)相：甲醇∶水∶磷酸（60∶40∶0.05）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35 ℃。

2.6.2 專屬性考察 分別取空白角膜溶出物及含藥角膜溶出物的pH 6.5 PBS各20μL，作高效液相色譜（HPLC）分析，記錄色譜圖。如圖1、圖2所示，空白角膜溶出物不干擾藥物的HPLC測(cè)定。

2.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密配制濃度為0.021 1～0.7385μg/mL的黃芩苷pH6.5PBS溶液，進(jìn)樣20μL，記錄峰面積。直線回歸方程：A=562 52×C－459.01，r2=0.999 9，線性范圍為 0.021 1～0.738 5 μg/mL，如圖 3所示，樣品質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。在此范圍內(nèi)配制高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的黃芩苷pH 6.5 PBS 溶液 0.105 5、0.316 5、0.422 μg/mL，測(cè)得日內(nèi)精密度RSD分別為0.32%、0.12%、0.21%，日間精密度RSD分別為0.55%、0.15%、0.19%，說明儀器精密度良好。

圖3 PBS溶液中黃芩苷回歸直線

2.7 結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)以黃芩苷pH 6.5 PBS溶液為對(duì)照，分別考察了0.2%、0.4%、0.8%、1.0%和2.0%的Sol為促滲劑時(shí)黃芩苷的角膜透過性。黃芩苷離體角膜透過參數(shù)見表1、表2，角膜透過曲線圖見圖4，Sol對(duì)角膜水化值的影響見表3。

圖4 Sol對(duì)黃芩苷離體角膜透過率的影響

如圖4所示，黃芩苷的表觀滲透系數(shù)隨著Sol濃度的升高而逐漸升高，而達(dá)到最大值之后，又隨著Sol濃度的繼續(xù)升高而逐漸減小。Sol的濃度為0.4%、0.8%時(shí)，黃芩苷的表觀滲透系數(shù)分別增加了2.05倍、1.65倍，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

正常的角膜水化值為76%～80%，超過83%即可判定角膜受到一定程度的損傷[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]，Sol具有較高的生理耐受性，體積分?jǐn)?shù)低于10%對(duì)兔眼角膜沒有刺激性。另劉睿等[5]實(shí)驗(yàn)過程中0.1%～1.0%的Sol對(duì)角膜無刺激性，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)此范圍的體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行了主要考察。由表3可知，本實(shí)驗(yàn)中含不同濃度Sol的黃芩苷溶液對(duì)角膜水化值沒有顯著影響，表明實(shí)驗(yàn)過程中角膜上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞沒有被損傷。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用pH 6.5 PBS溶液做為擴(kuò)散介質(zhì)，主要因?yàn)辄S芩苷為弱酸性化合物，因此其在堿性溶液中降解迅速，在偏酸性的溶液中穩(wěn)定性相對(duì)較好。GBR液是一種生理溶液，其能保存離體角膜達(dá)6 h，因此在體外角膜透過實(shí)驗(yàn)中多采用此溶液，但因GBR液呈堿性，黃芩苷在此溶液中極不穩(wěn)定，因而最終舍棄。最終選擇與生理環(huán)境相近且穩(wěn)定性較好的pH 6.5 PBS溶液作為體外角膜透過的接收液。

劉睿等[5]實(shí)驗(yàn)結(jié)果闡述了Sol增加角膜透過量的可能機(jī)制，由于Sol在角膜上皮細(xì)胞的磷脂雙層中形成膠束，然后將細(xì)胞中的磷脂消除，從而達(dá)到增加藥物角膜透過量的作用。另有研究表明[6-10]，Sol促進(jìn)藥物在黏膜的吸收作用機(jī)制是使細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層運(yùn)動(dòng)更加有序，增加了膜的通透性，從而利于藥物的吸收。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sol顯著增加了藥物的角膜透過，并且具有濃度依賴性，0.4%和0.8%的Sol使黃芩苷的表觀滲透系數(shù)分別增加了2.05倍和1.65倍，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且對(duì)角膜無刺激性。表明一定濃度的Sol可顯著提高黃芩苷的角膜透過率，且對(duì)角膜無刺激性，因此Sol作為一種新型的滲透促進(jìn)劑在眼部給藥系統(tǒng)中可被廣泛應(yīng)用。

表1 不同濃度Sol對(duì)黃芩苷離體角膜累積透過量的影響（±s，n=3）

表1 不同濃度Sol對(duì)黃芩苷離體角膜累積透過量的影響（±s，n=3）

Sol濃度（%）線性關(guān)系 r2 40 min 80 min 120 min 160 min 200 min 240 min藥物的累積透過量（μg/cm2）0.0 0.176 1±0.077 6 0.518 0±0.049 2 1.054 1±0.055 5 1.842 0±0.148 6 2.756 2±0.117 9 3.763 3±0.178 6 Q=0.018 2 t-0.858 9 0.970 2 0.2 0.255 9±0.097 2 0.747 8±0.144 6 1.421 3±0.210 3 2.300 2±0.104 5 3.191 7±0.084 3 4.177 6±0.184 1 Q=0.019 9 t-0.766 2 0.987 5 0.4 0.209 9±0.028 0 1.042 3±0.230 2 2.269 4±0.404 0 3.812 8±0.568 0 5.480 7±0.672 7 7.616 5±0.941 0 Q=0.037 1 t-1.783 9 0.979 0 0.8 0.335 3±0.083 6 1.028 1±0.078 3 2.010 7±0.061 4 3.310 5±0.467 4 4.806 8±0.786 0 6.249 8±0.917 5 Q=0.030 1 t-1.263 9 0.983 5 1.0 0.130 7±0.053 1 0.501 3±0.063 5 1.271 6±0.129 8 2.151 2±0.187 7 3.097 4±0.151 2 4.173 3±0.223 8 Q=0.020 6 t-1.000 6 0.981 1 2.0 0.078 6±0.018 7 0.552 8±0.058 6 1.189 3±0.033 0 1.988 2±0.026 7 2.896 7±0.137 1 3.604 2±0.123 2 Q=0.018 2 t-0.827 6 0.990 8

表2 不同濃度Sol對(duì)黃芩苷離體角膜透過參數(shù)的影響（±s，n=3）%

表2 不同濃度Sol對(duì)黃芩苷離體角膜透過參數(shù)的影響（±s，n=3）%

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

測(cè)定項(xiàng)目 0 0.2 0.4 0.8 1.0 2.0 Papp×106（cm/s）10.03±0.7511.03±0.6720.57±2.42**16.60±3.08*11.37±0.4310.08±0.55 Jss×103[μg（s/cm2）]10.15±0.76 11.08±0.76 20.82±2.44** 16.80±3.11* 11.42±0.34 10.13±0.63

表3 Sol對(duì)角膜水化值的影響（±s，n=3）%

表3 Sol對(duì)角膜水化值的影響（±s，n=3）%

測(cè)定項(xiàng)目 0 0.2 0.4 0.8 1.0 2.0角膜水化值 77.77±1.65 76.06±0.34 82.62±0.84 78.23±2.76 79.29±1.94 81.70±1.32

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