ZD6474衍生物篩選和抗腫瘤活性研究

周祥，于冰，侯文彬，徐春秀，石玉，李祎亮

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ZD6474衍生物篩選和抗腫瘤活性研究

周祥，于冰，侯文彬，徐春秀，石玉，李祎亮

530001 南寧，廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院（周祥）；300193 天津藥物研究院天津市新藥安全評價中心（于冰），中藥現(xiàn)代研究部（侯文彬），天津市新藥設(shè)計與藥物發(fā)現(xiàn)重點實驗室（石玉、李祎亮）；300193 天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院（徐春秀）

對自主研發(fā)的 ZD6474 衍生物進(jìn)行抗腫瘤活性研究，從而為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾、改造與藥理學(xué)研究奠定良好的基礎(chǔ)。

采用均相時間分辨熒光法以 VEGFR-2、EGFR 為檢測靶點評價化合物的抑制活性；采用 SRB 法檢測化合物對細(xì)胞的增殖抑制活性；移植人非小細(xì)胞肺癌 H1299 裸鼠模型作為體內(nèi)抗腫瘤活性評價。

從大量化合物中篩選出 4 個有較好酪氨酸激酶抑制活性的化合物，分別編號為106、113、115、116。體外細(xì)胞實驗結(jié)果顯示化合物對腫瘤細(xì)胞生長增殖均有抑制作用，其中 106 對A431、H1975 和 A549 細(xì)胞系均表現(xiàn)出良好的抑制活性。體內(nèi)試驗結(jié)果表明，106 能夠劑量依賴性抑制裸鼠腫瘤生長，且作用與 ZD6474 相當(dāng)，25、75 mg/kg 的106 和 ZD6474 對 H1299 的相對腫瘤增殖率為 57.3%、38.8% 和 52.5%、29.6%。

化合物106 具有良好的體內(nèi)外抗腫瘤作用，有進(jìn)一步的研究價值。

蛋白酪氨酸激酶類； 藥物篩選試驗，抗腫瘤； 癌，非小細(xì)胞肺； 凡德他尼

蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTKs）是一類具有酪氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)，它們在細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中占據(jù)了十分重要的地位，調(diào)節(jié)著細(xì)胞體內(nèi)生長、分化、死亡等一系列生理生化過程。研究表明，超過 50% 的原癌基因和癌基因產(chǎn)物與蛋白酪氨酸激酶活性相關(guān)，其異常表達(dá)會引起細(xì)胞內(nèi)多種信號通路，如與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的促分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路以及抵抗細(xì)胞凋亡的核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路等出現(xiàn)傳導(dǎo)異常，造成細(xì)胞增殖紊亂，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[1-2]。因此通過阻斷酪氨酸激酶可破壞腫瘤細(xì)胞的信號傳遞，可以達(dá)到抗腫瘤的目的[3]。

ZD6474（凡德他尼）屬于新一代喹唑啉類化合物，對 VEGFR-2、EGFR 等酪氨酸激酶具有顯著抑制作用[4]。在腫瘤的臨床治療中，ZD6474 對非小細(xì)胞肺癌、甲狀腺癌等具有顯著的臨床治療效果，但I(xiàn)II期臨床試驗中，表現(xiàn)出了較多的毒副作用[5]。本課題組在 ZD6474 的研究基礎(chǔ)上合成一系列的新化合物，對這些化合物進(jìn)行體外活性篩選和抗腫瘤活性研究，以期找到高效、低毒、具有開發(fā)前景的自主抗腫瘤新藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 生物素標(biāo)記的蛋白酪氨酸激酶多肽底物（poly-Glu-Ala-Tyr）、鏈激酶素標(biāo)記的 XL-665（一種經(jīng)改良的別藻藍(lán)蛋白）、結(jié)合生物素標(biāo)記的抗磷酸化酪氨酸抗體的銪聯(lián)穴狀化合物（EuK）購自法國 Cisbio Bioassay 公司；ATP 和 HEPES 購自美國 Amresco 公司；EGFR 和 VEGFR-2 激酶購自美國 BPS Bioscience 公司；A431、H1975 和 A549 細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，本實驗室凍存使用；DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國 Gibco 公司。

1.1.2 動物及瘤株 SPF 級裸鼠 25 只，體重18 ~ 22 g，合格證號：SCXK（滬）2007-0005，由無錫江原安迪科公司提供；H1299 細(xì)胞瘤亦由該公司提供。

1.1.3 受試化合物 ZD6474、106、113、115、116 等均由本實驗室合成，以 DMSO 配置成10 mmol/L 的溶液備用。

1.2 方法

1.2.1 EGFR 和 VEGFR-2 激酶抑制活性篩選 根據(jù)均相時間分辨熒光法（HTRF）以 VEGFR-2、EGFR 為檢測靶點對化合物進(jìn)行篩選。配制 10 μmol/L ATP、200 nmol/L TK Substrate-biotin 的工作液，按體積比例 ATP:TK Substrate-biotin: Kinase buffer = 2:2:2 取液混勻；藥物用 Kinase buffer 稀釋為所需濃度；配制 0.25 ng/μl EGFR 和 2 ng/μl VEGFR-2的酶工作液。以白色 384 孔板為實驗容器，每孔加入 6 μl 混勻液、2 μl 藥物、2 μl 激酶、混勻，置 37 ℃溫育反應(yīng)30 min。然后，依次加入 5 μl 鏈激酶素標(biāo)記的 XL-665 及 5 μl 結(jié)合了 Eu3+的穴狀化合物抗體，混勻。室溫放置 30 min 后于酶標(biāo)儀 314 nm 激發(fā)，檢測 665 nm 和 620 nm 熒光。反應(yīng)設(shè) 3 復(fù)孔，設(shè)陰性對照及空白對照。按以下公式計算激酶抑制率：抑制率（%）=[（Ratio665/620對照孔－Ratio665/620給藥孔）/ Ratio665/620對照孔]× 100%

以抑制率為縱坐標(biāo)，log[M] 為橫坐標(biāo)（M 為濃度），采用 Graphpad prism 5.0 軟件擬合曲線，計算 IC50值。

1.2.2 SRB 法檢測腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性 取對數(shù)生長期的待檢測細(xì)胞接種于 96 孔培養(yǎng)板（細(xì)胞濃度為 8000 個/孔），37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng) 24 h。待細(xì)胞經(jīng) 24 h 貼壁后，每孔加入20 μl 配置好的不同濃度的藥液。經(jīng)過 48 h 培養(yǎng)后，各孔中加入 4 ℃、50 % 的 TCA 50 μl，于 4 ℃孵育 1 h。取出培養(yǎng)板，輕輕傾去板內(nèi)液體，用蒸餾水輕輕沖洗 5 遍，置于空氣中風(fēng)干至不見水痕。然后每孔加入配制好的 0.4% SRB 50 μl，于室溫下靜置染色 20 min 后，傾去 SRB 溶液，用 1% 乙酸沖洗 5 遍，以除去未與蛋白質(zhì)結(jié)合的染料。置于空氣中風(fēng)干至無水痕后，每孔加入 Tris 緩沖液（10 mmol/L）150 μl，將染料溶解后，于振蕩器上振蕩 5 min，560 nm 波長讀取各孔值。反應(yīng)設(shè) 3 復(fù)孔，設(shè)無藥對照組和空白組。按以下公式計算激酶抑制率：

以抑制率為縱坐標(biāo)，log[M] 為橫坐標(biāo)（M 為濃度），采用 Graphpad prism 5.0 軟件擬合曲線，計算 IC50值。

1.2.3 化合物106 的體內(nèi)抗腫瘤作用 取 H1299 肺癌裸鼠（瘤株），無菌條件下取局部生長良好的腫瘤組織。然后將腫瘤組織與生理鹽水按 1:20 的比例混合勻漿，制備成約 1 × 107PBS 細(xì)胞懸液（顯微鏡下觀察），皮下種植于 6 周大的裸鼠腹側(cè)，每只約注射 0.2 ml。待體積增長到 100 ~150 mm3時進(jìn)行試驗。按公式：腫瘤體積= 長徑 × 短徑/2 × 0.5 計算腫瘤的體積。動物按腫瘤大小隨機分組，即陰性對照組和 106 及 ZD6474 的高低劑量組。給藥劑量為 25 和 75 mg/kg，口服灌胃，每天給藥 1 次，連續(xù) 2 周。從第 1 天開始，每3 天測一次腫瘤體積，稱鼠重。相對腫瘤體積RTV = Vt/V0，Vt為每次測量時的腫瘤體積，V0為開始給藥時的腫瘤體積。根據(jù) RTV 計算腫瘤增殖速率：

腫瘤增殖速率（%）= 給藥組的 RTV 均值/對照組的RTV 均值 × 100%

1.3 評價標(biāo)準(zhǔn)[6]及統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EGFR 和 VEGFR-2 激酶抑制活性篩選

實驗中多肽底物對化合物表現(xiàn)為濃度依賴性抑制作用，多肽底物的磷酸化水平隨著化合物濃度增高而降低。對本實驗室的大量自主研發(fā)的 ZD6474 衍生物進(jìn)行篩選，得出 4 個活性化合物。它們對 VEGFR-2 激酶抑制活性與 ZD6474 相當(dāng)，但對 EGFR 激酶的抑制活性要高于 ZD6474，其 IC50值見表 1。

表 1 化合物對受試激酶抑制作用

2.2 腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性

結(jié)果表明，這些化合物均能不同程度地抑制 A431、H1975 和 A549 細(xì)胞（表 2）。其中 106 對 3 種腫瘤細(xì)胞的 IC50最低，分別為 0.77、3.06 和 5.66 μmol/L，且對 A431 和 H1975 細(xì)胞的增殖抑制作用優(yōu)于陽性藥物 ZD6474 和厄洛替尼。

表 2 化合物對腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

2.3 化合物 106 的體內(nèi)抗腫瘤作用

根據(jù)體外藥效篩選結(jié)果，選取化合物 106 進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤作用，并與對照 ZD6474 進(jìn)行比較。結(jié)果顯示：兩種劑量的 106 和 ZD6474 均能抑制肺癌 H1299 的生長，且呈劑量依賴性，腫瘤增殖速率分別為57.3%、38.8%；52.5%、29.6%（表 3）。根據(jù)療效評價標(biāo)準(zhǔn) 25 mg/kg 的 106 和 ZD6474 對裸鼠 H1299 肺癌有療效，療效相當(dāng)；75 mg/kg的106 和 ZD6474 對裸鼠 H1299 肺癌有療效，106 療效略低于 ZD6474。給藥后 ZD6474 組均出現(xiàn)死亡，高劑量體重下降明顯，與對照組比較有顯著性差異（< 0.01），對裸鼠的副作用明顯高于 106（圖 1 ~ 2）。

3 討論

本實驗采用均相時間分辨熒光法和 SRB 法對化合物進(jìn)行體外酶活性篩選和細(xì)胞抑制活性研究。激酶抑制篩選實驗選出 4 個化合物 106、113、115、116 對 EGFR 和 VEGFR-2 靶點都具有較好的活性，其中 EGFR 抑制活性要優(yōu)于陽性對照 ZD6474。因此選用 EGFR 高表達(dá)人表皮鱗狀細(xì)胞癌 A431 細(xì)胞株及非 EGFR 高表達(dá)細(xì)胞人肺腺癌 A549 細(xì)胞株進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性實驗。結(jié)果顯示 106、113、115 對 A431 細(xì)胞和 A549細(xì)胞均有增殖抑制作用，且對高表達(dá)細(xì)胞 A431 的抑制活性要高于 A549，可以初步認(rèn)為這些化合物對 EGFR 靶點有很好的抑制作用。目前批準(zhǔn)用于肺癌的靶向藥物厄洛替尼在 EGFR 激活突變的患者中已經(jīng)取得很好療效，然而 T790M 繼發(fā)耐藥性突變被認(rèn)為是導(dǎo)致獲得性耐藥的主要原因，這部分患者不能夠從 EGFR TKIs（EGFR 酪氨酸激酶抑制劑）中獲益[7]。本實驗應(yīng)用 EGFR TKIs 耐藥的 EGFR（T790M）突變的人非小細(xì)胞肺腺癌 H1975 細(xì)胞株檢測化合物抑制活性，結(jié)果顯示，與厄洛替尼對照，106、115、116 和 ZD6474 對 H1975 細(xì)胞有增殖抑制作用，且 106 的作用要強于 ZD6474，提示 106 可能成為治療繼發(fā)耐藥的非小細(xì)胞肺癌的藥物。

表 3 106 和ZD6474 對人肺癌H1299 裸小鼠移植瘤的療效

注：d0：分籠給藥時間；d21：給藥后21 d。*：與對照組比較，< 0.05；**：與對照組比較，< 0.01。

Notes: d0: Time of administration; d21: After the treatment the 21st day.*: Compared with control group,< 0.05;**: Compared with control group,< 0.01.

圖 1 給藥期間人肺癌 H1299 裸小鼠移植瘤的相對腫瘤體積變化情況（）

圖 2 給藥期間 H1299 裸小鼠體重變化情況（）

肺癌為目前世界范圍的高發(fā)腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌所占比例高達(dá)約 80%[8]。本試驗所用 NCI-H1299 細(xì)胞是肺鱗癌細(xì)胞，為典型的非小細(xì)胞肺癌。該細(xì)胞株與 A549 細(xì)胞株相比對 EGFR TKIs（如吉非替尼）更為耐藥[9]。我們以此天然人肺癌耐藥細(xì)胞株為研究對象，觀察化合物 106 對該腫瘤的體內(nèi)療效。根據(jù)療效評價標(biāo)準(zhǔn)，25 和75 mg/kg 劑量 106 的腫瘤增殖速率均小于 60%，與對照組相比有顯著性差異，說明 106 對 H1299 人肺癌有療效，呈劑量依賴性。實驗中相同劑量時，106 對腫瘤的增殖速率略高于 ZD6474，表明 106 對該腫瘤療效略低于 ZD6474；但是 ZD6474 給藥組出現(xiàn)裸鼠死亡現(xiàn)象，高劑量裸鼠體重持續(xù)下降，副作用明顯，因此 106 仍具有開發(fā)前景。106 對非小細(xì)胞肺癌表現(xiàn)出了良好療效，具體的作用機制我們還需要進(jìn)一步研究。

本實驗結(jié)果表明化合物 106 具有良好潛力成為小分子酪氨酸激酶靶向抗腫瘤藥物，可以以此為研究方向進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾、改造與藥理學(xué)研究。

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Screening and anti-tumor activity study of ZD6474 derivatives

ZHOU Xiang, YU Bing, HOU Wen-bin, XU Chun-xiu, SHI Yu, LI Yi-liang

Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001, China (ZHOU Xiang); Tianjin Centre for Drug Safety Evaluatian and Research (YU Bing), Modern Research Department of Traditional Chinese Medicine (HOU Wen-bin), Tianjin Key Laboratory of Molecular Drug & Drug Discovery (SHI Yu, LI Yi-liang), Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China; Graduate School of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China (XU Chun-xiu)

To study the anti-tumor activity of new ZD6474 derivatives for further structural modification, renovation and pharmacological studies.

Homogeneous time-resolved fluorescence method (HTRF) was used to evaluate the compounds’ inhibitory activity against VEGFR-2 and EGFR. Cell proliferation inhibition activity of the compounds was tested by SRB assay. Nude mice xenograft model of human NSCLC H1299 cells was used to test the compounds’ anti-tumor activity in vivo.

Four compounds, numbered as 106, 113, 115, 116, showed preferably tyrosine kinase inhibitory activity from the screening. The compounds can inhibit tumor cell growth, among which No.106 compound showed most potent inhibitory activity in A431, H1975 and A549 cell lines. Moreover, No.106 compound dose-dependently inhibited tumor growth in vivo, showing comparable effects with that of ZD6474. When administered at dose of 25 and 75 mg/kg, the H1299 tumor inhibition rate was 57.3% and 38.8% for No.106 compound, and was 52.5% and 29.6% for ZD6474, respectively.

The No.106 compound has potent anti-tumor activity both in vitro and in vivo, and is worthy of further research.

Protein-tyrosine kinases; Drug screening assays, antitumor; Carcinoma, non-small-cell lung; Vandetanib

李祎亮，Email：langyil@sina.com

2013-01-04

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.006

LI Yi-liang, Email: langyil@sina.com