B7-H4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及其在人胃癌組織中的初步應(yīng)用

王琦，蔣敬庭，魏文祥

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B7-H4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及其在人胃癌組織中的初步應(yīng)用

王琦，蔣敬庭，魏文祥

215123 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)教研室（王琦、魏文祥）；213003 常州，蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心（蔣敬庭）

建立實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)B7-H4 的方法并初步應(yīng)用于人胃癌組織。

將 B7-H4 和內(nèi)參 GAPDH 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定正確后克隆入載體 pMD19-T，構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，并純化、定量及梯度稀釋?zhuān)謩e建立 B7-H4 和 GAPDH 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè) 8 例人胃癌組織中的 B7-H4 相對(duì)于 GAPDH 的表達(dá)情況。

B7-H4 的最低檢測(cè)拷貝數(shù)為 5.27 拷貝，線性范圍 5.27 × 101~ 5.27 × 107拷貝，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 y = –3.1395 x + 41.805，直線回歸相關(guān)系數(shù)= 0.994 904，批間變異系數(shù)范圍 2.39% ~ 3.59%，擴(kuò)增效率 108.2%；GAPDH 的最低檢測(cè)拷貝數(shù)為 38.6 拷貝，線性范圍 3.86 × 102~ 3.86 × 107拷貝，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 y = –3.2436x + 41.083，直線回歸相關(guān)系數(shù)= 0.998 913，批間變異系數(shù)范圍 2.26% ~ 3.86%，擴(kuò)增效率 103.4%。8 例人胃癌組織的 B7-H4 相對(duì)于 GAPDH mRNA 表達(dá)水平在 0.044 ~ 0.888 之間。

熒光定量 PCR 檢測(cè) B7-H4 的方法具備較高的敏感性和特異性，且系統(tǒng)有良好的重復(fù)性和線性范圍。

胃腫瘤； 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR； B7-H4

B7 家族屬于提供第二信號(hào)的共刺激分子免疫球蛋白超家族，通過(guò)向 T 細(xì)胞傳遞協(xié)同刺激信號(hào)在 T 細(xì)胞充分活化和功能發(fā)揮中起著重要的作用。目前報(bào)道發(fā)現(xiàn)的 B7 家族分子共有 7 種，對(duì) B7 家族分子進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)比較，可將 B7 家族分子分為三組：I 組包括 B7-1（CD80）、B7-2（CD86）和 B7-H2[1-4]（B7 homolog 2，又稱(chēng) GL50、B7h、B7RP-1、ICOS-L）；II 組包括 B7-H1[5-6]（B7 homolog 1，又稱(chēng) Programmed death-1 ligand 1 即：PD-L1）和 B7-DC[7]（又稱(chēng) Programmed death-1 ligand 2 即：PD-L2）；III 組包括 B7-H3[8]（B7 homolog 3）和 B7-H4[9]（B7 homolog 4 又稱(chēng) B7S1 和 B7x）。B7-H4 是 B7 家族中最新發(fā)現(xiàn)的成員，其通過(guò)抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生、細(xì)胞周期的進(jìn)程、T 細(xì)胞的增殖分化，負(fù)性調(diào)控 T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答，在多種惡性腫瘤中有異常表達(dá)[10-11]。本課題組前期工作通過(guò)胃癌組織免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) B7-H4 在胃癌組織中有表達(dá)[12]，本研究建立實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè) B7-H4 的方法，并在此基礎(chǔ)上定量檢測(cè)胃癌患者癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中 B7-H4 的表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 2008 年 8 月至 2009 年 3 月在蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院胃腸外科接受手術(shù)治療的原發(fā)性胃癌患者 8 例，其中男性 6 例，女性2 例，年齡 51 ~ 74 歲，符合 1990 年《中國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤診治規(guī)范》原發(fā)性胃癌患者診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床病理資料完整。胃癌 TNM 分期：II 期 1 例，III 期 2 例，IV 期 5 例；其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 7 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 1 例；術(shù)前未接受任何放射和化學(xué)治療。手術(shù)后在胃癌組織原發(fā)灶取病理切片的同時(shí)，取癌組織置液氮罐備用。

1.1.2 試劑、引物及探針 Trizol、RT-PCR 和 PCR Master Mix（2 ×）試劑盒購(gòu)自加拿大 Fermentas 公司；瓊脂糖購(gòu)自西班牙 Biowest 公司；EB 購(gòu)自上海生工生物工程公司；DNA marker 購(gòu)自加拿大 Bio Basic 公司；快速膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；pMD19-T 載體連接試劑盒購(gòu)自日本 Takara 公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó) Qiagen公司；TaqMan PCR 試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；依據(jù) GenBank 收錄的 B7-H4 mRNA 全序列 Homo NM-024626.2 與 GAPDH mRNA 全序列 Homo NM-002046，利用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物和 TaqMan 探針，均由上海生工生物工程公司合成。β-actin：上游引物：5' AGC GAG CTA CCC CCA AAG TT 3'；下游引物：5' GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT 3'；擴(kuò)增片段 285 bp。B7-H4(A)：上游引物：5' GTT TTA GGC TTG GTC CAT GAG T 3'；下游引物：5' GCC AGC ATC TGT GAG TTG C 3'；擴(kuò)增片段 158 bp。GAPDH：上游引物：5' GGA AGG TGA AGG TCG GAG TC 3'；下游引物：5' CGT TCT CAG CCT TGA CGG T 3'；TaqMan 探針：FAM-TTT GGT CGT ATT GGG CGC CTG-TAMRA；擴(kuò)增片段 189 bp。B7-H4(B)：上游引物：5' CAC CAG GAT AAC ATC TCT CAG TGA A 3'；下游引物：5' TGG CTT GCA GGG TAG AAT GA 3'；TaqMan 探針：FAM-AAG CTG AAG ATA ATC CCA TCA GGC AT-TAMRA；擴(kuò)增片段120 bp。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 檢測(cè) B7-H4 在胃癌組織中的表達(dá) Trizol 法提取在液氮中保存的胃癌組織總 RNA，用 Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總 RNA 的濃度和純度（260/280在 2.00 左右為純 RNA）。取各組織樣總 RNA 2.0 μg 為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的操作說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄 cDNA，以 β-actin 和 B7-H4(A) 引物 PCR，所得 PCR 產(chǎn)物各取 5 μl 進(jìn)行 2% 瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀觀察和分析電泳結(jié)果。

1.2.2 cDNA 目的片段克隆 將 PCR 產(chǎn)物用快速膠回收試劑盒進(jìn)行割膠回收，利用 pMD19-T 載體連接試劑盒連接膠回收后的目的 DNA 片段和 pMD19-T 載體，12 ~ 16 ℃保溫 8 ~ 16 h。然后將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，涂板培養(yǎng)，37 ℃，12 ~16 h。觀察平板挑取 4 ~ 5 個(gè)單菌落，分別于 5 ml Amp+LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、225 r/min 振蕩過(guò)夜培養(yǎng) 12 ~ 16 h。

1.2.3 重組質(zhì)粒鑒定 以培養(yǎng)的 1 μl 菌液為模板，10 μmol/L M13 載體通用上下游引物作為 PCR 引物，進(jìn)行 PCR。陰性對(duì)照為相同的反應(yīng)體系中不加模板菌液。取 10 μl PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 2% 瓊脂糖電泳，觀察條帶位置是否與設(shè)計(jì)的插入片段一致。條帶位置正確的菌液，用質(zhì)粒抽提試劑盒分別抽提質(zhì)粒，取部分測(cè)序，blast 比對(duì)同源性。

1.2.4 重組質(zhì)粒濃度測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 經(jīng)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，用 Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒 DNA 的濃度和純度（260/280在 1.80 左右為純 DNA）。將標(biāo)準(zhǔn)品原液調(diào)整至 108拷貝/ml，貯于–80 ℃。標(biāo)準(zhǔn)品原液以 10 倍梯度稀釋成 107~ 101拷貝/ml7 個(gè)數(shù)量級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)品，分別以 B7-H4(B) 和 GAPDH 引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，各數(shù)量級(jí)的樣品均重復(fù) 5 次，根據(jù)模板起始拷貝數(shù)和對(duì)應(yīng)的臨界循環(huán)數(shù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得出標(biāo)準(zhǔn)方程。每條標(biāo)準(zhǔn)曲線分別重復(fù) 5 次。

1.2.5 胃癌組織中 B7-H4 相對(duì) RNA 水平的檢測(cè) 各胃癌組織樣本提取 RNA，逆轉(zhuǎn)錄，利用相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，得到對(duì)應(yīng)的 Ct 值，根據(jù)建立好的 B7-H4 和 GAPDH 的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得 B7-H4 和 GAPDH 的絕對(duì)含量，兩數(shù)值之比即為該胃癌組織中 B7-H4 相對(duì)于內(nèi)參 GAPDH 的 RNA 表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測(cè) B7-H4 在胃癌組織中的表達(dá)

結(jié)果顯示 3 例胃癌組織內(nèi)參照 β-actin 的表達(dá)基本一致，B7-H4 在 3 例胃癌組織中均有表達(dá)，但程度不同（圖 1）。

M：DNA 分子量標(biāo)記；1 ~ 3：B7-H4(A) 和 β-actin 產(chǎn)物大小分別為 158 和 285 bp

Figure 1 Amplified electrophoretogram of B7-H4(A) and β-actin

2.2 重組質(zhì)粒序列分析

在 ABI3730 全自動(dòng)測(cè)序儀上對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。用 Vector NTI advance 10 軟件將重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果和 B7-H4 和 GAPDH 的基因序列進(jìn)行比對(duì)，達(dá)到 100% 的符合率。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及線性檢測(cè)范圍

2.3.1 B7-H4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及線性檢測(cè)范圍 B7-H4 質(zhì)粒濃度為 15.554 ng/μl，根據(jù)公式[質(zhì)粒濃度（g/μl）/（660 × 質(zhì)粒長(zhǎng)度bp）]× 6.022 × 1026（拷貝/L），換算出質(zhì)粒 DNA 濃度為 5.27 × 1012拷貝/L，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)来螢?5.27 × 107~ 5.27 × 101拷貝/ml。

B7-H4 標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線（圖 2）顯示了一組間距相等的平行曲線，107個(gè)拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品從第 15 個(gè)循環(huán)開(kāi)始出現(xiàn)熒光信號(hào)，10 個(gè)拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品從第 33 個(gè)循環(huán)開(kāi)始出現(xiàn)熒光信號(hào)，表明實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)基因拷貝數(shù)有良好的線性范圍。軟件進(jìn)一步分析顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸相關(guān)系數(shù)= 0.994 904，所有標(biāo)準(zhǔn)品的值基本在一條直線上，沒(méi)有任何一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)大的偏差，表明標(biāo)準(zhǔn)品的制備成功。

B7-H4 標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = –3.1395x + 41.805，2= 0.9949。其中x 代表模板量的對(duì)數(shù)值（LogC0），y 代表 Ct 值。其線性范圍可達(dá) 7 個(gè)數(shù)量級(jí)，擴(kuò)增效率 E =（101/3.1395－1）× 100% = 108.2%。

2.3.2 GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及線性檢測(cè)范圍 GAPDH 質(zhì)粒濃度為 11.383 ng/μl，根據(jù)公式[質(zhì)粒濃度（g/μl）/（660 × 質(zhì)粒長(zhǎng)度bp）] × 6.022 × 1026（拷貝/L）換算出質(zhì)粒 DNA 濃度為 3.86 × 1012拷貝/L，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)来螢?3.86 × 107~ 3.86 × 101拷貝/ml。

GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線（圖 3）顯示了一組間距相等的平行曲線，107個(gè)拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品從第 14 個(gè)循環(huán)開(kāi)始出現(xiàn)熒光信號(hào)，102個(gè)拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品從第 29 個(gè)循環(huán)開(kāi)始出現(xiàn)熒光信號(hào)，表明實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)基因拷貝數(shù)有良好的線性范圍。軟件進(jìn)一步分析顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸相關(guān)系數(shù)= 0.998 913，所有標(biāo)準(zhǔn)品的值基本在一條直線上，沒(méi)有任何一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)大的偏差，表明標(biāo)準(zhǔn)品的制備成功。

圖 2 B7-H4 標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 2 B7-H4 amplification curve and standard curve

圖 3 GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

Figure 3 GAPDH amplification curve and standard curve

GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y = –3.2436 x + 41.083，2= 0.9989。其中x 代表模板量的對(duì)數(shù)值（LogC0），y 代表Ct 值。其線性范圍可達(dá) 6 個(gè)數(shù)量級(jí)，擴(kuò)增效率E =（101/3.2436－1）× 100% = 103.4%。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)性和靈敏度

將 B7-H4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 5.27 × 107拷貝/ml 數(shù)量級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)品原液依次進(jìn)行 10 倍梯度稀釋?zhuān)瑢?shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè) Ct 值，重復(fù) 5 次，變異系數(shù)范圍在 2.39% ~ 3.59%；將 GAPDH 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品3.86 × 107拷貝/ml 數(shù)量級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)品原液進(jìn)行 10 倍梯度稀釋?zhuān)瑢?shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè) Ct 值，重復(fù)5 次，變異系數(shù)范圍在 2.26% ~ 3.86%（表 1）。

表 1 B7-H4 標(biāo)準(zhǔn)品和 GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)品的批間重復(fù)性

表 2 各胃癌組織標(biāo)本病例資料

表 3 各胃癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織 B7-H4 相對(duì) RNA 水平

2.5 胃癌組織中 B7-H4 相對(duì) RNA 水平

8 例胃癌組織標(biāo)本病例資料（表 2）及根據(jù)建立好的 B7-H4 和 GAPDH 的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得胃癌組織及其相對(duì)應(yīng)的癌旁組織的 B7-H4 和 GAPDH 的 Quantity值（即定量結(jié)果），兩數(shù)值之比即為該胃癌組織中 B7-H4 相對(duì)于 GAPDH 的 RNA 表達(dá)水平，范圍在 0.044 ~ 0.888 之間（表 3）。

3 討論

熒光定量 PCR 技術(shù)中，應(yīng)用最廣泛的是 TaqMan 探針?lè)?，其核心是利?Taq 酶的 5'-3' 外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)[13]。探針?lè)ㄏ鄬?duì)于染料法來(lái)說(shuō)排除了引物二聚體產(chǎn)生的熒光信號(hào)而干擾目的基因?qū)嶋H所產(chǎn)生的總熒光信號(hào)強(qiáng)度。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 中標(biāo)準(zhǔn)曲線法是最為簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的定量方法[14-15]，將一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同的條件下測(cè)得的目的基因熒光信號(hào)量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比，從而得到目的基因的絕對(duì)表達(dá)量。標(biāo)準(zhǔn)曲線是以起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)（LogC0）為橫坐標(biāo)、Ct 值為縱坐標(biāo)；理論上來(lái)說(shuō)，依次 10 倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，斜率應(yīng)該在–3.3 左右。實(shí)際上當(dāng)相關(guān)系數(shù) > 0.95，斜率在–3.0 ~ –3.9 之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線都被認(rèn)為是可靠的[16]。本研究應(yīng)用重組質(zhì)粒 pMD19-T-B7-H4 連續(xù) 10 倍稀釋后得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Ct(B7-H4)= –3.1395 log(DNA 濃度) + 41.805，直線回歸相關(guān)系數(shù)= 0.994904；pMD19-T-GAPDH連續(xù)10 倍稀釋后得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Ct(GAPDH)= –3.2436 log(DNA 濃度) + 41.083，直線回歸相關(guān)系數(shù)= 0.998913，都在公認(rèn)的可接受范圍內(nèi)。本研究建立的TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè) B7-H4 的方法，能夠檢測(cè)低至 5.27 個(gè)拷貝的目的基因，并最終產(chǎn)生可高達(dá) 7 個(gè)數(shù)量級(jí)（5.27 × 101~ 5.27 × 107）的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍；GAPDH 的最低拷貝數(shù)為 38.6，線性范圍為 3.86 × 102~ 3.86 × 107拷貝，B7-H4 和 GAPDH 在各自的范圍內(nèi)，模板濃度與 Ct 之間的相關(guān)性均良好。另一個(gè)判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)劣的重要指標(biāo)是標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù)性，主要指標(biāo)之一是 CV（coefficient of variation，變異系數(shù)）。TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè) B7-H4 和 GAPDH 批間 CV 范圍分別在 2.39% ~ 3.59% 和 2.26% ~ 3.86%，均小于 5%，重復(fù)性較好。

本研究處理的胃癌組織標(biāo)本的例數(shù)相對(duì)較少，檢測(cè)了 8 例胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織 B7-H4 相對(duì) RNA 水平，最主要的目的在于人協(xié)同刺激分子 B7-H4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)方法的建立，并用建立好的體系檢測(cè)胃癌組織標(biāo)本以證明所建立的檢測(cè)體系是特異的，成功的。關(guān)于 B7-H4 mRNA 相對(duì)于 GAPDH mRNA 的表達(dá)水平與胃癌組織相關(guān)指標(biāo)（如：TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、浸潤(rùn)程度等）的關(guān)系則有待于檢測(cè)大批量的胃癌組織標(biāo)本并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后得出結(jié)論。

本研究結(jié)果表明 B7-H4 普遍表達(dá)于胃癌組織中，且表達(dá)強(qiáng)度相對(duì)于與管家基因 GAPDH 的范圍在0.044 ~ 0.888，相應(yīng)癌旁組織的表達(dá)量普遍低于或與癌組織接近，說(shuō)明 B7-H4 在胃癌組織中的表達(dá)量相對(duì)還是比較高的，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起到重要作用，和腫瘤的侵襲也有一定的關(guān)系。在乳腺癌中[17]，正常的乳腺細(xì)胞和惡性的乳腺癌細(xì)胞的 B7-H4 表達(dá)譜有著很大的差異，過(guò)表達(dá) B7-H4 的乳腺癌細(xì)胞可以幫助其逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)。B7-H4 的 mRNA 和蛋白在人漿液性卵巢癌和乳腺癌[18]中高表達(dá)，而在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，B7-H4 的蛋白在癌細(xì)胞表面廣泛糖基化，促進(jìn)上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，保護(hù)上皮細(xì)胞的“失巢凋亡”，在人卵巢癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá) B7-H4 還可以促進(jìn)在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。非小細(xì)胞肺癌[19]中高表達(dá)的 B7-H4 在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中普遍存在。同時(shí)表達(dá) B7-H4 和 B7-H1 的腎細(xì)胞癌患者有著更高的死亡風(fēng)險(xiǎn)，因此可能是腎細(xì)胞癌的預(yù)后的一個(gè)重要的標(biāo)志物，可以作為腫瘤細(xì)胞和腫瘤新生血管的靶標(biāo)協(xié)助腫瘤的免疫治療[20]。隨著對(duì) B7-H4 研究的深入，B7-H4 過(guò)表達(dá)被認(rèn)為是胃癌預(yù)后差的一個(gè)關(guān)鍵因素[21]，B7-H4 的激活有可能作為腫瘤的預(yù)后因素或者作為腫瘤治療的靶分子。

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Quantification of B7-H4 with real-time fluorescent PCR and its preliminary application in gastric carcinoma

WANG Qi, JIANG Jing-ting, WEI Wen-xiang

Department of Cell Biology, School of Biology and Basic Medicine Science, Medical College, Soochow University, Suzhou 215123, China (WANG Qi, WEI Wen-xiang); Department of Tumor Biological Treatment, The Third Affiliated Hospitial of Soochow University, Changzhou 213003, China (JIANG Jing-ting)

Toestablish a real-time fluorescent polymerase chain reaction for quantifying B7-H4 and detect the expression of B7-H4 in human gastric carcinoma.

The B7-H4 and internal reference gene GAPDH fragments in correct sequence from RT-PCR were cloned into pMD19-T vector, and recombinant plasmids were purified and quantified by spectrophotometry. Standard curves was established by using a serial dilution of quantified plasmids in order to measure B7-H4 and GAPDH. Real-time fluorescent PCR was used to quantify the expression level of B7-H4 relative to GAPDH in 8 gastric carcinoma tissues.

For B7-H4, the detection of the minimum copy number was 5.27 copies. The linear range of 5.27 × 101~5.27 × 107copies of the standard curve equation (y = -3.1395 x + 41.805) was found and the correlation coefficient for 0.994 904 was obtained. The inter-assay CV ranged from 2.39% to 3.59% and the amplification efficiency was 108.2%. For GAPDH, the detection of the minimum copy number was 38.6 copies. The linear range of 3.86 × 102to 3.86 × 107copies of the standard curve equation (y = –3.2436 x + 41.083) was found and the correlation coefficient of 0.998 913 was obtained. The inter-assay CV ranged from 2.26% to 3.86% and the amplification efficiency was 103.4%. mRNA levels of B7-H4 relative to GAPDH in 8 gastric carcinoma tissues were between 0.044 and 0.888.

The real-time fluorescent quantitative PCR system established for quantifying B7-H4 is rapid, specific, sensitive and accurate. The standard system is repeatable and has a good linear range.

Stomach neoplasms; Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction; B7-H4

WEI Wen-xiang, Email: wenxiangw@suda.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.001

國(guó)家自然科學(xué)基金（81171653、30972703）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2011246、BK2011247）；“六大人才高峰”第六批資金資助項(xiàng)目（BRA2010037）；常州市科技支撐計(jì)劃（社會(huì)發(fā)展）計(jì)劃基金（CJ20112020、CZ20110024、CS20102020）

魏文祥，Email：wenxiangw@suda.edu.cn

2012-12-17