缺血預(yù)處理對兔脊髓缺血再灌注損傷水通道蛋白－4表達(dá)的影響

方 波 趙 曦 王 赫 孫學(xué)軍 馬 虹

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，沈陽 110001）

胸腹主動脈手術(shù)通常需要阻斷主動脈，造成脊髓缺血再灌注損傷，引起截癱［1］。盡管人們已做了大量研究來防治脊髓缺血，但至今仍未取得令人滿意的效果。如何提高脊髓自身的抗損傷能力引起了國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者的關(guān)注。缺血預(yù)處理（Ischemic precondi－tioning，IPC）是通過短暫缺血使該組織耐受隨后長時間缺血的現(xiàn)象。研究表明IPC能夠有效的保護缺血脊髓［2，3］。迄今為止，IPC治療脊髓缺血再灌注損傷的機制研究集中在熱休克蛋白合成［1］，腺苷［4］和?；撬後尫牛?］，增加局部血流［6］，激活神經(jīng)營養(yǎng)因子［7］及抗凋亡［3］等方面。組織水腫是脊髓缺血再灌注損傷的主要繼發(fā)性病理改變。水通道蛋白－4（apuaporin－4，AQP－4）主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)［8］，在腦和脊髓的許多生理及病理過程中發(fā)揮重要作用［9］。本研究擬探討IPC對兔脊髓缺血再灌注損傷后AQP－4表達(dá)的影響，闡明其脊髓保護的機制。

材料和方法

1.動物選擇及分組

成年日本大耳白兔72只，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體重1.8－2.6kg。采用隨機數(shù)字表法，隨機分為3組（n＝24）：假手術(shù)組（S組）、脊髓缺血再灌注組（I/R組）和缺血預(yù)處理組（IPC組），每組設(shè)兩個觀察時點，分別是損傷后4h和24h。S組打開腹腔暴露游離腎下腹主動脈，但不阻斷；I/R組阻斷腹主動脈30min造成脊髓缺血再灌注損傷；IPC組短暫阻斷腹主動脈5min，灌注10min，再阻斷5min，灌注25min實施預(yù)處理，之后阻斷腹主動脈30min造成缺血再灌注損傷。

2.脊髓缺血再灌注模型的建立

兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦（1g/kg）麻醉，保留自主呼吸。耳緣中動脈置管測量近端動脈血壓，股動脈置管測量遠(yuǎn)端血壓。直腸內(nèi)置入溫度傳感器，持續(xù)監(jiān)測體溫，應(yīng)用電熱毯維持核心溫度38℃左右。腹部皮膚剪毛后消毒，取腹正中切口，沿腹白線0.25%布比卡因局部浸潤，剪開腹壁肌肉，暴露左腎及腹主動脈，用組織鉗鈍性分離左腎下腹主動脈。全身肝素化（200U/kg）后，腎動脈下1cm處用無損傷動脈夾阻斷腹主動脈30min，以遠(yuǎn)端平均動脈壓（MAP）低于20mmHg為完全阻斷的標(biāo)準(zhǔn)。之后撤動脈夾開放腹主動脈，造成脊髓缺血再灌注損傷。之后絲線縫合，回籠飼養(yǎng)。

3.神經(jīng)運動功能評價

以改良的Tarlov評分標(biāo)準(zhǔn)對下肢運動功能進行評價。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，沒有可覺察的下肢活動；1分，有可覺察的關(guān)節(jié)自主活動；2分，后肢可自由活動但無法站立；3分，可站立但無法行走；4分，后肢功能完全恢復(fù)，能正常行走。

4.脊髓水腫測定

采用干濕法測定脊髓含水量，評價脊髓水腫。分別取新鮮脊髓缺血節(jié)段（L4－6）標(biāo)本用濾紙吸除表面水分后，置于電子天平稱取濕重 （W），再經(jīng)110℃恒溫烤箱烘烤24h后稱取干重（D）。應(yīng)用公式：脊髓含水量 （%）＝ （W－D）/W×100，計算脊髓含水量。

5.脊髓組織AQP－4表達(dá)的測定

取脊髓缺血節(jié)段，以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片。每個標(biāo)本隨機選取12張切片，進行免疫組化檢測。一抗為兔抗AQP－4多克隆抗體，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察染色積分光密度（integrated optical density，IOD），取均值為該樣本脊髓的 AQP－4染色IOD。

6.統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計學(xué)處理采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.神經(jīng)運動功能評分

動物均于術(shù)后2h內(nèi)蘇醒，各組分別于脊髓缺血再灌注損傷后4h和24h按照Talov評分進行評估。與S組相比，I/R組和IPC組損傷后4h和24h Talov評分組均明顯降低（P＜0.01），與I/R組相比IPC組損傷后4h和24hTalov評分均增高（P＜0.01），見圖1。

圖1 各組脊髓缺血再灌注損傷后4h、24h神經(jīng)運動功能評分（n＝12）Fig.1 Tarlov score at 4hand 24hafter spinal ischemiareperfusion injury（±s，n＝12）＊P＜0.01vs S group，＃P＜0.01vs I/R group

2.脊髓含水量

脊髓缺血再灌注損傷后4h脊髓含水量即有明顯增加（P＜0.01），24h增加更多（P＜0.01）；與I/R組相比，IPC組損傷后4h和24h脊髓含水量均明顯減少（P＜0.05），見表1。

表1 各組脊髓缺血再灌注損傷后4h、24h脊髓組織含水量（n＝6，±s）Table1 Spinal water content at 4hand 24hafter spinal ischemia－reperfusion injury（n＝6，±s）

表1 各組脊髓缺血再灌注損傷后4h、24h脊髓組織含水量（n＝6，±s）Table1 Spinal water content at 4hand 24hafter spinal ischemia－reperfusion injury（n＝6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs S group，＃＃P＜0.01vs I/R group

S I/R IPC 4h61.84±1.52 68.95±1.84＊＊ 64.15±1.59＊＃＃24h61.65±1.13 75.12±2.47＊＊ 67.92±1.76＊＊＃＃

3.脊髓組織中AQP－4表達(dá)

AQP－4主要分布在毛細(xì)血管周圍的星型膠質(zhì)細(xì)胞膜表面及終足上，還見于軟脊膜細(xì)胞，脊髓中央管的室管膜細(xì)胞表面。脊髓損傷后4hAQP－4IOD較假手術(shù)組顯著增加（P＜0.05），24h增加更顯著（P＜0.01）；與I/R組相比，IPC組損傷后4h和24h AQP－4IOD明顯減少（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組脊髓缺血再灌注損傷后脊髓組織AQP－4表達(dá)（n＝6，±s）。（A）脊髓組織AQP－4免疫組化染色。a：S組（×100）；b：S組（×200）；c：I/R組24h（×100）；d：I/R組24h（×200）；e：IPC組24h（×100）；f：IPC組24h（×200）；g：S組全景分布（×25）。（B）AQP－4染色IOD值。Fig.2 AQP－4expression at 4hand 24hafter spinal ischemia－reperfusion injury（n＝6，±s）.（A）Representative immunostaining of AQP－4in spinal cords.a：S group（×100）；b：S group（×200）；c：I/R 24h（×100）；d：I/R 24h（×200）；e：IPC 24h（×100）；f：IPC 24h（×200）；g：distribution of overall view in S group（×25）.（B）Quantitative analysis of AQP－4IOD.

討 論

脊髓缺血再灌注損傷是去除導(dǎo)致脊髓缺血的因素后，脊髓恢復(fù)血供，但神經(jīng)功能不僅沒有改善，反而在原來缺血損傷的基礎(chǔ)上進一步加重，甚至出現(xiàn)不可逆性脊髓神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的現(xiàn)象［10］。缺血/再灌注損傷機制十分復(fù)雜，雖然有些藥物或處理措施對實驗動物有效，但能成功應(yīng)用于臨床的仍然很少。自從IPC應(yīng)用于心肌保護，很多學(xué)者致力于研究IPC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的保護作用。IPC包括早期預(yù)處理和延遲預(yù)處理兩種保護作用。早期IPC是在短暫缺血后幾分鐘至幾小時內(nèi)提高缺血耐受性，而延遲IPC則是在短暫缺血后一天或幾天發(fā)揮有益的作用。本研究發(fā)現(xiàn)IPC在脊髓缺血再灌注損傷后4h和24h抑制AQP－4表達(dá)，減輕脊髓水腫，并改善神經(jīng)功能，可能是分別通過早期保護和延遲保護的作用機制。

水通道蛋白（apuaporins，AQPs）是近十余年來發(fā)現(xiàn)的一組膜通道蛋白，廣泛存在于各種生物的細(xì)胞膜上，介導(dǎo)水分子的跨膜轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)血腦屏障對水分子、K＋的通透和神經(jīng)細(xì)胞外間隙的大小。其中，AQP－4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后血腦屏障的破壞和組織水腫的形成過程中起重要作用，而它的缺失可減輕水中毒和局部缺血所引起的水腫癥狀［11］。研究表明各種大腦損傷都導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞AQP－4mRNA的高表達(dá)，加重?fù)p傷區(qū)及其周圍部位水腫［12］，而 AQP－4表達(dá)的下調(diào)可在滲透壓梯度和靜水壓促進水進入腦實質(zhì)時降低血腦屏障對水的通透性，防止腦水腫的發(fā)生［13，14］。研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后1dAQP－4及其mRNA表達(dá)開始增加，脊髓損傷后3d達(dá)高峰，相應(yīng)的水腫形成［15］，因此推斷AQP－4表達(dá)增加可能是促使脊髓組織水腫發(fā)生的重要因素之一。但也有研究持相反的觀點，Joshi等［16］認(rèn)為脊髓損傷時血管性水腫是過多的水分可能通過受損的血脊髓屏障進入細(xì)胞外間隙，而不依賴AQP－4。本研究采取經(jīng)典的阻斷腹主動脈的方法制備脊髓缺血再灌注損傷模型，結(jié)果表明脊髓缺血再灌注損傷后AQP－4表達(dá)增加，脊髓出現(xiàn)水腫，神經(jīng)功能降低，相比之下IPC組AQP－4表達(dá)增加受到抑制，脊髓水腫減輕，神經(jīng)功能改善。其他的研究［17－19］同樣發(fā)現(xiàn)應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和嗅鞘細(xì)胞移植或中藥治療脊髓損傷也可通過抑制AQP－4表達(dá)，消除脊髓水腫，減輕脊髓繼發(fā)性損傷，從而保存殘存的脊髓組織并促進脊髓功能恢復(fù)，支持本研究的結(jié)果。

綜上所述，IPC能通過抑制脊髓損傷后AQP－4的表達(dá)，減輕脊髓損傷部位水腫、減輕脊髓缺血再灌注損傷，這可能是IPC脊髓保護的機制之一。

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