OK-432腫瘤疫苗對DBA/2小鼠脾臟細(xì)胞中Th1細(xì)胞因子以及TNF-α分泌的影響

鄭曉東 趙 棟 武 峰 溫 璟 羅曉晉* 李憲起（山西醫(yī)科大學(xué)口腔系，山西 太原 030001）

OK-432腫瘤疫苗對DBA/2小鼠脾臟細(xì)胞中Th1細(xì)胞因子以及TNF-α分泌的影響

鄭曉東 趙 棟 武 峰 溫 璟 羅曉晉* 李憲起（山西醫(yī)科大學(xué)口腔系，山西 太原 030001）

目的利用DBA/2小鼠移植舌癌荷瘤模型，探討OK-432腫瘤疫苗對DBA/2小鼠脾臟細(xì)胞中Th1細(xì)胞因子以及TNF-α分泌的影響。方法ELISA定量檢測脾臟淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN-γ，IL-2，TNF-α等細(xì)胞因子的分泌水平。結(jié)果OK-432腫瘤疫苗組中IFN-γ、IL-2以及TNF-α的含量明顯高于實驗對照組（P＜0.05）。結(jié)論OK-432腫瘤疫苗可刺激荷瘤小鼠脾臟細(xì)胞Th1細(xì)胞及TNF-α的分泌，增強DBA/2小鼠的抗腫瘤免疫功能。

OK-432腫瘤疫苗；ELISA；IFN-γ；IL-2；TNF-α；DBA/2小鼠

腫瘤疫苗，在現(xiàn)代腫瘤的治療中以其作為腫瘤術(shù)后、化療、放療的一種重要的輔助治療手段（Biotherapy）已經(jīng)越來越受到了人們的關(guān)注。如多肽疫苗[1]、基因疫苗[2]、重組病毒疫苗[3]、腫瘤細(xì)胞疫苗[4-6]、樹突細(xì)胞疫苗[7]等，通過了腫瘤抗原以及相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)分子蛋白的表達，改善腫瘤組織局部免疫微環(huán)境，增強T細(xì)胞的抗腫瘤免疫效應(yīng)。OK-432（picibanil）作為一種細(xì)菌類且具有非特異性免疫功能的免疫賦活劑，是經(jīng)由青霉素處理后的溶血性鏈球菌A組Ⅲ型低毒性變異株Su研制而來的。研究證明了OK-432作為一種免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，它不僅可以誘導(dǎo)活化CD3+，CD4

+，LeU8-，CD45RO+的細(xì)胞表面HLA-DR，CD25，ICAM-1的表達[7]，同時還能促進T細(xì)胞分泌IFN-γ，TNF-α，IL-6[8]等細(xì)胞因子，尤其是經(jīng)Triton X-114提純后的OK-432，無論是即可效應(yīng)還是遠(yuǎn)期效果都能有效的促進局部抗癌免疫反應(yīng)的進行，同時還可以更加顯著的提高細(xì)胞毒性T細(xì)胞毒腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)[9]。研究表明，OK-432腫瘤疫苗[10]可以顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，并延長其生存期，但其激發(fā)和增強宿主的特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)機制尚不十分清楚。本研究著重探討OK-432腫瘤疫苗對小鼠脾臟Th1細(xì)胞因子以及TNF-α分泌的影響，旨在對OK-432腫瘤疫苗的免疫賦活作用，特別是其對機體Th1細(xì)胞的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

6周齡的DBA/2雌鼠購自北京維通利華公司，實驗開始前在觀察室喂養(yǎng)一周以觀察其狀態(tài)，飼養(yǎng)室由山西醫(yī)科大學(xué)動物培養(yǎng)中心提供；KLN-205鱗癌細(xì)胞由上海腫瘤細(xì)胞庫提供；OK-432注射用粉劑由中外制藥株式會社（日本）提供，其計量為5KE（Klinische Einheit），1KE等量0.1mg的凍干鏈球菌，使用時需要PBS溶解。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；青鏈霉素購自Solarbio公司；胰蛋白酶（含EDTA），無菌PBS，D-Hanks緩沖液，紅細(xì)胞裂解液以及ELISA試劑盒均為BOTER公司出品；無支原體胎牛血清為浙江天杭生物科技有限公司出品。

1.2 模型建立及動物處理方法

①腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)：KLN-205腫瘤細(xì)胞在37℃，5%CO2恒溫箱傳代培養(yǎng)，每次使用的培養(yǎng)液按照45mL的RPMI-1640培養(yǎng)液加入5mL胎牛血清，0.5mL的雙抗的比例配制。選取培養(yǎng)4代以上活力旺盛的腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞。②脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：將48只DBA/2小鼠隨機分為OK-432組，PBS對照組，OK-432腫瘤疫苗組，每組16只。分別于小鼠右側(cè)腹腔注射以下試劑，OK-432組注射0.7KE/100μl；PBS對照組注射PBS液100μL；OK-432腫瘤疫苗組注射OK-432疫苗5× 105/100μL，每周一次，連續(xù)注射3周。分別在3次注射試劑結(jié)束后于第1天，第3天，第5天，第7天取出脾臟。將取出的脾臟置于Hanks液中，按所分組分別剔除筋膜組織以及周圍脂肪組織，用眼科手術(shù)剪剪碎，用玻璃研磨器進行研磨，用Hanks液沖洗后用200目濾網(wǎng)過濾。將濾液收集至15mL離心管中，2000r/min離心3min棄上清。加入紅細(xì)胞裂解液，混勻脾細(xì)胞，靜置3～4min，待紅細(xì)胞完全破碎后，2000r/m離心3min，棄上清去除紅細(xì)胞，Hanks液沖洗，1500r/m離心3min，棄上清，用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)板計數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5 ×106/mL，臺盼蘭染色檢測脾細(xì)胞存活率＞95%；接種至培養(yǎng)板中，標(biāo)記好分組，CO2恒溫培養(yǎng)箱中培育72h。用計數(shù)板計數(shù)培育72h的脾臟細(xì)胞，調(diào)整其濃度為2×106/2mL。加入培養(yǎng)四代以上的KLN-205腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞。效靶比例為50∶1、100∶1。在CO2恒溫箱中共同培育24h。將培育好的細(xì)胞混合液收集至離心管中，1500r/m，3min離心，取上清液。

1.3 細(xì)胞因子測定

采用夾心ELISA法測定IFN-γ，IL-2，TNF-α在培養(yǎng)液中的含量。每次測定值為三個復(fù)孔的平均值。運用ELISACalc軟件進行Hill曲線擬合，生成曲線方程，根據(jù)所得OD值得出培養(yǎng)液中各因子的含量。

1.4 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS16.0軟件采用重復(fù)測量方差分析對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié) 果

在腫瘤細(xì)胞的刺激下，體外培養(yǎng)72h后的脾淋巴細(xì)胞OK-432組及OK-432疫苗組均可以誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ，IL-2，TNF-α。如圖1所示，在疫苗組中IFN-γ與TNF-α的含量要高于IL-2在培養(yǎng)液中的濃度，其中TNF-α的濃度最高。圖2顯示，IFN-γ在三組中總體呈上升趨勢，且在不同的實驗組中含量明顯不同。在不同時期脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞因子IL-2以及INF-γ的濃度也是有所變化的，第一天的細(xì)胞因子含量要略低于其后幾天的細(xì)胞因子含量，在第7天時達到最大值。另外TNF-α的變化較為有特點，在第1天后顯著提升，在第3～5天階段較為平穩(wěn)，在第7天時出現(xiàn)回落。同時，如圖3所示，當(dāng)我們將靶細(xì)胞濃度提升1倍時，效應(yīng)細(xì)胞的免疫作用也相應(yīng)的提高，經(jīng)檢測后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子的濃度也相應(yīng)提升1倍左右。

3 討 論

OK-432作為一種細(xì)菌類非特異性免疫賦活劑，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于腫瘤的研究與治療，除了誘導(dǎo)活化CD3+，CD4

+等免疫細(xì)胞表面HLA-DR，LFA-1和ICAM-1的表達，促進CD4+，T細(xì)胞分泌IFN-γ，TNF-α，IL-6等細(xì)胞因子以外，經(jīng)OK-432誘導(dǎo)培養(yǎng)后的樹突狀細(xì)胞[11]（OK-DC）還可以表現(xiàn)出特異性的抗腫瘤細(xì)胞毒性[12]。本試驗表明，OK-432組以及OK-432腫瘤疫苗組中小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞在經(jīng)KLN-205腫瘤細(xì)胞刺激后，可以產(chǎn)生IL-2、TNF-α、INF-γ。在相同的培養(yǎng)條件下，以及一定的生長環(huán)境中，在不同濃度的靶細(xì)胞刺激下，各個細(xì)胞因子呈現(xiàn)出一定的增高趨勢。其中，IL-2在所提取的培養(yǎng)液中的濃度比較低，出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能是由于OK-432刺激了機體中IL-2受體的表達，所以導(dǎo)致了在培養(yǎng)液中IL-2的消耗增加[13]。INF-γ以及TNF-α在培養(yǎng)液中濃度較大，Th1細(xì)胞受到靶細(xì)胞刺激后，使得其INF-γ分泌增加，同時巨噬細(xì)胞也大量的分泌TNF-α，使得其濃度隨著靶細(xì)胞的增量而成正相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)，在注射后第一天收集的淋巴細(xì)胞經(jīng)72h培養(yǎng)后對靶細(xì)胞的刺激敏感性不是最強，而在第三天到第五天收集的脾臟淋巴細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)呈上升趨勢，同時TNF-α在第7天時出現(xiàn)下滑趨勢，出現(xiàn)這種結(jié)果可能是在早期條件培養(yǎng)液中的脾臟淋巴細(xì)胞受到刺激后，增強了其細(xì)胞免疫功能，因子濃度有升高的趨勢，隨著時間的推移，淋巴細(xì)胞負(fù)荷的增加，脾淋巴細(xì)胞中的抑制性因素增大，使得條件培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子消耗階段性增大所導(dǎo)致的TNF-α濃度表現(xiàn)為階段性下滑的趨勢。

綜上所述，在DBA/2小鼠移植舌癌荷瘤模型中，OK-432腫瘤疫苗可誘導(dǎo)宿主Th1細(xì)胞主導(dǎo)的細(xì)胞免疫活化，誘發(fā)有效的CTL應(yīng)答，激發(fā)和增強宿主對腫瘤的特異性免疫功能。

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圖1 疫苗組中不同細(xì)胞因子的變化趨勢

圖2 IFN-γ在不同實驗組中的變化趨勢

圖3 疫苗組中TNF-α在不同濃度靶細(xì)胞刺激下的變化趨勢

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The Effect of OK-432 Tumor Vaccine for DBA/2 Mice Spleen Cells of Th1 Cytokines and TNF-α Secretion

ZHENG Xiao-dong, ZHAO Dong, WU Feng, WEN Jing, LUO Xiao-jin*, LI Xian-qi

(Department of Stomatology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

ObjectiveTo research the Th1 cytokines and TNF-α secretion of the DBA/2 mice spleen cells with Ok-432 tumor vaccine in DBA/2 mice transplanted the tongue cancer tumor models.MethodsELISA detection the IFN-gamma, IL-2 and TNF-α secretion levels of spleen lymphocytes.ResultThe IFN-γ, IL-2 and TNF-α content of OK-432 tumor vaccine group is significantly higher than the experimental control group (P＜0.05).ConclusionOK-432 tumor vaccine can stimulate the Th1 cytokines and TNF-α secretion of tumor-bearing mouse spleen cells, enhance the anti-tumor immune function of the DBA/2 mice.

OK-432 tumor vaccine; ELISA; IFN-γ; IL-2; TNF-α; DBA/2 mice

R392.9

B

1671-8194（2013）18-0011-03

*通訊作者：E-mail：xiaojinluo1958@163.com