橢球形金納米棒作為癌細(xì)胞靶向探針的研究

李愛華，高斌，賀克武，程繼新，肖衛(wèi)華

最近報道球形的金納米顆粒（gold nanorods，GNRs）對腫瘤細(xì)胞放療具有一定的增敏作用［1-3］，可以利用金納米探針靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞，聯(lián)合125I粒子的放射活性殺死腫瘤細(xì)胞，以減少125I粒子植入所需的處方劑量，同時可達到完全適形、均勻殺傷腫瘤細(xì)胞，并保護正常細(xì)胞免受放射線損傷。金納米棒聯(lián)合125I粒子組織間植入治療腫瘤，將會為臨床防治腫瘤開辟一條新的途徑。本文報道選用二氧化硅作為殼材，制備橢球形二氧化硅包覆的金納米棒（GNRs＠SiO2）。

1 材料與方法

1.1 葉酸耦聯(lián)GNRs＠SiO2的合成與表征

1.1.1 GNRs＠SiO2的制備采用誘導(dǎo)晶種生長法，按參考文獻［4］，在反應(yīng)溶液中加入一定量的GNRs晶種，在表面活性劑分子作用下，GNRs定向生長為具有一定軸比的金納米棒。取10 ml制備好的金納米棒溶液以1.2×104g離心2次，棄上清液，然后將底物超聲分散在10 ml超純水中。滴加氨水，調(diào)溶液pH值為10。然后向瓶中加入10 mmol／L正硅酸乙酯的乙醇溶液2 ml，劇烈磁力攪拌24 h。將二氧化硅包覆的金納米棒進行離心收集，先后用去離子水和無水乙醇各洗2次。最后，將制備好的納米復(fù)合材料超聲分散在無水乙醇中。

1.1.2 GNRs＠SiO2的表面氨基化在制備好的GNRs＠SiO2乙醇溶液中，加入氨基丙基三甲氧基硅烷（3-APTS）乙醇溶液后混勻，80℃恒溫磁力攪拌反應(yīng)4 h。收集溶液，先后用無水乙醇和去離子水各離心洗滌2次，每次15 min，棄上清液，將所得底物超聲分散在超純水中。

1.1.3 葉酸耦聯(lián)GNRs＠SiO2先將N-羥基丁二酰亞胺（NHS）0.1 mg、二氯乙烷（EDC）2 mg以及0.2 mg葉酸加入500μl去離子水中混勻避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)1 h，將葉酸的羧基活化后，加入制備好的GNRs＠SiO2-NH2水溶液20 ml，避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)24 h。以1×104g離心洗滌2次，每次15 min，收集溶液，棄上清液。將底物葉酸耦聯(lián)的GNRs＠SiO2（GNRs＠SiO2-FA）超聲分散在5 ml超純水中備用。

1.1.4 表征用透射電鏡觀察所制備GNRs的大小、形態(tài)和結(jié)構(gòu)；用可見紫外吸收光譜檢測二氧化硅包覆前后金納米棒光學(xué)性質(zhì)的變化以及葉酸偶聯(lián)二氧化硅包覆后的金納米棒（GNRs＠SiO2-FA）的紫外吸收圖譜。

1.2 GNRs＠SiO2-FA的生物相容性檢測

采用HepG2肝癌細(xì)胞株（購自上海細(xì)胞庫），將細(xì)胞在加有10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)至合適時間。取對數(shù)生長期細(xì)胞（長滿皿底面積約80%時），消化后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5 000個/ml，以100μl/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，加入含有不同濃度（金元素濃度為25×10-6，12.5×10-6，5×10-6，2.5×10-6，0.5×10-6）GNRs＠SiO2-FA的RPMI 1640培養(yǎng)液100μl。細(xì)胞繼續(xù)在37℃培養(yǎng)箱中孵育24、48 h后，分別加入5 mg/ml MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100μl，置于搖床上低速振蕩15 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶標(biāo)儀490 nm波長吸光度處測量各孔的吸光值。同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO），對照孔（細(xì)胞、培養(yǎng)基、MTT、DMSO），每組設(shè)5個復(fù)孔。實驗重復(fù)3次，取平均值分析。細(xì)胞存活率=（實驗組吸光強度均值/陰性對照吸光強度均值）×100%。

1.3 透射電鏡觀察GNRs＠SiO2-FA進入細(xì)胞過程

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，在37℃、5%CO2條件下，培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基吸出，用PBS緩沖液洗3次。實驗組加入RPMI 1640培養(yǎng)液9 ml和GNRs＠SiO2-FA溶液1 ml，對照組加入10 ml RPMI 1640培養(yǎng)液，培育1、4、12、24 h后終止培養(yǎng)，胰酶消化收集細(xì)胞，將細(xì)胞混懸液放入50 ml離心管離心（1 000 g）6 min，將細(xì)胞團聚物重溶于PBS液，移至2 ml Ep管中，離心（800 g）4 min，棄上清液。加入1.5 ml的2.5%戊乙醛前固定，4℃下1%鋨酸后固定2 h，乙醇-丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，透射電鏡下觀察、照椎。

1.4 熒光染料羅丹明標(biāo)記

將羅丹明異硫氰酸酯（RBITC）溶于乙醇中，加入氨基化的GNRs＠SiO2-FA溶液中，混合溶液pH值調(diào)至9.0，RBITC與GNRs＠SiO2-FA表面的氨基基團室溫下反應(yīng)，12 h后離心洗滌3次，將納米顆粒重懸于無水乙醇中，即得到羅丹明標(biāo)記的GNRs＠SiO2-FA。

1.5 激光共聚焦顯微鏡成像

將滅菌處理的蓋玻片放入6孔板中，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至5×104個孔，接種在6孔板中，37℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h，加入羅丹明標(biāo)記的GNRs＠SiO2-FA共培養(yǎng)2 h，以未加羅丹明標(biāo)記的GNRs＠SiO2-FA作為對照。移出培養(yǎng)液.用RPMI 1640培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞3次，室溫下用細(xì)胞固定液固定細(xì)胞10 min，再用PBS液沖洗。在載玻片上滴加1滴抗熒光淬滅的封片液，蓋上蓋玻片封片，用萊卡激光共聚焦顯微鏡成像（CLSM，德國，雙光子系統(tǒng)）。

2 結(jié)果

2.1 表征

通過透射電鏡表征，可觀察到制備出的二氧化硅包覆的金納米棒（GNRs＠SiO2）呈橢球形（圖1）。金納米棒呈棒狀位于中心，二氧化硅包覆于其表面。

圖1電鏡下橢球形SiO2包覆GNRs

圖2 是金納米棒和GNRs＠Si O2以及GNRs＠Si O2-FA的紫外吸收圖譜，可見金納米棒有2個特征吸收峰，分別位于516 nm和712 nm處；而包覆橢球形二氧化硅后的金納米棒（GNRs＠SiO2）的2個特征吸收峰位于516 nm和714 nm處。通過紫外吸收圖譜檢測發(fā)現(xiàn)，二氧化硅包覆金納米棒前后的特征吸收峰位置基本沒有改變，表明二氧化硅殼層對金納米棒進行表面修飾以后，光學(xué)特性沒有改變。

圖2 GNRs、GNRs＠SiO2和GNRs＠SiO2-FA的紫外吸收圖譜

同時可見，葉酸偶聯(lián)二氧化硅包覆的金納米棒（GNRs＠SiO2-FA）吸收峰除了金納米棒的特征吸收峰外，在282 nm處出現(xiàn)了1個新的吸收峰，這與葉酸的吸收峰位置一致。

2.2 二氧化硅包覆的金納米棒的生物相容性檢測

圖3是不同濃度GNRs＠SiO2-FA對HepG2細(xì)胞的毒性測定結(jié)果，可見細(xì)胞存活率均大于87%，毒性為0～1級，屬于對細(xì)胞的無毒范疇。說明在一定濃度范圍內(nèi)表面修飾的納米探針對HepG2細(xì)胞體外培養(yǎng)生物安全性較好。

圖3 不同濃度GNRs＠SiO2-FA對HepG2細(xì)胞毒性測定

2.3 細(xì)胞攝取GNRs＠SiO2-FA過程

電鏡下可見GNRs＠SiO2-FA能以納米顆粒形式通過細(xì)胞吞噬方式進入細(xì)胞。同時發(fā)現(xiàn)進入細(xì)胞后，GNRs＠SiO2-FA橢球型形狀沒有遭到破壞。細(xì)胞吞噬GNRs＠SiO2-FA的速度較快，在與細(xì)胞接觸1 h后，觀察到已有GNRs＠SiO2-FA與細(xì)胞膜接觸，細(xì)胞伸出偽足；4 h后，有更多的GNRs＠SiO2-FA與細(xì)胞膜接觸，并有膜樣結(jié)構(gòu)的吞噬泡形成，細(xì)胞質(zhì)中有少量的GNRs＠SiO2-FA；12 h后，見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量GNRs＠SiO2-FA，部分靠近細(xì)胞核邊緣，細(xì)胞核內(nèi)未見GNRs＠Si O2-FA。24 h后，有的GNRs＠Si O2-FA已與細(xì)胞核膜接觸，但GNRs＠SiO2-FA依然主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)未見GNRs＠Si O2-FA。見圖4。

圖4 GNRs＠SiO2-FA與HepG2細(xì)胞培養(yǎng)不同時間的電鏡下所見

3.4 激光共聚焦顯微鏡成像

用激光共聚焦顯微鏡熒光檢測GNRs＠SiO2-FA的細(xì)胞攝取過程，可見經(jīng)過RBITC修飾的GNRs＠SiO2-FA發(fā)射543 nm的紅色熒光，細(xì)胞照片結(jié)果表明，GNRs＠SiO2-FA可攜帶熒光探針進入細(xì)胞內(nèi)，同時發(fā)現(xiàn)GNRs＠SiO2-FA在HepG2細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布較多，而其在細(xì)胞核內(nèi)分布較少，見圖5。

圖5 GNRs＠SiO2-FA細(xì)胞攝取的激光共聚焦顯微鏡成像

3 討論

金納米棒是一種棒狀的GNR，具有獨特的光學(xué)特性，在可見光區(qū)和近紅外區(qū)，具有橫向和縱向表面等離子體共振峰（SPR）［5-6］，金納米棒還具有較好的生物適應(yīng)性，表面容易被抗體、生物素、寡核苷酸、酶等探針分子功能化［7-8］。金納米棒可吸收近紅外激光并轉(zhuǎn)化為熱能釋放到局部環(huán)境，這種光熱效應(yīng)在疾病的治療中具有重要的應(yīng)用價值。文獻報道金納米的周圍溫度在納秒范圍內(nèi)可達到1 000℃［9］。

晶種生長法是金納米棒合成最廣的一種方法。此方法需用大量表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）覆蓋在金納米棒的表面維持金納米棒的穩(wěn)定，而CTAB具有較強的生物毒性［10］。另外，由于CTAB吸附雙層分子的存在，金納米棒表面很難與其他生物分子相結(jié)合［11］，這就限制了金納米棒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，尋求一種較好的金納米棒表面化學(xué)修飾方法，將為金納米棒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用開辟更好的發(fā)展前景。

納米二氧化硅無毒性，生物相容性較好，具有優(yōu)良的透光性，對包覆后的金納米棒光吸收性能影響較?。?2-13］。葉酸在腫瘤細(xì)胞膜表面高度表達，而在絕大多數(shù)正常組織中幾乎不表達［14］，所以葉酸作為靶向配體可與葉酸受體過度表達的癌細(xì)胞結(jié)合。如何將葉酸與金納米棒結(jié)合是目前國內(nèi)外研究的熱點問題。本研究選用二氧化硅作為殼材，制備橢球形二氧化硅包覆的金納米棒（GNRs＠SiO2）。并用硅烷耦聯(lián)劑和二氧化硅耦聯(lián)，使其表面帶有大量氨基，將葉酸聯(lián)接到二氧化硅包覆的金納米棒（GNRs＠SiO2-FA），用RBITC與GNRs＠SiO2-FA表面的氨基基團反應(yīng)，得到羅丹明標(biāo)記的GNRs＠SiO2-FA。所制備的材料有良好的生物相容性，解決了傳統(tǒng)的金納米棒合成過程中因使用穩(wěn)定劑而產(chǎn)生的細(xì)胞毒性［15-16］。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)金納米棒能夠運載熒光染料進入細(xì)胞。

本文成功地制備出一種橢球形核-殼結(jié)構(gòu)二氧化硅包覆的金納米復(fù)合材料，提高了金納米棒的穩(wěn)定性和分散性，細(xì)胞安全性實驗證明，表面修飾后的金納米棒有良好的生物相容性，透射電鏡圖像觀察到金納米顆粒以細(xì)胞吞噬的方式進入細(xì)胞的過程；激光共聚焦顯微鏡圖像表明，GNRs＠SiO2-FA能攜帶熒光探針進入細(xì)胞內(nèi)，可用于負(fù)載熒光染料對細(xì)胞進行成像。GNRs＠SiO2-FA可作為熒光試劑或其他生物標(biāo)記物的載體，廣泛應(yīng)用于疾病診斷或治療，特別是能與葉酸高表達的癌細(xì)胞靶向結(jié)合，使其在腫瘤的125I粒子介入治療方面有很好的發(fā)展前景。

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