成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23蛋白原核表達(dá)及條件優(yōu)化

倪 培，劉孝菊，，騰春燕，王春娥，肖賀欣，李校堃，于 庭

(1吉林大學(xué)第二醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春1300041;2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開(kāi)發(fā)教育部工程研究中心;3溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院)

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(FGFs)被認(rèn)為是經(jīng)典的旁分泌因子，對(duì)胚胎期組織和器官的形成具有重要作用。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23(FGF23)是最近發(fā)現(xiàn)的一種新型調(diào)節(jié)血液中磷代謝的細(xì)胞因子，在丘腦腹外側(cè)核中表達(dá)［1］，佝僂病患者中此基因發(fā)生突變。Yamazaki等［2］已在CHO哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)FGF23，但哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)極其復(fù)雜且費(fèi)用昂貴，很難用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。Plotnikov等嘗試用大腸桿菌原核系統(tǒng)表達(dá)FGF23，然而，F(xiàn)GF23在大腸桿菌細(xì)胞中以包涵體的形式表達(dá)，因?yàn)榘w必須要經(jīng)過(guò)變、復(fù)性處理，這樣很難得到有生物活性的蛋白。近年來(lái)，小泛素相關(guān)修飾(SUMO)融合已成為一種有效的生物技術(shù)工具，以提高蛋白的可溶性表達(dá)和減少蛋白降解［3，4］;而且，SUMO 翻譯后能被SUMO的水解異構(gòu)肽酶從SUMO的C-末端裂解斷裂開(kāi)［3］，與目標(biāo)蛋白分離。SUMO融合策略已使 SARS 病毒［5］、MMP13［6］、表皮生長(zhǎng)因子［7］、金屬硫蛋白［8］、KGF2［9］等成功表達(dá)并純化，獲得了具有生物活性的重組蛋白。2012年6月～2013年6月本研究采用此方法成功制備了FGF23，并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 基因、菌種及試劑 PUC-FGF23質(zhì)粒購(gòu)于武漢三鷹生物科技有限公司。表達(dá)載體 pET3c、pET22b、pET3c-SUMO為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器研究中心保存。克隆菌株E．coli DH5α及表達(dá)菌株 Rosetta(DE3)、BL21(DE3)均為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器研究中心保存。Pyrobest?DNA高保真聚合酶、BamHⅠ、NdeⅠ、solutionⅠ為 TaKaRa 公司產(chǎn)品;DNA Marker/DL2000;DL15000 DNA Marker及低分子量蛋白(TaKaRa公司)。DNA凝膠回收純化試劑盒、DNA片段回收試劑盒、質(zhì)粒回收試劑盒、DNA Ligation Kit Ver．2．0均為 TaKaRa公司產(chǎn)品。氨芐青霉素(Amp)、乙二胺四乙酸二鈉、瓊脂粉為Sigma公司產(chǎn)品;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺為Bebco公司產(chǎn)品;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)為Sigma公司產(chǎn)品;酵母浸出粉、胰蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品;氯化鈣為Amresco公司產(chǎn)品;三羥甲基氨基甲烷(Tris)為Roche公司產(chǎn)品;氯化鈉為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭CR引物合成和DNA測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志公司完成。

1．2 方法

1．2．1 FGF23/SUMO-FGF23基因的擴(kuò)增 分別以PUC-FGF23及pET3c-SUMO質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)并合成5條引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。FGF23的構(gòu)建以PUC-FGF23為模板，以F/R引物對(duì)擴(kuò)增非融合的FGF23基因片段;采用PUC-FGF23為模板，以FL/R引物對(duì)擴(kuò)增融合的FGF23基因片段，以P/RL引物對(duì)擴(kuò)增SUMO片段;最后以分段擴(kuò)增中得到的融合FGF23基因片段、SUMO片段等摩爾混合為模板，以P/R引物對(duì)擴(kuò)增獲得完整SUMO-FGF23基因。PCR產(chǎn)物用1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因。PCR擴(kuò)增FGF23/SUMO-FGF23基 因 片 段，質(zhì) 粒 pET3c、pET22b用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ/EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物切膠回收后，用solutionⅠ16℃連接2 h;然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5α感受態(tài)，涂布平板，次日挑取單克隆雙酶切及測(cè)序鑒定。

1．2．2 FGF23、SUMO-FGF23的純化及鑒定 PCR

表1 FGF23及SUMO-FGF23 PCR引物

產(chǎn)物與 pET22b、pET3c連接，構(gòu)建四種重組質(zhì)粒pET22b-FGF23 、pET22b-SUMO-FGF23、pET3c-FGF 23、pET3c-SUMO-FGF23。FGF23基因最佳表達(dá)的質(zhì)粒宿主組合篩選，將構(gòu)建好并測(cè)序正確的四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)Rosetta(DE3)及BL21(DE3)細(xì)胞中，均勻涂于含Amp的 LB瓊脂平板中，37℃培養(yǎng)至OD600為0．6～0．8。挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落接種于5 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min培養(yǎng)至OD600為0．6～0．8。取2 mL接種于100 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 250 r/min培養(yǎng)至 OD600為0．6～0．8。加 IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，37℃ 250 r/min培養(yǎng)至OD600為0．6 ～0．8，分別于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后 4、5 h 收集菌液。進(jìn)行15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)，觀察表達(dá)結(jié)果。觀察目的帶誘導(dǎo)前后的變化。通過(guò)質(zhì)粒大小鑒定，重組菌落的PCR擴(kuò)增鑒定，限制性內(nèi)切酶酶切分析，以及序列分析鑒定重組質(zhì)粒。

1．2．3 目的基因的序列測(cè)定與分析 將經(jīng)PCR鑒定和酶切分析為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送至北京三博遠(yuǎn)志有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，F(xiàn)GF23成熟蛋白基因及SUMO-FGF23融合基因的大小分別為705 bp及1 018 bp。通過(guò)DNAstar軟件分析重組非融合的FGF23與Gen Bank(ID為8074)的報(bào)道完全一致;SUMO-FGF23融合基因序列也與預(yù)先設(shè)計(jì)的序列一致。兩種不同形式的重組FGF23基因都沒(méi)有閱讀框架的改變及錯(cuò)位，為下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。

1．2．4 可溶性FGF23蛋白最佳表達(dá)條件的篩選選取高表達(dá)菌株Rosetta(DE3)/pET22b-SUMOFGF23接種到含100μg/mL的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至 OD600為0．6～0．8，取100 μL細(xì)菌培養(yǎng)液接種于50 mL新鮮LB培養(yǎng)基中至OD600到0．6時(shí)，把培養(yǎng)基分成4瓶，其中一瓶作為誘導(dǎo)前取樣;2瓶分別在37℃、25℃，用0．4 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)表達(dá)4、6 h;另外1瓶繼續(xù)培養(yǎng)至OD600到1．0～1．2時(shí)，在16 ℃用 0．4 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)19 h。用同樣的方法，在1．0 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)。4℃、8 000 r/min離心30 min收集上清液及沉淀，沉淀用等體積的裂解液溶解，進(jìn)行15%SDS-PAGE檢測(cè)分析。

2 結(jié)果

2．1 SUMO、FGF23及 SUMO-FGF23基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 以P1、RL為引物，pET-3c-SUMO質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出SUMO片段;以FL、R為引物，PUCFGF23質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出與SUMO連接的FGF23片段;再以P1、R為引物，SUMO片段和FGF23片段為模板，擴(kuò)增出融合SUMO-FGF23基因片段;以P1、R為引物，PUC-FGF23質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出全長(zhǎng)的非融合的FGF23片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，SUMO片段大小為340 bp、FGF23片段大小為705 bp及SUMO-FGF23基因片段大小為1 018 bp，與預(yù)期DNA片段大小一致。

2．2 重組質(zhì)粒的篩選及鑒定結(jié)果 以NedⅠ和BamHⅠ雙酶切四種重組質(zhì)粒，得到線性質(zhì)粒片段，分別為705 bp的FGF23及1 018 bp的SUMOFGF23插入片段。PCR擴(kuò)增也得到了大小相一致的DNA片段。

2．3 重組FGF23菌株的表達(dá)篩選結(jié)果 只有pET22b-SUMO-FGF23、pET3c-SUMO-FGF23 兩種質(zhì)粒與Rosetta(DE3)宿主菌的組合在37．6 kDa附近有目標(biāo)蛋白的表達(dá)，與預(yù)想分子量大小一致;而其他組合沒(méi)有目標(biāo)蛋白的表達(dá)。

2．4 重組FGF23蛋白可溶性表達(dá)的條件篩選0．4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)濃度條件下，16℃誘導(dǎo)19 h融合蛋白可溶性表達(dá)可占全菌的35．0%，可溶性的SUMO-FGF23約占上清總蛋白量的80%(圖1)。而在相同誘導(dǎo)劑濃度下37℃與25℃融合蛋白的可溶性表達(dá)量均很低;37℃誘導(dǎo)4 h可溶性表達(dá)為全菌蛋白的2．5%;25℃誘導(dǎo)6 h可溶性表達(dá)為全菌蛋白的3．5%。16℃、1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)19 h融合蛋白可溶性表達(dá)的試驗(yàn)結(jié)果也顯示，目標(biāo)蛋白上清表達(dá)量減少，約占相同條件下0．4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的35%。

圖1 融合蛋白SUMO-FGF23的可溶性分析

3 討論

重疊延伸PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來(lái)。最初的實(shí)驗(yàn)預(yù)想是以Gene Bank登錄號(hào)BC069333的基因序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)數(shù)條引物，采用重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增FGF23的成熟蛋白基因，但由于重疊延伸PCR拼接目的基因需要多輪的PCR反應(yīng)過(guò)程，容易引起堿基的錯(cuò)配、突變等，所以本研究采用直接以PUC-FGF23的質(zhì)粒為模板，通過(guò)在其兩端設(shè)計(jì)具有酶切位點(diǎn)的引物，一步PCR即可獲得高保真的、全長(zhǎng)FGF23片段;同理我們同時(shí)以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存的pET3c-SUMO、PUC-FGF23為模板并設(shè)計(jì)SUMO-FGF23融合基因的兩對(duì)引物(正反向引物;連接引物)。通過(guò)兩步PCR法同樣獲得全長(zhǎng)SUMO-FGF23融合基因。

本研究中選用pET系統(tǒng)中具有代表性的兩種質(zhì)粒pET22b、pET3c作為表達(dá)載體。pET3c代表常規(guī)的pET系列載體;pET22b除具有pET3c質(zhì)粒的全部功能外，在緊鄰T7啟動(dòng)子的下游，比pET3c質(zhì)粒多了一個(gè)lac操縱子序列，可以編碼lac阻遏蛋白(lacⅠ)，能有效抑制目的蛋白的本底表達(dá)，因此該質(zhì)粒在克隆毒性蛋白基因時(shí)具有相當(dāng)?shù)摹皟?yōu)勢(shì)”，可以抑制外源毒性蛋白由于本底表達(dá)而使宿主自溶的現(xiàn)象，這也是本研究在篩選出 pET22b-SUMO-FGF23、pET3c-SUMOGF23兩種質(zhì)粒與Rosetta(DE3)宿主的組合均有目的蛋白表達(dá)的情況下，為什么最終選取了Rosetta(DE3)/pET22b-SUMO-FGF23菌株為后繼實(shí)驗(yàn)的工程菌株的其中一個(gè)原因，因?yàn)槿绻捎幂^強(qiáng)的T7、PL等啟動(dòng)子，外源蛋白的表達(dá)水平可達(dá)菌體總蛋白的10%～70%，重組蛋白可能大部分會(huì)以包涵體形式存在。因此，本研究采用了與表達(dá)能力相匹配的翻譯速率、強(qiáng)度較弱的lac啟動(dòng)子。

另外，在對(duì)四種質(zhì)粒 pET22b-FGF23、pET22b-SUMO-FGF23、pET3c-FGF23、pET3c-SUMO-FGF23進(jìn)行目的基因表達(dá)篩選過(guò)程中，我們可以看出目的基因只有與SUMO融合后才可以表達(dá)，這是因?yàn)镾UMO 融合表達(dá)系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)［10～12］:①SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)具有抗蛋白酶降解能力，在胞內(nèi)，蛋白酶解受到嚴(yán)密調(diào)控，外源重組蛋白的表達(dá)水平低是因?yàn)橹亟M蛋白經(jīng)常被當(dāng)成空閑蛋白被酶解。但當(dāng)外源基因與SUMO融合表達(dá)時(shí)，對(duì)酶解的敏感性降低，其原因可能是因?yàn)橹亟M蛋白胞內(nèi)區(qū)域化，也可能是由于SUMO結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有抗熱、抗蛋白降解能力;②SUMO融合表達(dá)系統(tǒng)具有提高重組蛋白表達(dá)量的能力，蛋白的表達(dá)過(guò)程非常復(fù)雜，而重組蛋白的高效表達(dá)通常與mRNA的穩(wěn)定性和拷貝數(shù)、有效的轉(zhuǎn)錄起始延伸(強(qiáng)有效的啟動(dòng)子)、翻譯的增強(qiáng)(密碼子偏好性)因素相關(guān)。SUMO與蛋白融合表達(dá)時(shí)表達(dá)量明顯增加原因可能是SUMO與蛋白融合表達(dá)后不但可以抗蛋白降解，還可以促進(jìn)蛋白折疊，這間接地提高了蛋白的表達(dá)量。

本研究同時(shí)選用Rosetta(DE3)及BL21(DE3)作為表達(dá)宿主菌，結(jié)果只有Rosetta(DE3)宿主菌有目標(biāo)蛋白的表達(dá)，原因有兩方面，一方面由于我們?cè)谶M(jìn)行目的基因克隆時(shí)，并沒(méi)進(jìn)行密碼子的優(yōu)化，直接選用了真核PUC-FGF23質(zhì)?；?yàn)槟０澹M(jìn)行了一步PCR就得到了融合基因;而RosettaTM恰恰是專用于表達(dá)大腸桿菌真核蛋白稀有密碼子的菌株。Rosetta菌株能夠由一種氯霉素抗性的，與pET相容的質(zhì)粒提供 AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和 GGA 的tRNA。所以這類菌株能夠明顯改善大腸桿菌中由于稀有密碼子造成的表達(dá)限制。這些tRNA基因有自身啟動(dòng)子。為此，本實(shí)驗(yàn)選擇的大腸桿菌缺陷型受體菌株為Rosetta(DE3);且經(jīng)過(guò)修飾后，因?yàn)樘岣吡讼∮?tRNA水平，外源重組蛋白的表達(dá)會(huì)大幅度提升。本研究對(duì)宿主菌株篩選的結(jié)果也證實(shí)了該結(jié)論。

大量的蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)模型研究資料表明，重組蛋白合成的速率降低有利于重組蛋白的可溶性表達(dá)，因?yàn)榈鞍缀铣伞⒄郫B、聚集的速率對(duì)蛋白的活性影響很大。包涵體的形成原因就是因?yàn)樾律逆湹木奂俾食^(guò)蛋白折疊的速率，從而導(dǎo)致目的蛋白大量表達(dá)。降低重組蛋白合成的速率常用方法有選擇適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、使用較低濃度的誘導(dǎo)劑及降低培養(yǎng)溫度。本研究結(jié)果顯示，重組蛋白在0．4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)濃度條件下，37℃誘導(dǎo)4 h可溶性表達(dá)為全菌蛋白的2．5%;25℃誘導(dǎo)6 h可溶性表達(dá)為全菌蛋白的3．5%;相比之下，在相同誘導(dǎo)劑濃度下，16℃誘導(dǎo)19 h融合蛋白可溶性表達(dá)可占全菌的35．0%，可溶性的SUMO-FGF23占上清總蛋白量的80%;同樣在16℃、誘導(dǎo)19 h但改變誘導(dǎo)劑IPTG濃度為1 mmol/L時(shí)，融合蛋白可溶性表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果顯示，目標(biāo)蛋白上清表達(dá)量減少，約占相同條件下0．4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的35%。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證實(shí)，降低培養(yǎng)溫度與較低濃度的誘導(dǎo)劑降低了重組蛋白合成的速率，從而提高重組蛋白的可溶性表達(dá)水平;同時(shí)，較長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)于重組蛋白的表達(dá)量提高也必不可少。

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