Annexin A2的表達上調及其23位酪氨酸磷酸化促進乳腺癌細胞MCF-7的增殖和侵襲

王宇晴，張 飛，田 然，孫秀梅，劉 媛，王智勇,牛瑞芳

（天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，天津市腫瘤防治重點實驗室，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津300060）

Annexin A2（以下稱Anxa2）是一種膜聯(lián)蛋白，能夠通過調節(jié)細胞外各種蛋白水解酶的相互作用影響腫瘤的侵襲和轉移過程[1-2]。Anxa2非折疊且高度分化的N端結構域有兩個磷酸化位點，即23位的酪氨酸和25位的絲氨酸[3]。有報道稱，第23位酪氨酸的磷酸化對于Anxa2由細胞質向細胞膜的聚集及其調節(jié)胰腺癌細胞的侵襲和遷移至關重要[4-5]。為研究Anxa2及其23位酪氨酸磷酸化在乳腺癌細胞的粘附、增殖、遷移和侵襲等活動中所起作用，對Anxa2基因第23位酪氨酸進行了不同活性狀態(tài)的突變，觀察Anxa2及其23位酪氨酸的磷酸化狀態(tài)對乳腺癌細胞MCF-7生物學特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、菌種與質粒 293T細胞、MCF-7細胞均購自美國ATCC（Amercian Type Culture Collection）細胞庫，293T用DMEM HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基+10%的 FBS（Hyclone）培養(yǎng)，MCF-7用 RPMI-1640培養(yǎng)基+10%的 FBS（Hyclone）培養(yǎng)；DH5α 感受態(tài)細胞購于北京全式金公司；pEGFP-N3-Anxa2、pCDH、慢病毒包裝質粒psPAX2、pMD2.G均購自中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心。

1.1.2 酶、藥物、試劑及抗體 限制性內切酶Xho1、Not1、BagII、BamH1、T4DNAligase, 購 自 Fermentas公司；Phusion熱啟動‖高保真DNA聚合酶購于Thermo公司;DpnI購自Bio Labs公司。卡那霉素、氨芐霉素、嘌呤霉素、MTT及其他化學藥品均購自Sigma。質粒提取試劑盒購自QIA GEN公司；凝膠回收試劑盒購自Takara公司；Lipofectamine2000購于Invitrogen公司；transwell小室（0.45 μm）購自美國Millipore公司；β-Actin，GFP，Anxa2的小鼠單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

2.2 重組慢病毒質粒pCDH-EGFP-Anxa2及其突變體的鑒定 提取Anxa2突變體的慢病毒質粒進行Bgl II、Not I雙酶切驗證，酶切結果經電泳顯示為1 kb片段和4.7 kb片段兩條（圖2），與預期一致，表明Anxa2突變體已經成功插入pCDH載體。測序結果顯示，重組質粒中插入的Anxa2及其突變體序列，除突變位點外，其余均未發(fā)生突變。

Tyr-Ala-F：5′-AGTGCAGCTGGGTCTGTCAAA GCCTATACTAAC-3′，Tyr-Ala-R：5′-CAGCTGCACT TGGGGGTGTAGAGTGATC-3′；Tyr-Asp-F：5′-AGT GCAGATGGGTCTGTCAAAGCCTATACTAAC-3′，T yr-Asp-R：5′-CATCTGCACTTGGGGGTGTAGAGT GATC-3′（下劃線部分為突變位點）。引物由北京六合華大基因公司合成。PCR體系為：質粒pEGFP-N3-Anxa230 ng，上下游引物各 15 pmol，dNTP 10 pmol，Phusion DNA Polymerase 0.5 μL，5xPhusion GC buffer 10 μL，去離子水補充到 50 μL。PCR 條件為：變性98℃，45 s；98 ℃，10 s，70℃，3 min；25 個循環(huán)，72 ℃，10 min冷卻至4℃。PCR產物經DpnI酶消化后，轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，挑取單克隆，提取質粒送交上海英俊基因測序公司測序。

2.1 pEGFP-Anxa2突變體的鑒定 挑取5個Anxa2的突變體克隆進行測序，測序結果表明5個克隆的質粒都分別在第23個密碼子處發(fā)生了突變（TAT-GCT，TAT-TGG），其他地方則未發(fā)生突變，成功將23位酪氨酸突變?yōu)楸彼岷吞於彼幔▓D1）。

需求情況：氮肥方面，農業(yè)需求總體清淡，各地基本無用肥需求；工業(yè)需求一般，下游按需采購，膠板廠受環(huán)境污染治理等工作影響，復合肥企業(yè)淡季檢修，開工率均呈現(xiàn)下降趨勢，對尿素采購需求減少。磷肥方面，國內西北地區(qū)冬儲市場已啟動，甘肅地區(qū)廠家已將訂單簽訂至次年2月份；長江和云南地區(qū)企業(yè)仍以出口市場為主，集港發(fā)運較快，新訂單零星。鉀肥方面，復合肥企業(yè)開工率下降，對鉀肥采購需求減少。復合肥方面，華北地區(qū)秋季備肥市場掃尾，華東地區(qū)秋季備肥可持續(xù)到10月底，南方果蔬用肥需求展開，基層剛性農需釋放。

1.2.3 感染及驗證 用上述步驟中包裝產生的慢病毒顆粒輔以陽離子聚合劑Polybrene（Sigma）感染人乳腺癌細胞MCF-7，用含有Puromycin的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉染的細胞克隆，并用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況，用Western blot和免疫熒光技術驗證穩(wěn)定轉染的細胞中Anxa2及其突變體的表達情況。Western blot和免疫熒光的步驟如前[6]。

2.3 重組慢病毒質粒在人乳腺癌細胞MCF-7中穩(wěn)定表達 人乳腺癌細胞系MCF-7經慢病毒顆粒感染后經嘌呤霉素（4 μg/mL）篩選獲得穩(wěn)定細胞株克隆Anxa2-WT、Anxa2-Y23A 和 Anxa2-Y23D（圖 3）。Western blot結果顯示，GFP蛋白僅在Anxa2-WT、Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D中表達，在MCF-7及其對照組細胞中不表達（圖4）；對Anxa2-WT和MCF-7行免疫熒光檢測表明，Anxa2-WT的紅色熒光明顯比MCF-7的細胞亮（圖5）。表明Anxa2及其突變體在MCF-7細胞中穩(wěn)定表達。

1.2.6 Transwell檢測細胞的侵襲能力 配備濃度為5×105個/mL的無血清細胞懸液，將400 μL細胞懸液加入鋪有Matrigel（BD公司）的transwell小室上室，下室中加入800 μL含10%FBS的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培育36 h，拭去未穿膜細胞，以無水甲醇固定并用結晶紫染色，顯微鏡計數(shù)穿膜細胞。

所謂“知止”，既是自覺地節(jié)制，是在思維上將自身置身于矛盾雙方所形成的平衡的平衡點。 具體表現(xiàn)為一種與自身超然地位相對應的宏觀思維以及在此思維指導下的盡可能客觀的行事方式。 通過這種思維及行為，使自身的存在成為平衡的中心點，從而把握矛盾的轉化點，從而將不利于己的現(xiàn)實或形勢導向對自己有利的方面，在保證基礎不受損傷或平衡不被顛覆的前提下謀求發(fā)展，確保統(tǒng)治者在社會活動或政治活動中轉化的主動權，實現(xiàn)長久不衰的統(tǒng)治，也就是“?！?。

1.2.4 細胞增殖能力的檢測 分別采用MTT法和克隆形成法檢測細胞的增殖能力。MTT法如下：以每孔3000個細胞種植96孔板，分別于細胞貼壁 后 0、24、48、72、96、120、144 h 每 孔 加 MTT（5 mg/mL，Sigma）20 μL，37 ℃，5%CO2的潮濕環(huán)境中孵育4 h后，每孔加150 μL二甲基亞砜并于570 nm波長處檢測吸光度（OD值）。克隆形成法如下：以每孔200個細胞種植6孔板，1周后以無水甲醇固定，結晶紫染色后可在顯微鏡下觀察并計數(shù)細胞克隆。

1.2.5 劃痕檢測細胞的遷移能力 以每孔1×104個細胞種植6孔板，待細胞貼壁后，用白槍頭在孔內劃痕，PBS洗去漂浮細胞，通過不同時間點觀察細胞的劃痕距離，分析細胞的遷移能力。

1.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件分析，不同實驗組間的差異分析通過單因素方差分析或者t檢驗來完成，計量資料以±s表示，P<0.05時為差異有統(tǒng)計學意義，所有實驗均重復3次以上。

當下高速發(fā)展的社會經濟是一把雙刃劍，不僅可以促進供電企業(yè)的發(fā)展，也可以致使部分企業(yè)喪失市場競爭力，如何應對電力需求量不斷增加的挑戰(zhàn)，確保電力營銷抄核收工作的準確性，是企業(yè)長期發(fā)展的目標。電力營銷抄核收工作作為供電流程中的重要環(huán)節(jié)，企業(yè)應該及時針對存在的問題，進行模式改革、創(chuàng)新，正確處理管理模式落后、抄表系統(tǒng)不健全、核收有漏洞等約束企業(yè)發(fā)展的問題，靈活運用高科技技術和先進設備，提高抄核收系統(tǒng)的自動化和智能化水平，不斷健全企業(yè)內部的管理體系，提升電力企業(yè)的輸出質量和運輸效率，努力使得供電能力滿足逐漸增加的用電需求，完善電力服務工作。

2 結果

1.2.2 重組質粒的構建及慢病毒包裝 以BgII和Not I雙酶切質粒pEGFP-N3-Anxa2及其突變體，以BamHI和NotI雙酶切pCDH載體，膠回收酶切產物并連接過夜，挑取克隆經酶切驗證，取陽性克隆送交上海英俊基因測序公司進行測序。將測序成功的重組質粒、慢病毒包裝質粒psPAX2、pMD2.G和Lipofectamine2000經無血清的培養(yǎng)基稀釋后加入293T細胞中，48 h后收集并濃縮含有病毒顆粒的培養(yǎng)液。

對照組患者采用常規(guī)腦出血治療,依據(jù)患者影像診斷采用常規(guī)治療,采用醒腦注射液治療,并且作止血、防感染操作。

圖1 野生型Anxa2和第23位酪氨酸突變體表達載體的測序結果Fig 1 The sequencing results of wild type and mutants on Tyrosine 2

1.2.1 目的質粒的構建、擴增及鑒定 以現(xiàn)有質粒pEGFP-N3-Anxa2為模板，采用PCR定點突變技術構建Anxa2第23位酪氨酸突變?yōu)楸彼岷吞於彼岬馁|粒：pEGFP-N3-Anxa2Y23A，pEGFP-N3-Anxa2Y23D。根據(jù)Anxa2基因序列，設計含有目的突變基因的兩對引物，分別是：

圖2 重組質粒雙酶切前后的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 2 The agarose gel electrophoretogram of recombinant before and after digested by restriction enzyme

在《國務院關于加快養(yǎng)老服務業(yè)若干意見》中闡釋了兩種醫(yī)養(yǎng)結合的類型[7]：一種是在醫(yī)療機構中引入養(yǎng)老模塊,使具有條件的醫(yī)療部門增加康復和保健功能,開辟專門的養(yǎng)老專區(qū);另一種是在養(yǎng)老設施中增加醫(yī)療服務的功能,使養(yǎng)老設施在原有功能基礎上,拓展醫(yī)的內容,以此滿足老年人的醫(yī)療需要．

2.4 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的增殖能力顯著增強 通過MTT法做出的細胞生長曲線和克隆形成實驗統(tǒng)計結果顯示，Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的增殖能力和克隆形成能力高于MCF-7、control及 Anxa2-Y23A（圖 6A、B），但是 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D之間并無明顯差異。

圖5 Anxa2-WT和MCF-7中Anxa2的免疫熒光圖（×400）Fig 5 Immunofluorescence analysis of AnxaA2 in Anxa2-WT and MCF-7 cells（×400）

圖6 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的增殖能力顯著增強Fig 6 Ability of proliferation and invasion of Anxa2-WT andAnxa2-Y23D has been significantly enhanced

2.5 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的遷移及侵襲能力增強 對 MCF-7、control、Anxa2-Y23A、Anxa2-WT和Anxa2-Y23D等5組細胞進行劃痕實驗，結果顯示，Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的傷痕愈合時間比MCF-7、control及Anxa2-Y23A的傷痕愈合時間短（圖7A）；同樣，穿過鋪有Matrigel基底膜的Anxa2-WT和 Anxa2-Y23D的細胞數(shù)多于 MCF-7、control、Anxa2-Y23A3 組細胞（圖 7B、C）。Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的遷移及侵襲能力增強。

圖7 Anxa2-WT和Anxa2-Y23D的遷移和侵襲能力提高Fig 7 Ability of migration and invasion of Anxa2-WT and Anxa2-Y23D has been significantly enhanced

3 討論

膜聯(lián)蛋白Anxa2屬于膜聯(lián)蛋白家族，是一種鈣離子依賴的磷脂結合超蛋白，廣泛高表達于各類癌組織中，對于促進腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉移能力有重要作用[1-2，7-8]。課題組前期研究已經證實，在乳腺癌細胞系MCF-7/ADR及MDA-MB-231中，轉入小干擾RNA降低Anxa2的表達后，細胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移和侵襲能力均顯著下降，與之相關的一系列調控細胞周期及增殖的蛋白如 cyclin D1、c-Myc、MMP-2、MMP-9 等的表達也相應下降[9-11]。研究者通過對Anxa2第23位酪氨酸突變?yōu)楸彼岷吞於彼岬耐蛔凅w的研究發(fā)現(xiàn)，第23位酪氨酸的磷酸化對于Anxa2由細胞質向細胞膜的聚集及其調節(jié)胰腺癌細胞的侵襲和遷移至關重要[4]，但是其對于Anxa2在乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲中所起作用的報道卻寥寥無幾。

計及儲能運行特性的獨立型交直流混合微網(wǎng)優(yōu)化調度//張志昌,吳健,駱釗,徐近龍,金雪,李鶴健//(19):118

為觀察Anxa2及其23位酪氨酸的磷酸化在乳腺癌細胞增殖、遷移、侵襲等中所起作用，通過PCR定點突變技術，將Anxa2第23位酪氨酸分別突變?yōu)楸彼幔╕23A）和天冬氨酸（Y23D）（圖 1），然后將野生型Anxa2WT，突變體Anxa2Y23A以及Anxa2Y23D分別轉入乳腺癌細胞系MCF-7中，得到Anxa2表達上調，持續(xù)處于抑制狀態(tài)或模擬其持續(xù)激活狀態(tài)的細胞模型，分別是 Anxa2-WT，Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D。以 MCF-7，control（轉入空質粒），Anxa2-WT，Anxa2-Y23A和Anxa2-Y23D 5組細胞為模型，通過MTT法（圖6A）和克隆形成實驗（圖6B）檢測細胞的增殖能力和克隆形成能力，結果表明Anxa2表達上調以及Anxa2第23位酪氨酸磷酸化能夠提高MCF-7細胞的增殖能力。另外劃痕實驗結果（圖7A）和侵襲實驗結果（圖7B、C）表明Anxa2高表達以及其23位酪氨酸持續(xù)磷酸化的細胞其遷移及侵襲能力增強。

已有研究者證明，Anxa2第23位酪氨酸的磷酸化對于胰腺癌細胞的侵襲和遷移至關重要[4]，本實驗結果初步發(fā)現(xiàn)Anxa2第23位酪氨酸的磷酸化能增強人乳腺癌細胞系MCF-7的增殖及侵襲能力，提高Anxa2的表達水平或者保持Anxa2第23位酪氨酸的磷酸化狀態(tài)均可增強MCF-7細胞的增殖和侵襲能力。由此推測，Anxa2在乳腺癌細胞MCF-7的增殖、遷移及侵襲中所起的作用可能與其第23位酪氨酸的磷酸化激活有關，有關Anxa2高表達及其23位酪氨酸磷酸化對于Anxa2發(fā)揮作用的分子機制我們將進行進一步的研究。

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