阮 黎,華 興,李正明
(1.廣東省廣州市紅十字會醫(yī)院,暨南大學醫(yī)學院附屬廣州紅十字會醫(yī)院泌尿外科,廣東 廣州 510220,2.廣東省廣州市紅十字會醫(yī)院病理科,廣東 廣州 510220)
VDR基因FokⅠ多態(tài)性與不同嚴重程度前列腺炎發(fā)生的關聯(lián)性分析
阮 黎1,華 興2,李正明1
(1.廣東省廣州市紅十字會醫(yī)院,暨南大學醫(yī)學院附屬廣州紅十字會醫(yī)院泌尿外科,廣東 廣州 510220,2.廣東省廣州市紅十字會醫(yī)院病理科,廣東 廣州 510220)
目的:研究維生素D受體(VDR)基因啟動子FokⅠ單核苷酸多態(tài)性(SNP)與不同嚴重程度前列腺炎(HP)的關聯(lián)性,探討遺傳學因素在HP發(fā)病中的作用。方法:選擇169例良性前列腺增生(BPH)并發(fā)HP患者,采用常規(guī)病理學檢查將患者分為輕度組79例,中度組52例,重度組38例,應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法進行FokⅠSNP檢測,分析3組患者基因型和等位基因頻數分布情況。結果:輕、中度HP患者FokⅠ位點3種基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),重度HP患者中FokⅠ位點3種基因型的分布不符合Hardy-Weinberg平衡定律(P<0.05)。FF、Ff和ff基因型在輕度和中度HP患者的分布為32%(25/79),46%(36/79);22%(18/79),23%(12/52);40%(21/52),37%(19/52);組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。F基因頻率在輕度和中度 HP患者組分別為54%(86/158)和43%(45/104),f基因頻率在2組間分別為46%(72/158)和57%(59/104),組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論:VDR基因FokⅠSNP可能與不同嚴重程度HP發(fā)生無關聯(lián)。
組織學前列腺炎;單核苷酸多態(tài)性;維生素D受體
維生素D是一種多種生物效應的激素類載體,通過維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)發(fā)揮生理作用[1]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)是一種常見的遺傳學類型。國外研究[2]發(fā)現(xiàn):基因SNP與組織學前列腺炎(histological prostatitis,HP)的發(fā)生有一定的關聯(lián)性。而VDR基因與HP的發(fā)生也有一定的關聯(lián)性[3],VDR基因啟動子上存在FokⅠ位點SNP。本文作者前期研究[4]發(fā)現(xiàn):VDR基因FokⅠ位點SNP與HP的發(fā)生有一定的關聯(lián)性,而SNP作為遺傳因素在導致不同嚴重程度非特異性炎癥的發(fā)生中有不同的作用[5]。目前尚未見VDR基因SNP與不同嚴重程度HP關聯(lián)性的報道。本研究主要分析VDR基因FokⅠ位點SNP與不同嚴重程度HP發(fā)生的關聯(lián)性,從而探討遺傳學因素在HP發(fā)病中的作用。
1.1 研究對象 收集2008年8月—2011年12月在本院泌尿外科治療的良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)并發(fā)HP患者169例,按照病理檢查結果分為輕度組79例,中度組52例,重度組38例。HP的診斷標準:以國際HP組織學分類診斷標準[6]為依據。輕度:前列腺組織中出現(xiàn)散在的炎性細胞浸潤;中度:前列腺組織中出現(xiàn)炎性細胞的聚集,但不伴有腺體上皮組織的破壞或淋巴樣小結形成;重度:前列腺組織中出現(xiàn)炎性細胞的聚集,同時伴有腺體上皮組織的破壞或淋巴樣小結形成。3組患者的年齡[(73.9±2.7)歲、(73.6±2.7)歲、(74.1±2.1)歲]差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。其中重度組與輕度組前列腺體積[(42.4±2.7)mL、(41.5±5.2)mL]和前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)的表 達 水 平 [(3.0±0.7)μg· L-1、 (2.6±0.9)μg·L-1]差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3組患者最大尿流率[(10.1±1.5)mL·s-1、(9.7±2.0)mL·s-1、(9.1±0.7)mL·s-1]差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。所有患者前列腺標本均為經尿道前列腺電切(TURP)獲得。本研究經本院倫理委員會批準,參試者均簽署知情同意書。病理檢查均經過2名病理醫(yī)師確診。
1.2 主要試劑及儀器 無水乙醇、高速離心機(Eppendorf公司,德國);PCR儀(ABI公司,美國);凝膠成像分析系統(tǒng)(Syngene公司,美國)。
1.3 DNA的提取 抽取研究對象肘靜脈血2mL,經EDTA抗凝,采用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(深圳晶美公司)提取基因組。
1.4 PCR擴增 通過GenBank檢索到VDR基因序列[gi:29745161],Genefisher設計引物:上游,5′-ACTGACTCTGGCTCTGAC-3′; 下 游, 5′-CACCTTGCTTCTTCTCCC-3′,引物合成由深圳晶美公司完成。擴增VDR包含起始密碼FokⅠ的DNA片段,預期產物片段長度為246bp。PCR反應體系:反應總體積為50μL,含2μL模板DNA,8μL上、下游引物,2μL dNTPs,0.7μL Taq DNA聚合酶和相應的緩沖液。反應條件為:預變性96℃、8min;94℃、45s,52℃、60s,72℃、30s,共40個循環(huán);72℃延伸10min。
1.5 聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCRRFLP)分析 對起始密碼多態(tài)位進行PCR擴增后,取10μL PCR產物加入限制性內切酶FokⅠ(深圳晶美公司)0.5μL和10×buffer 1μL,牛血清白蛋白1μL,DNA 7.5μL,總反應體系為20μL,37℃過夜,采用2%瓊脂糖凝膠對酶切產物行電泳分析,自動凝膠成像儀成像,檢測基因型。
1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。VDR基因型頻數分布組間比較采用χ2檢驗。
2.1 基因型的PCR-RFLP分析 目的片段產物經FokⅠ 酶切后,檢測到3種基因型:①等位基因上存在2個酶切位點的ff基因型,電泳顯示為199bp和59bp 2條帶;②無酶切位點的FF基因型,電泳顯示為246bp 1條帶;③有1個酶切位點的Ff基因型,電泳顯示為246、199和59bp 3個條帶。見圖1。
2.2 不同嚴重程度HP患者VDR基因FokⅠ位點基因型頻數分布 輕度和中度HP患者FokⅠ位點等位基因頻數分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律,說明在遺傳學上輕度和中度HP患者具有代表性;重度HP患者FokⅠ位點等位基因頻數分布不符合Hardy-Weinberg平衡定律,說明重度HP患者不具有遺傳代表性,不能納入分析。見表1。
2.3 輕度和中度HP患者中3種基因型頻數分布的差異 FF、Ff和ff基因型及等位基因F和f在輕度組與中度組之間的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示FokⅠ位點SNP與HP的嚴重程度無關聯(lián)性。見表2。
圖1 VDR基因經FokⅠ酶切后的PCR-RFLP電泳圖Fig.1 Electrophoregram of PCR-RFLP results of VDR gene digested by FokⅠ
表1 各組FokⅠ位點基因型頻數的分布Tab.1 The distribution of genotypic frequency of FokⅠsite in various groups
表2 輕度與中度HP組患者FokⅠ位點基因型和等位基因頻數分布Tab.2 The distribution of genotypic and allelic frequencies of FokⅠsite of patients in mild and moderate HP groups[n(η/%))
HP的發(fā)病原因未完全闡明,HP對BPH的影響亦不明確。目前有研究[7-8]發(fā)現(xiàn):HP與BPH以及前列腺癌的發(fā)生和進展有一定的關聯(lián)性。因此,有必要對HP的發(fā)生發(fā)展進行進一步研究。
VDR是介導1,25(OH)2D3發(fā)揮生物效應的核受體,為核受體超家族的成員之一。VDR在本質上是一種配體依賴性的核轉錄因子。目前已經發(fā)現(xiàn)的VDR基因上存在的與疾病發(fā)生有關的基因多態(tài)性位點有BsmⅠ、TaqⅠ和FokⅠ等酶切位點[9]。以往主要研究這些多態(tài)性位點與腸癌[10]、乳腺癌[11]和基底細胞癌[12]等惡性腫瘤之間的關聯(lián)性,目前研究[13-15]發(fā)現(xiàn):這些位點與特異性炎癥如結核或非特異性炎癥均有一定的關聯(lián)性,從而導致疾病的不同轉歸。
本研究采用PCR-RFLP方法檢測了VDR基因啟動子上存在的FokⅠ位點的SNP與不同嚴重程度HP發(fā)生之間的關系。雖然VDR基因啟動子上存在的FokⅠ位點SNP與BPH并發(fā)HP有關聯(lián)性,但本研究結果顯示:輕度與中度HP患者3種基因型的頻數分布差異無統(tǒng)計學意義,VDR基因啟動子上FokⅠ位點SNP可能與不同嚴重程度HP的發(fā)生無一定的關聯(lián)性,說明該位點SNP對前列腺組織中炎癥反應的影響程度無差異性。
目前關于HP的發(fā)生與VDR基因SNP的關聯(lián)性報道較少。本課題研究結果雖然顯示VDR基因啟動子上存在的FokⅠ位點SNP與輕度和中度HP的發(fā)生可能無關聯(lián)性,而且重度HP的樣本不符合Hardy-Weinberg平衡定律,但這只是初步結果,需要更大樣本量和在不同人群中進行更加廣泛的研究,并進行多位點SNP的聯(lián)合分析,確定不同SNP位點的相互干擾作用以及意義,才能得出更完善的結論。
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Association analysis between vitamin D receptor gene polymorphism and occurrence of different degrees of histological prostatitis
RUAN Li1,HUA Xing2,LI Zheng-ming1
(1.Department of Urinary Surgery,Affiliated Guangzhou Red Cross Hospital,School of Medical Science,Jinan University,Guangzhou City Red Cross Hospital of Guangdong Province,Guangzhou 510220,China;2.Department of Pathology,Guangzhou Red Cross Hospital,Guangdong Prvince,Guangzhou 510220,China)
Objective To investigate the association between single nucleotide polymorphism (SNP)of FokⅠin vitamin D receptor(VDR)gene and different degrees of histological prostatitis(HP),and to discuss the role of genetic factors in the onset of HP.Methods 169patients with benign prostatic hyperplasia(BPH)complicated with HP were selected.The mild(79cases),moderate(52cases)and severe(38cases)HP patients were distinguished by pathological examination.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was used to determine the SNP of Fok Ⅰ of patients.The distribution of genotypic and allelic frequencies of the patients in various groups was analyzed.Results The distribution of genotypic frequency of FokⅠsite in mild and moderate HP patients didn’t deviate from Hardy-Weinberg equilibrium(P>0.05).The distribution of genotypic frequency of FokⅠgene in severe HP patients deviated from Hardy-Weinberg equilibrium(P<0.05).The distribution of FF,F(xiàn)f,ff genotypes in mild and moderate HP patients were 32%(25/79),46%(36/79);22% (18/79),23% (12/52);40% (21/52),37% (19/52),respectively;there was no significant difference between two groups(P>0.05).The allelic frequencies of F and f were 54%(86/158),46%(72/158)in mild HP patients and 43% (45/104),57% (59/104)in moderate HP patients,respectively;there was no significant difference between two groups(P>0.05).Conclusion VDR gene FokⅠ SNP may not associate with the occurrence of different degrees of HP.
histological prostatitis;single nucleotide polymorphism;vitamin D receptor
R588
A
1671-587Ⅹ(2013)03-0570-04
10.7694/jldxyxb20130330
2012-10-19
國家自然科學基金面上項目資助課題 (81272849)
阮 黎 (1978-),男,湖北省荊門市人,副主任醫(yī)師,醫(yī)學博士,主要從事泌尿男科基礎和臨床研究。
阮 黎 (Tel:020-34403797,E-mail:ruanli1978@126.com)