過(guò)表達(dá)apoA－I對(duì)小鼠非酒精性脂肪性肝炎作用的研究

劉 偉 馬東林 劉文文 俞 豪 王宇童

（首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，肝臟保護(hù)與再生調(diào)節(jié)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

非酒精性脂肪性肝病（non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是以無(wú)過(guò)量飲酒史病人的肝細(xì)胞發(fā) 生 脂 肪 性 變 為 病 理 特 征 的 臨 床 綜 合 癥［1，2］。NALFD的臨床癥狀主要有脂肪變性、肝小葉出現(xiàn)不同程度的炎癥、氣球樣變及纖維化，非酒精性脂肪性肝炎（non－alcoholic steatohepatitis，NASH）是其中的一種病理分型。NASH是單純性脂肪肝向肝纖維化、肝硬化進(jìn)展的重要中間環(huán)節(jié)［3］。據(jù)報(bào)道NAFLD在發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率成人約為30%，兒童約為13%。而在肥胖或糖尿病患者中發(fā)病率約為80%。大約10%的NALFD病人會(huì)發(fā)展為NASH，而這些NASH病人中約有20%在10年內(nèi)會(huì)發(fā)展成為肝硬化［4］。由此可見(jiàn)，NASH已成為目前備受重視的臨床綜合癥之一。NASH的發(fā)病機(jī)制暫不明確，目前國(guó)際上比較公認(rèn)的機(jī)制為“二次打擊學(xué)說(shuō)”。所謂的“第一次打擊”是指游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）和甘油三酯（triglyceride，TG）在肝細(xì)胞內(nèi)大量蓄積，使肝細(xì)胞發(fā)生脂肪性變，影響細(xì)胞的生理和生化功能。這種“第一次打擊”幾乎在所有代謝綜合征患者中出現(xiàn)［5］。變性的肝細(xì)胞在受到外界的刺激，例如氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子刺激等，很容易引發(fā)細(xì)胞凋亡和壞死。這些外界刺激所造成的肝細(xì)胞損傷統(tǒng)稱為“二次打擊”［6］。研究結(jié)果表明，沉積在細(xì)胞內(nèi)的FFA主要集中在線粒體、微粒體和過(guò)氧化酶體等細(xì)胞器，它們不僅作為“第一次打擊”使肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，而且在它們發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生的超氧離子及自由基會(huì)對(duì)肝細(xì)胞造成“第二次打擊”［7］。

眾所周知，膽固醇（cholesterol，Chol）和磷脂等脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程主要在肝臟完成。而在經(jīng)典的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，載脂蛋白A－1（apolipoprotein A－I，apoA－I）起到非常重要的作用。apoA－I是由243個(gè)氨基酸編碼而成的蛋白質(zhì)，在肝細(xì)胞合成，分泌到肝細(xì)胞外［8］，而 ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子 （ATP－binding cassette transporter A1，ABCA1）則負(fù)責(zé)將肝細(xì)胞內(nèi)的膽固醇和磷脂接到轉(zhuǎn)運(yùn)到乏脂的apoAI上。這些部分脂質(zhì)化的apoA－I可以在外周細(xì)胞中接收更多通過(guò)ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)的膽固醇和磷脂，形成高密度脂蛋白（HDL），并回到肝臟，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步加工代謝，最終以膽汁的方式排出體外［9］。國(guó)內(nèi)外對(duì)于apoA－I的研究主要是在動(dòng)脈粥樣硬化中。例如最近的研究表明，apoA－I的糖基化與二型糖尿病人的動(dòng)脈斑塊進(jìn)展有關(guān)［10］。但是在NASH的領(lǐng)域中，apoA－I的研究卻處于空白。越來(lái)越多的證據(jù)表明，二型糖尿病患者所伴隨高血糖和脂質(zhì)代謝失調(diào)是引發(fā)NASH的重要原因［11］；無(wú)論是一型糖尿病患者還是二型糖尿病患者，他們體內(nèi)的FFA都會(huì)增高，并且二型糖尿病患者在代謝失調(diào)的另一個(gè)危險(xiǎn)因素是HDL降低［12］。這些均提示FFA有可能直接參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，從而影響糖尿病病人血脂水平，也有可能在NASH過(guò)程中，對(duì)于FFA也起到類似的作用。所以研究FFA，apoA－I及NASH之間的關(guān)系就有著非常重大的意義。

研究apoA－I在 NASH 中的治療作用，選擇NASH動(dòng)物模型很重要。目前的動(dòng)物模型主要為三種：①基因敲除或基因突變模型；②營(yíng)養(yǎng)、藥物或毒物誘發(fā)模型；③復(fù)合模型（聯(lián)合應(yīng)用基因模型和營(yíng)養(yǎng)模型）［13］。由于很少的NASH病人是遺傳基因缺陷的先天原因造成，因此飲食引起的NASH動(dòng)物模型和人類的NASH有很大的相關(guān)性。飲食造成的NASH動(dòng)物模型也有很多，各自都有優(yōu)缺點(diǎn)：如普通高脂飼料主要的病理特征和NASH病人很相似，但是飼養(yǎng)周期長(zhǎng)［14］；蛋氨酸膽堿缺乏飲食（methionine and choline－deficient，MCD）飼養(yǎng)周期短，造模快，但是動(dòng)物往往無(wú)肥胖，高膽固醇以及胰島素抵抗等并發(fā)癥［15］。由此可見(jiàn)，MCD可作為研究NASH的良好模型。本研究旨在探索在MCD構(gòu)建的NASH小鼠模型中過(guò)量表達(dá)apoA－I對(duì)于肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積的影響。

材料和方法

1.材料

小鼠抗甘油醛－3－磷酸脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗體（上?？党缴镉邢薰荆?；小鼠抗apoA－I抗體（Cell Signaling Technology公司，美國(guó)）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Western blotting超敏化學(xué)發(fā)光液、游離脂肪酸超敏測(cè)定試劑盒、組織細(xì)胞總膽固醇酶法測(cè)定試劑盒、三酰甘油測(cè)定試劑盒（北京蒂諾奧基因技術(shù)有限公司）；對(duì)照腺病毒 （ad－Null）、apoA－I腺病毒（adapoA－I）購(gòu)于北京諾賽基因組研究中心有限公司；6－8周齡C57/BL6雄性小鼠，體重20－25g（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物部）；MCD飼料參考國(guó)外文獻(xiàn)配方［16］并由北京華阜康有限公司制作；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.模型制備及分組

20只C57/BL6雄性小鼠飼喂普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成正常飼料組對(duì)照組（control）、MCD飼料組（MCD）、MCD＋對(duì)照腺病毒組（MCD＋Null）和 MCD＋apoA－I腺病毒組（MCD＋apoAI）4組，每組5只。MCD＋Null組小鼠以1×108PU/只的劑量通過(guò)股靜脈注射ad－Null，MCD＋apoA－I以1×108PU/只的劑量通過(guò)股靜脈注射腺病毒ad－apoA－I，注射病毒24h后，飼喂 MCD飼料。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由攝食、飲水。

3.取材

兩周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，小鼠禁食水12h后，稱重；4%水合氯醛麻醉；下腔靜脈取血，分離血清。－80℃保存；肝臟稱重后部分液氮凍存，部分4%多聚甲醛固定。

4.指標(biāo)檢測(cè)

4.1 一般情況

觀察各組小鼠行為活動(dòng)、形體狀態(tài)、毛發(fā)，飲食及死亡情況，稱取體重和肝臟濕重，計(jì)算肝臟指數(shù)〔肝指數(shù)（%）＝肝臟重量（g）/體重（g）×100%〕。

4.2 肝組織病理學(xué)檢測(cè)

取小鼠肝組織制作冰凍切片，進(jìn)行油紅O染色；同時(shí)制作肝組織石蠟切片，進(jìn)行H＆E染色。在光鏡下分別觀察油紅O染色切片機(jī)H＆E染色切片，并對(duì)肝臟脂肪變性和炎癥情況進(jìn)行評(píng)估。病理學(xué)診斷采用由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院NASH臨床研究網(wǎng)絡(luò)病理委員會(huì)2005年所定的指南［17］，根據(jù)其制定的NAFLD活動(dòng)度積分（NAFLD Activity Score，NAS）進(jìn)行評(píng)估。NAS組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)對(duì)14項(xiàng)病理改變，3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了半定量評(píng)估計(jì)分：肝脂肪變（按發(fā)生脂肪變性實(shí)質(zhì)細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)，＜5%、5%－33%、33%－66%、＞66%，分別計(jì)0－3分）、小葉內(nèi)炎癥（按無(wú)病灶、＜2、2－4、＞4，分別計(jì)0－3分）、肝細(xì)胞氣球樣變（按無(wú)、少量氣球樣細(xì)胞、較多/顯著氣球樣變，分別計(jì)0－2分），其中NAS≥5分者可明確NASH的診斷，NAS＜3分則可排除NASH，兩者之間者為NASH可能。油紅O及H＆E切片使用Leica攝像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和攝片。

4.3 血清學(xué)檢測(cè)

通過(guò)下腔靜脈取血獲取血清，保存于－80℃冰箱中。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST），TG和Chol。

4.4 肝組織TG，F(xiàn)FA，Chol含量測(cè)定

精確稱取0.5mg肝組織，按照三酰甘油酶法測(cè)定試劑盒、游離脂肪酸超敏測(cè)定試劑盒以及組織總膽固醇酶法測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)中針對(duì)組織提取脂質(zhì)的方法研磨萃取脂質(zhì)，隨后按照說(shuō)明書(shū)操作，得到相應(yīng)的OD值，依標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得到組織內(nèi)三酰甘油、游離脂肪酸以及總膽固醇的濃度，結(jié)果以mmol/L表示。

5.Western blot

取0.5mg肝組織，用RIPA裂解液裂解提取總蛋白，用BCA定量法測(cè)定樣品濃度。取適量樣品進(jìn)行SDS－PAGE。樣品在濃縮膠恒壓80V電泳，進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)制120V，電泳1h。電泳后將膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，通過(guò)Bio Rad mini－ProteinⅡ電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國(guó)Bio Rad公司）進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)后PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉在室溫封閉1h，而后加入相應(yīng)稀釋的一抗，4℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次10min，稀釋后的二抗（1∶5000）室溫孵育1h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10min，于暗室內(nèi)化學(xué)發(fā)光液孵育后對(duì)X光片曝光。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件分析，組間比較采用單因素方差分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.構(gòu)建的ad－apoA－I腺病毒在肝臟中過(guò)量表達(dá)apoA－I蛋白

注射ad－Null腺病毒或ad－apoA－I腺病毒2w后提取小鼠肝組織蛋白進(jìn)行apoA－I蛋白 Western blot檢測(cè)顯示，與注射ad－Null腺病毒的小鼠肝臟組織比較，在注射ad－apoA－I腺病毒的小鼠肝臟中可apoA－I蛋白表達(dá)水平明顯增高（圖1）。

圖1 ad－apoA－I腺病毒注射對(duì)小鼠肝內(nèi)apoA－I蛋白質(zhì)水平影響的 Western blot檢測(cè).＊P＜0.05Fig.1 Western blot detection of effect of ad－apoA－I virus injection on apoA－I level in the MCD diet－mouse liver.＊P＜0.05

2.過(guò)表達(dá)apoA－I減輕由MCD飼喂所引起的小鼠體重下降及小鼠肝臟指數(shù)下降

飼養(yǎng)過(guò)程中各組小鼠均無(wú)死亡，對(duì)照組小鼠體毛整齊有光澤，體重正常，且穩(wěn)步增長(zhǎng)，活動(dòng)度正常，精神良好，進(jìn)食正常，墊料干燥。與對(duì)照組相比，MCD組及MCD＋Null組小鼠的體毛凌亂、無(wú)光澤，體重減輕，活動(dòng)減弱，精神萎靡，進(jìn)食量明顯下降，進(jìn)水量上升，墊料潮濕；而MCD＋apoA－I組小鼠體活動(dòng)度尚可，精神較好，進(jìn)食量無(wú)明顯下降，進(jìn)水量微有上升，墊料稍微潮濕。比較各組小鼠體重、肝濕重和肝臟指數(shù)可以看出，MCD組比對(duì)照組小鼠體重下降明顯，而 MCD＋apoA－I組體重明顯大于 MCD組及MCD＋Null組（圖2A）；MCD組小鼠肝濕重較對(duì)照組明顯下降，MCD＋apoA－I組肝濕重較MCD組和MCD＋Null組明顯增加（圖2B）；MCD組肝臟指數(shù)較對(duì)照組顯著下降，MCD＋apoA－I組肝臟指數(shù)較MCD組和MCD＋Null組明顯增加（圖2C）。

圖2 每組小鼠的體重、肝濕重和肝臟指數(shù)比較。A，體重；B，肝濕重；C，肝臟指數(shù)。＊P＜0.05。Fig.2 Comparision of body weight，liver wet weight and hepatic index of mice in each group.A，body weight；B，liver wet weight；C，hepatic index.＊P＜0.05.

3.過(guò)表達(dá)apoA－I改善由MCD飼喂所引起的小鼠肝臟病理學(xué)變化

H＆E染色顯示，對(duì)照組小鼠肝組織肝竇清晰可見(jiàn)，肝索排列整齊，形態(tài)結(jié)構(gòu)均正常（圖3Aa）；MCD組小鼠及MCD＋Null組肝細(xì)胞內(nèi)充滿大量大小不一的脂肪空泡，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂呈氣球樣變，多數(shù)細(xì)胞脂肪化發(fā)生，肝小葉內(nèi)多淋巴結(jié)細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3Ab和圖3Ac）；MCD＋apoA－I組小鼠肝組織部分肝細(xì)胞內(nèi)存在脂肪空泡，與MCD組比較脂肪空泡明顯減少，少部分區(qū)域出現(xiàn)肝索結(jié)構(gòu)紊亂，偶見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3Ad）。

油紅O染色顯示，對(duì)照組小鼠肝組織未見(jiàn)紅色脂滴（圖3Ae）；MCD組及MCD＋Null組小鼠肝組織可見(jiàn)大量紅色脂滴，部分融合成片，表現(xiàn)為脂滴彌漫浸潤(rùn)入肝細(xì)胞中，肝小葉內(nèi)含脂滴細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)約為45－60%（圖3Af和圖3Ag）；MCD＋apoA－I組小鼠肝組織可見(jiàn)局部散在紅色脂滴，成小顆粒狀，肝小葉內(nèi)含脂滴細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)約為0－10%（圖3Ah）。

肝組織病理評(píng)分顯示，MCD組肝組織評(píng)分較對(duì)照組顯著升高，總分＞5分，符合NASH組織學(xué)診斷，表明模型復(fù)制成功；MCD＋Null組病理評(píng)分略低于MCD組，而MCD＋apoA－I組顯著低于 MCD＋Null組（圖3B）。

圖3 過(guò)表達(dá)apoA－I對(duì)由MCD飼喂所引起的小鼠肝臟病理?yè)p害的影響。A，肝臟病理學(xué)的H＆E染色（HE）和油紅O染色（Oil Red）；a和e，對(duì)照組；b和f，MCD組；c和g，MCD＋Null組；d和h，MCD＋apoA－I組；B，病理評(píng)分分析。Fig.3 Effect of apoA－I overexpression on pathological impairment in MCD diet－mouse liver.A，H＆E and Oil Red O staining of mouse liver pathology；a and e，control group；b and f，MCD group；c and g，MCD＋Null group；d and h，MCD＋apoA－I group；B，Histogram of pathological score of liver.

4.過(guò)表達(dá)apoA－I抑制由MCD飼喂所引起的血清ALT、AST濃度升高和Chol、TG濃度降低

ALT、AST是反應(yīng)肝臟功能的重要指標(biāo)，apoAI作為一種載脂蛋白，對(duì)肝臟脂質(zhì)變化具有重要影響，于是，我們檢測(cè)了血清中的ALT、AST、TG和Chol水平。結(jié)果顯示，血清ALT和AST濃度在MCD組和 MCD＋Null組較對(duì)照組顯著上升，在MCD＋apoA－I組較對(duì)照組略有升高，但明顯低于MCD組和 MCD＋Null組（圖4A和圖4B）；血清TG和Chol濃度在MCD組和MCD＋Null組較對(duì)照組顯著降低，在 MCD＋apoA－I組較 MCD組和MCD＋Null組明顯升高（圖4C和圖4D）。

圖4 過(guò)表達(dá)apoA－I對(duì)由MCD飼喂所引起的血清ALT、AST、Chol和TG水平改變的影響。＊P＜0.05。Fig.4 Effect of apoA－I overexpression on the change of serum level of ALT，AST，Chol and TG in MCD diet－mouse.＊P＜0.05.

5.過(guò)表達(dá)apoA－I抑制由MCD飼喂所引起的肝組織TG、Chol、FFA堆積

對(duì)小鼠肝組織中脂質(zhì)存留量的檢測(cè)顯示，飼喂MCD飼料后，MCD組小鼠肝組織中的TG、Chol及FFA的含量相對(duì)于對(duì)照組均有不同程度的升高，而過(guò)表達(dá)apoA－I小鼠肝組織中的TG、Chol及FFA的含量相對(duì)于MCD＋Null組有顯著降低（圖5）。

圖5 過(guò)表達(dá)apoA－I對(duì)由MCD飼喂所引起的肝組織TG、Chol、FFA堆積的影響。＊P＜0.05。Fig.5 Effect of apoA－I overexpression on accumulation of TG，Chol and FFA in MCD diet－mouse liver.＊P＜0.05.

討 論

MCD飼料飼喂誘導(dǎo)的動(dòng)物模型是國(guó)際上公認(rèn)的研究NAFLD中炎癥及纖維化的最好的動(dòng)物模型之一［15］。MCD飼喂小鼠后，小鼠肝組織會(huì)發(fā)生進(jìn)展性脂肪性病變，并進(jìn)一步發(fā)展為纖維化，并伴有無(wú)胰島素抵抗，無(wú)肥胖，無(wú)血脂異常，血清學(xué)TG水平降低，體重下降明顯，肝重及肝指數(shù)下降［18］。本實(shí)驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)中，MCD組小鼠體重、肝重及肝指數(shù)均下降，與該模型的描述相符。H＆E染色及油紅O染色中獲得的病理評(píng)分及血清學(xué)ALT、AST水平進(jìn)一步說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了MCD飼料飼喂的小鼠NASH模型。

我們的實(shí)驗(yàn)表明，apoA－I腺病毒載體注入小鼠體內(nèi)后，可以穩(wěn)定持續(xù)地表達(dá)目的蛋白。由H＆E和油紅O結(jié)果可以看出，過(guò)表達(dá)apoA－I可以有效地抑制脂質(zhì)在肝臟中的沉積，從而減輕肝臟的病變，ALT和AST均有不同程度的降低，這證明apoA－I對(duì)小鼠肝臟功能具有一定的保護(hù)作用。apoA－I可以降低肝臟組織中TG，Chol及FFA的含量，與此同時(shí)，血清中TG與Chol的含量有所升高。由此表明，apoA－I可以通過(guò)將肝細(xì)胞內(nèi)的過(guò)量脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟，進(jìn)入血清中，從而減少肝臟內(nèi)的過(guò)量脂質(zhì)沉積，降低脂質(zhì)對(duì)肝細(xì)胞的“第一次打擊”，這也從根源上減緩了NASH的進(jìn)程，起到有效的治療作用。在肝細(xì)胞的脂質(zhì)堆積中，危害作用最大的是高濃度的FFA。長(zhǎng)期高脂飲食使FFA攝入增加、胰島素抵抗增加、肝細(xì)胞線粒體脂肪酸β氧化減少，以上因素都會(huì)造成肝臟和血清中FFA增加。FFA與NASH的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系，與疾病的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)［19，20］。而抑制FFA能夠提高肝細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，降低肝生化酶活性［19，21］。所 以 apoA－I可以通過(guò)其降低FFA濃度的作用，有效地預(yù)防和改善NASH。

綜上所述，apoA－I在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)后，可以通過(guò)將肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟，進(jìn)入血清，從而減少脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)的蓄積，減少脂質(zhì)氧化反應(yīng)原料，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終對(duì)NASH起到防治的作用。而在此過(guò)程中，apoA－I是否對(duì)于脂質(zhì)代謝中的酶（如抗氧化酶SOD、GSH－PX等）具有調(diào)節(jié)作用，仍有待進(jìn)一步研究。

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