玫煙色棒束孢與短期35℃高溫對小菜蛾3齡幼蟲的聯(lián)合作用

張 偉，呂利華，何余容*，念曉歌

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣州 510640)

小菜蛾P(guān)lutella xylostella 是世界性的十字花科蔬菜重要害蟲，隸屬鱗翅目Lepidoptera，菜蛾科Plutellidae，在熱帶和亞熱帶地區(qū)危害猖獗(劉青娥和夏更壽，2005)。目前對小菜蛾的防治仍以化學(xué)防治為主，然而長期使用廣譜性殺蟲劑，不但殺傷天敵、削弱生態(tài)系統(tǒng)的自然控制作用，而且導(dǎo)致小菜蛾產(chǎn)生抗藥性(吳敏等，2005)，應(yīng)用新型生物農(nóng)藥防治小菜蛾已成為必然的趨勢(Weinberger and Srinivasan，2009;Grzywacz et al.，2010)。

玫煙色棒束孢Isaria fumosorosea，原名玫煙色擬青霉Paecilomyces fumosorseus，是重要的蟲生真菌，能寄生同翅目、鱗翅目、雙翅目、鞘翅目和膜翅目等多種有害昆蟲。上世紀(jì)80年代后期，美國加里佛尼亞大學(xué)與W.R.Grace 公司合作研制出玫煙色棒束孢PF97 菌株制劑，用于防治Bemisia argentifolii;此后荷蘭的Bilcon和Biobest，墨西哥的Pae－sin和委內(nèi)瑞拉的Bemisin 以及美國和歐洲研制的芽生孢子與菌絲體的混合制劑PreFeRal 相繼問世(Hallsworth and Magan，1995;Hallsworth and Magan，1996)。

以往的研究表明，當(dāng)前小菜蛾的防治藥劑多數(shù)為正溫度系數(shù)藥劑，即高溫條件下，農(nóng)藥對小菜蛾的毒力或藥效會提高(李慧冬和羅萬春，2004;魏雪生等，2003;陳煥瑜等，1999;馮惠玲和黃彰欣，1997)。這些結(jié)果只反映了農(nóng)藥毒力或藥效測定時的高溫影響，有關(guān)農(nóng)藥使用前后短期高溫對農(nóng)藥毒力或藥效影響的研究尚較少。自20世紀(jì)90年代以來，不利刺激對生物的低劑量興奮(Hormesis)效應(yīng)再度受到關(guān)注。Hormesis 指各類不利刺激對生物體在高劑量時表現(xiàn)負(fù)面影響，但在低劑量時卻表現(xiàn)為有益作用的現(xiàn)象(Chapman，2001)。

溫度對玫煙色棒束孢菌絲生長、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)等都有很大影響，因而直接影響到菌株的致病力(景云飛和張仙紅，2007)。本研究試圖通過研究短期高溫與玫煙色棒束孢對小菜蛾3齡幼蟲的聯(lián)合作用，為了解短暫高溫對玫煙色棒束孢毒力的影響提供資料，進(jìn)而為完善小菜蛾生物防治策略提供依據(jù)。同時初步探討新型微生物農(nóng)藥聯(lián)合作用評價中采用的協(xié)同毒力指數(shù)(Cooperative virulence index，c.f.)應(yīng)用于Hormesis 效應(yīng)評價的可行性。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源與寄主植物

2011年10月于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗農(nóng)場的十字花科蔬菜地采集小菜蛾老熟幼蟲，在實驗室內(nèi)用芥藍(lán)Brassica albograbra Bailey 苗飼養(yǎng)至化蛹，待其羽化產(chǎn)卵后建立小菜蛾實驗室品系，作為供試蟲源。

小菜蛾的飼養(yǎng):室內(nèi)采用營養(yǎng)缽芥藍(lán)苗法飼養(yǎng)小菜蛾。在營養(yǎng)缽中加入營養(yǎng)土，將種子均勻播散在其中，并覆蓋上一薄層土壤。將苗盤放在(25±1)℃下，待種子萌發(fā)后放于室外自然光照條件下培養(yǎng)，待芥藍(lán)苗長到4 cm 左右時，將菜苗放入有小菜蛾蛹和新羽化成蟲的產(chǎn)卵籠(100 cm×50 cm×40 cm)內(nèi)。養(yǎng)蟲籠頂放有10 %蜂蜜糖水棉球，供成蟲補(bǔ)充營養(yǎng)。根據(jù)成蟲產(chǎn)卵情況更換芥藍(lán)苗，一般12 或24 h 更換一次。將更換的帶蟲卵的芥藍(lán)苗移至室內(nèi)養(yǎng)蟲架飼養(yǎng)，當(dāng)芥藍(lán)苗快被幼蟲吃光時，將幼蟲轉(zhuǎn)接到新鮮芥藍(lán)苗上。老熟幼蟲化蛹后，收集蛹作為繼代繁殖的蟲源。飼養(yǎng)條件為(25±1)℃，相對濕度65 %～75 %，光周期14L∶10D(呂利華等，2007)。

1.2 供試菌株和孢子懸浮液的配制

玫煙色棒束孢最初分離自家白蟻Coptotermes formosanus，菌株編號為SCAU－IFCF01，在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)室以甘油保存法保存于－80℃超低溫冰箱中。實驗前取出菌種，在無菌條件下接種于PDA 斜面進(jìn)行活化培養(yǎng)10 d，并保存于4℃的冰箱中。以接菌后的PDA 平板在25℃恒溫光照(14 L∶10 D)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，待菌絲長滿培養(yǎng)皿后加入20mL 0.03 %吐溫－80 無菌水，用接種針輕刮真菌的菌絲及孢子，將菌液倒入燒杯中，用磁力攪拌器攪拌30 min。待孢子完全分散后，用雙層醫(yī)用紗布過濾菌液，獲得孢子懸浮液，棄去雜質(zhì)和培養(yǎng)基殘物。用血球計數(shù)器計數(shù)母液的孢子濃度，用0.03 %吐溫－80 的無菌水配成3個供試濃度(低、中、高):1×105、1×106和1×107個孢子/mL。

1.3 試驗處理

1.3.1 高溫水平及持續(xù)時間設(shè)定

高溫處理在人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行(RXZ 智能型人工氣候箱，精度±1℃，寧波江南儀器廠)，參考McClarchie ＆ Moore高溫水平設(shè)定為35℃，持續(xù)時間為0 h、2 h、4 h、8 h。

1.3.2 玫煙色棒束孢菌液預(yù)處理后短期35℃高溫處理

選取齡期一致的3齡初小菜蛾幼蟲，浸漬于玫煙色棒束孢濃度為1×105、1×106和1×107個孢子/mL 的孢子懸浮液中10 s，然后放在干凈的濾紙上以吸去多余的水分。在直徑為11 cm 的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)放入1 張滴有少量無菌水的濾紙，上并在濾紙上放置1片干凈無蟲傷的芥藍(lán)葉片，然后將20頭經(jīng)幼蟲接在芥藍(lán)葉片上，并用扎有小孔的保鮮膜將培養(yǎng)皿封好，然后移至設(shè)定溫度下處理不同時間，將處理后的小菜蛾移至正常條件下(溫度:25±1℃，相對濕度65 %～75 %，光周期:14L:10D，下同)飼養(yǎng)，并及時更換新鮮的芥藍(lán)葉片。48 h 后統(tǒng)計試蟲死亡數(shù)，計算死亡率，每處理重復(fù)5次。

1.3.3 短期35℃高溫預(yù)處理后玫煙色棒束孢菌液處理

在直徑11 cm 的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)放入1 張滴有少量無菌水的濾紙，并在濾紙上放置1片干凈無蟲傷的芥藍(lán)葉片，然后將20頭齡期一致的3齡初小菜蛾幼蟲接在芥藍(lán)葉片上，并用扎有小孔的保鮮膜將培養(yǎng)皿封好，移至設(shè)定溫度下處理不同時間。取出后分別浸漬于玫煙色棒束孢濃度為1×105、1×106和1×107個孢子/mL 的孢子懸浮液中10 s，然后放在干凈的濾紙上將多余水分吸干。再將處理后的幼蟲放在滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)中干凈無蟲傷芥藍(lán)葉片上，皿底放有1 張滴有少量無菌水的濾紙用以保持濕度，并用扎有小孔的保鮮膜將培養(yǎng)皿封好，放至正常條件下飼養(yǎng)，及時更換新鮮的芥藍(lán)葉片。48 h 后統(tǒng)計試蟲死亡數(shù)，計算死亡率，每處理重復(fù)5次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 及Excel 2003 作為統(tǒng)計工具，用新復(fù)極差法檢驗不同處理間的差異顯著性，顯著水平設(shè)置為P=0.05。

協(xié)同毒力指數(shù)=(實際死亡率－理論死亡率)/ 理論死亡率×100。協(xié)同毒力指數(shù)≥20，為協(xié)同作用;≤－20，為拮抗作用;介于二者之間為相加作用(姚湘江，1983)。

2 結(jié)果與分析

2.1 短期35℃高溫對試蟲的影響

由表1 知:當(dāng)玫煙色棒束孢處理濃度為0 時，試蟲經(jīng)35℃高溫短期處理后，死亡率都低于10%。CK 的死亡率為2 %，但各處理間及與對照沒有明顯差異(P＞0.05)，說明短期35℃高溫處理在所設(shè)定的時間梯度下，對試蟲影響不明顯。

2.2 玫煙色棒束孢菌液與短期35℃高溫對小菜蛾的聯(lián)合作用

試蟲對玫煙色棒束孢的敏感性，表現(xiàn)在處理后試蟲死亡率與未經(jīng)處理的試蟲死亡率存在差異，其變化形式及程度與玫煙色棒束孢的孢子濃度及35℃高溫處理時間有關(guān)。

在玫煙色棒束孢孢子濃度為1×105個孢子/mL預(yù)處理條件下，隨著短期高溫處理時間的增加，試蟲的死亡率呈下降趨勢，但差異不顯著(P＞0.05);而在其濃度為1×106和1×107個孢子/mL預(yù)處理條件下，隨著短期高溫處理時間的增加，試蟲死亡率呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，但都較只經(jīng)菌液處理的試蟲死亡率低，在高溫處理4 h 時，兩種濃度處理條件下，試蟲的死亡率均分別顯著低于只經(jīng)同種菌液濃度處理后試蟲的死亡率(P＜0.05)見圖1。在三種供試菌液濃度處理條件下試蟲的死亡率均較其相同濃度預(yù)處理后再經(jīng)高溫處理的試蟲死亡率高，表明短期35℃高溫對本菌株菌液的毒力有抑制作用。

由圖2 可知，經(jīng)35℃短期高溫預(yù)處理2 h，再分別用三種不同濃度的玫煙色棒束孢菌液處理后，試蟲的死亡率都較只經(jīng)相對應(yīng)濃度的菌液處理后試蟲的死亡率低;然而在相同處理情況下，經(jīng)35℃短期高溫預(yù)處理4 h和8 h 后，試蟲的死亡率均較只經(jīng)同種濃度下玫煙色棒束孢菌液處理的試蟲死亡率高，且當(dāng)高溫預(yù)處理8 h 時，三種濃度菌液處理后試蟲的死亡率均分別顯著高于同種濃度菌液但未經(jīng)高溫預(yù)處理的試蟲的死亡率(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，短期35℃高溫預(yù)處理2 h對試蟲具有保護(hù)作用，而預(yù)處理4 h和8 h 則對試蟲表現(xiàn)出不利影響。

短期35℃高溫對玫煙色棒束孢預(yù)處理毒力的影響可以由協(xié)同毒力指數(shù)更清楚地看出(表1)，當(dāng)35℃高溫處理2 h和4 h 時，玫煙色棒束孢低、中和高濃度菌液處理試蟲后，聯(lián)合毒力均表現(xiàn)出拮抗作用，這可能是因為高溫在本菌株孢子附著于試蟲體壁以及侵染試蟲過程期間降低了其活力，從而表現(xiàn)出拮抗作用;當(dāng)35℃高溫處理8 h 時，再經(jīng)玫煙色棒束孢低濃度菌液處理試蟲后，其聯(lián)合毒力仍表現(xiàn)為拮抗作用，造成此種結(jié)果的原因同上述分析。但是對中、高濃度菌液的毒力則表現(xiàn)為相加作用，這可能是因為在中、高濃度條件下，菌液孢子數(shù)量較多，持續(xù)8 h 的短期高溫降低了部分孢子的活力，與此同時還影響了試蟲的生理生化代謝特性，為有活力的孢子侵染試蟲提供了較有利的環(huán)境，從而表現(xiàn)出相加作用。

表2 表明了玫煙色棒束孢與短期35℃高溫預(yù)處理對小菜蛾的聯(lián)合毒力作用，當(dāng)35℃高溫預(yù)處理2 h，再經(jīng)低濃度菌液處理后，其協(xié)同毒力指數(shù)小于－20，表現(xiàn)為拮抗作用，可能是因為短期的高溫刺激使試蟲產(chǎn)生抵抗外界不利侵害的能力，從而使得孢子不易侵害試蟲，對試蟲具有較好的保護(hù)作用;而中、高濃度菌液條件下，則表現(xiàn)為相加作用，可能是在中、高濃度的孢子侵害環(huán)境下，保護(hù)作用不足以抵抗孢子的侵害能力;當(dāng)35℃高溫預(yù)處理4 h 時，三種菌液濃度處理試蟲，根據(jù)聯(lián)合毒力指數(shù)所反映的結(jié)果均表現(xiàn)為相加作用，這也可能是保護(hù)作用不足以抵抗孢子的侵害能力;當(dāng)35℃高溫處理8 h 時，低、中濃度菌液對試蟲的毒力表現(xiàn)為相加作用，而高濃度菌液對試蟲的毒力則表現(xiàn)為協(xié)同作用，這可能是在8 h 高溫處理條件下，試蟲的生理生化正常的調(diào)節(jié)機(jī)制受到破壞，從而為本菌株孢子的侵害創(chuàng)造了有利的環(huán)境，使得試蟲的死亡率增加。

表1 玫煙色棒束孢預(yù)處理與短期35℃高溫的聯(lián)合作用評價Table 1 Interaction assessment between Isaria fumosorosea pretreatment and short－term heat at 35℃

表2 短期35℃高溫預(yù)處理與玫煙色棒束孢菌液的聯(lián)合作用評價Table 2 Interaction assessment between short－term heat pretreatment at 35℃and Isaria fumosorosea

(續(xù)上表)

3 結(jié)論與討論

本研究根據(jù)廣東地區(qū)夏季高溫實際情況，設(shè)定短期35℃高溫與蟲生真菌玫煙色棒束孢對小菜蛾進(jìn)行聯(lián)合作用評定。長期高溫對小菜蛾的生長發(fā)育及存活具有不利影響，但是短期的高溫處理對其生長發(fā)育及存活的影響卻不盡如此。

玫煙色棒束孢菌液預(yù)處理，再經(jīng)35℃短期高溫處理不同時間條件下，試蟲的死亡率均低于其相應(yīng)菌液處理條件下試蟲的死亡率，表明短期35℃高溫對該菌侵染試蟲，進(jìn)而發(fā)揮其毒力作用具有負(fù)面影響。有文獻(xiàn)報道，在35℃短期高溫處理0～60 min 條件下，高溫對白僵菌孢子的萌發(fā)和生長基本無影響(農(nóng)向群等，1999);在35℃短期高溫處理條件下，對球孢白僵菌的孢子萌發(fā)和生長基本無影響，當(dāng)環(huán)境溫度高于35℃，球孢白僵菌的孢子萌發(fā)和生長均受抑制(McClarchie and Moore，1994;Iskandarov et al.，2006);也有相關(guān)文獻(xiàn)報道白僵菌關(guān)于侵染的溫度上限是35℃，高溫將降低其侵染活力(張志光，1987);玫煙色棒束孢部分菌株在35℃條件下，其產(chǎn)孢量和孢子活力明顯下降(鄭武和馮明光，2007)。本文研究結(jié)果表明，35℃短期高溫處理對玫煙色棒束孢SCAU－IFCF01 菌株對小菜蛾3齡幼蟲的毒力有較明顯的降低作用。

有研究表明在8～30℃范圍內(nèi)，小菜蛾存活率大致隨著溫度的升高而增大，當(dāng)溫度超過30℃后，存活率隨著溫度的上升而減小，特別是在35℃時，存活率急劇下降，從整個世代來看，世代存活率與溫度之間呈明顯的拋物線相關(guān)，25℃時小菜蛾的世代存活率最高(但建國等，1995)，在15～30℃恒溫范圍內(nèi)初孵幼蟲－成蟲羽化時存活率最高，32.5℃時存活率急劇下降，35℃時存活率幾乎為0(Shirai，2000);當(dāng)35℃高溫預(yù)處理2 h 或4 h，對小菜蛾3齡幼蟲保護(hù)作用較強(qiáng)，能夠降低氟蟲腈毒力，但持續(xù)時間為8 h，則會提高氟蟲腈的毒力(顧曉軍等，2009);35℃高溫預(yù)處理2 h，與阿維菌素的聯(lián)合作用表現(xiàn)為相加作用，4 h 對1.13和2.25 mg/L 的阿維菌素毒力有拮抗作用，對其他的濃度毒力表現(xiàn)為相加作用，8 h 對0.28，1.13和2.25 mg/L 的阿維菌素毒力有協(xié)同作用，對其他濃度則表現(xiàn)為相加作用(田素芬等，2008)。本研究結(jié)果表明，當(dāng)35℃高溫預(yù)處理2 h時，玫煙色棒束孢菌液對小菜蛾3齡幼蟲的毒力有所下降，具有保護(hù)作用;當(dāng)高溫持續(xù)至4 h和8 h時，該菌液的毒力有所增強(qiáng)，這可能是由于持續(xù)高溫導(dǎo)致昆蟲通過生理生化調(diào)節(jié)機(jī)能，高溫使昆蟲表皮的蠟質(zhì)層瓦解，油脂融化，表皮滲透性增加，蟲體大量失水，使得該菌較易侵染，從而導(dǎo)致死亡率升高(Henry and Prange，1996;Gibbs，2002;Yoder and Denlinger，1991)。

Hormesis 效應(yīng)的影響通常較小，一般在30%～60%之間，少數(shù)達(dá)到2倍(Calabrese，2003)，研究中多采用顯著性檢驗比較數(shù)據(jù)之間的差異，然而Hormesis 效應(yīng)如此低的影響通常不能通過檢驗，這也是Hormesis 效應(yīng)及其意義至今仍受質(zhì)疑的原因。本文采用短期高溫和玫煙色棒束孢菌液不同處理順序相結(jié)合的研究思路，考察兩者前后處理條件下對小菜蛾的毒力情況，將為田間科學(xué)防治小菜蛾提供重要的理論指導(dǎo)。本研究表明，試蟲經(jīng)玫煙色棒束孢菌液預(yù)處理后，在短期高溫處理下，其對試蟲的毒力有所下降;而短期高溫預(yù)處理對于該菌株菌液對試蟲的毒力既有降低也有增強(qiáng)的作用。關(guān)于這兩種不同處理條件下，兩者對小菜蛾的聯(lián)合作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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